T-CASME 1362-2024 細胞外囊泡探針分子合成技術規(guī)范

ICS07.080CCSA40CASMETechnicalspecificationsforthesynthesisofextracellularvesicleprobemoleculesIT/CASME1362—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由維思克思生物科技（武漢）有限公司提出。本文件由中國中小商業(yè)企業(yè)協(xié)會歸口。本文件起草單位：維思克思生物科技（武漢）有限公司、致生源健康科技（武漢）有限公司、原點生物科技（武漢）有限公司、武漢固德生物醫(yī)療科技有限公司。本文件主要起草人：付洋波、雷祖超、曾思遠、宋波、李慶芳、張俊、林雷鳴。1T/CASME1362—2024細胞外囊泡探針分子合成技術規(guī)范本文件提出了細胞外囊泡探針分子合成技術的術語和定義、縮略詞、基本要求、探針合成方法、標記條件驗證、生物安全及防污染措施等方面的內容。本文件適用于細胞外囊泡探針分子的合成以及方法的驗證。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質量控制規(guī)范動物檢疫YY/T1441體外診斷醫(yī)療器械性能評估通用要求3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1細胞外囊泡extracellularvesicles一種由細胞分泌的脂質雙層囊泡，包裹著細胞內的生物活性分子，具有傳遞信息的功能。3.2探針分子probemolecule基于N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）與氨基共價鍵合激發(fā)熒光基團而標記細胞外囊泡，用于細胞外囊泡在體內體外研究中準確定位和示蹤。4縮略語下列縮略語適用于本文件?；衔?：1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indole化合物2：3-（2-carboxyethyl）-1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium化合物3:（E）-3-（2-carboxyethy5基本要求5.1探針分子設計原則5.1.1特異性探針分子應具有高度的特異性，能夠特異性結合細胞外囊泡或其他膜結構。5.1.2親和力探針分子應與細胞外囊泡具有適當?shù)挠H和力，以確保準確定位和示蹤。5.1.3穩(wěn)定性探針分子應在體內各種pH條件下保持穩(wěn)定，保持較高的熒光強度。5.1.4生物相容性2T/CASME1362—2024探針分子應具有良好的生物相容性，不會對生物體或細胞產生毒性或不良影響。5.1.5可檢測性探針分子應具備可檢測的性質，如熒光、放射性或電化學活性等，以便于檢測和定量分析。5.1.6水溶性如探針分子用于生物體液或細胞培養(yǎng)基等水性環(huán)境，應具有良好的水溶性。5.1.7化學穩(wěn)定性探針分子應在儲存和使用過程中保持化學穩(wěn)定性，避免分解或變性。5.1.8反應條件設計的探針分子應考慮反應條件的兼容性，如酸堿度、溫度等。5.1.9成本效益在滿足需求的前提下，探針分子的設計應考慮成本效益，確保其在實際應用中的可行性。5.1.10可重復性探針分子的設計應確保其在不同實驗條件下具有良好的可重復性。5.2合成路線選擇和優(yōu)化5.2.1合成路線的選擇5.2.1.1選擇的合成路線應具有可行性，包括反應條件、試劑易獲得性、操作復雜度等方面的因素。5.2.1.2優(yōu)先選擇高產率的合成路線，以提高合成效率和經(jīng)濟效益。5.2.1.3選擇具有高選擇性的合成路線，盡量減少副反應的發(fā)生，提高目標產物的純度。5.2.1.4考慮合成路線對環(huán)境的影響，盡量選擇低污染、綠色環(huán)保的合成方法。5.2.1.5應確保合成路線在操作過程中具有較高的安全性，避免使用危險試劑或涉及高風險操作。5.2.2合成路線的優(yōu)化5.2.2.1通過優(yōu)化反應溫度、時間、溶劑等反應條件，以提高反應效率、產率和選擇性。5.2.2.2選擇合適的催化劑可加速反應速率、提高選擇性，并降低反應能耗。5.2.2.3盡量簡化合成路線中的反應步驟，減少中間產物的合成和分離，提高整體合成效率。5.2.2.4選擇適當?shù)娜軇┛梢蕴岣叻磻锏娜芙庑?，促進反應進行，并便于后續(xù)的分離和純化。