動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研究進(jìn)展

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研究進(jìn)展

作者：代長云黃海軍向敏陶弼菲陳志華高其雙吳建英

摘要介紹了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的概念,綜述了動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器及其載體的發(fā)展現(xiàn)狀,以為動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器進(jìn)一步研究提供借鑒。

關(guān)鍵詞動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器;表達(dá)載體;發(fā)展現(xiàn)狀

1動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的概念

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器(Mammaryglandbioreactor)屬于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物范疇,其原理是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),將乳腺組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因,在動(dòng)物乳腺組織高效表達(dá),通過乳汁分泌到體外,該方式不會(huì)對動(dòng)物自身機(jī)體造成損害,通過回收乳汁就可以提取有重要價(jià)值的生物活性蛋白。通常情況下,這種外源蛋白的特異性表達(dá)方式更安全、可靠。

2動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)載體的發(fā)展

外源基因在動(dòng)物乳腺中高效表達(dá)有2個(gè)前提:一是選用的調(diào)控元件要能指導(dǎo)目的基因在乳腺中高效、特異性表達(dá),并且表達(dá)產(chǎn)物能分泌到乳汁中;二是整合到動(dòng)物染色體基因組中的表達(dá)載體要處于開放和活躍轉(zhuǎn)錄狀態(tài),而這2個(gè)前提都?xì)w結(jié)于表達(dá)載體的成功構(gòu)建[1]。

基于普通質(zhì)粒的表達(