5.2.2.5優(yōu)化反應物的投料比，提高反應的轉化率和產率。5.2.2.6優(yōu)化后處理步驟，如提純方法、結晶條件等，提高產物的純度和收率。5.3探針合成技術綜合性能評估應按照YY/T1441進行性能評估6探針合成方法6.1探針合成流程圖探針合成流程圖如圖1所示。標引序號說明：1——1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indole2——3-（2-carboxyethyl）-1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium3——（E）-3-（2-carboxyethy3T/CASME1362—2024圖1探針合成流程圖6.2探針的合成6.2.1化合物2的合成6.2.1.1將1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚（3.13g,15.0mmoL）、3-溴丙酸（2.43g,16.0mmoL）混合于5.0mL甲苯中，氮氣保護下100℃回流3h，TLC監(jiān)測至反應完成。6.2.1.2將反應溶液逐漸冷卻至室溫后，反應液逐滴加入至乙醚（150mL）溶劑中，有大量粉末顆粒析出，經(jīng)過過濾收集粉末，用冷卻的乙醚（50mL）洗滌，得到絳紅色固體粉末即化合物2（4.11g，產率76。HRMS（ESI,m/z）Calcd.for[C18H20BrNO2-Br-],282.1489；Found,282.1613。6.2.2化合物3的合成6.2.2.1將化合物2（722.0mg,2.0mmoL）、4-二苯胺基苯甲醛（546.0mg,2.0mmol）混合于5.0mL乙醇中，氮氣保護下80℃回流9h，TLC監(jiān)測至反應完成。6.2.2.2將反應溶液逐漸冷卻至室溫后逐滴加入至乙醚（150mL）溶劑中，有大量粉末顆粒析出，過Calcd.for[C37H33BrN2O2-Br-],537.2537；Found,537.2604。7探針標記細胞外囊泡的條件驗證7.1探針標記細胞外囊泡的原理探針標記細胞外囊泡的原理如圖2所示。圖2探針標記細胞外囊泡的原理圖7.2探針標記細胞外囊泡的過程EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）活化該探針上的羧基，促使其與NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）形成含有N-羥基琥珀酰亞胺酯的中間化合物，N-羥基琥珀酰亞胺酯再不可逆地與膜上蛋白的氨基特異性共價結合形成酰胺鍵，進而激發(fā)熒光基團進行顯色反應。7.3探針標記參數(shù)測定7.3.1使用濃度約為50“M的探針與細胞外囊泡在室溫下避光染色30min。7.3.2設置無細胞外囊泡的空白對照。7.3.3將探針與空白對照在室溫避光染色30min。7.3.4通過空白對照與細胞外囊泡結合后熒光信號的增強來確認標記參數(shù)。4T/CASME1362—20247.4探針最適使用濃度的篩選7.4.1確定受試細胞（如懸浮細胞SKM1）為實驗對象。7.4.2吸取約2.0×106個受試細胞（如SKM1細胞）于15mL離心管中。7.4.3用離心機離心（參數(shù)設置為5000rpm）。7.4.42%多聚甲醛室溫固定15min。7.4.51%BSA/PBS封閉。7.4.6PBS重懸，均分到8個流式管中，分別使用終濃度0μM，1μM，2μM，5μM，10μM，50μM，100μM的探針于室溫下避光染色30min，100mM甘氨酸中和，PBS洗滌一次，100μLPBS重懸上機檢測。7.4.7與陰性對照（探針濃度為0μM）相比，使用50μM和100μM的探針標記細胞峰值偏移較大，結果應如圖3所示，確定使用濃度為10μM～100μM的探針均能對細胞進行較好的標記，10μM探針在實驗條件中就已經(jīng)能很好區(qū)分標記細胞，滿足流式檢測需求。圖3探針標記細胞的熒光峰值7.5不同pH對探針標記產物光譜性質的驗證7.5.1以受試細胞（如懸浮細胞SKM1和KG1a）為實驗對象，分別吸取約1.0×105個受試細胞（如SKM1，KG1a細胞）于15mL離心管中，2%多聚甲醛固定，均分兩份，分別使用10μM的探針和10μM的常規(guī)染料CFSE在室溫下對兩種細胞分別避光染色30min后，等量添加至含有不同pH緩沖液的全黑96孔板中，上機檢測。7.5.2與常規(guī)染料CFSE對比。新合成的探針和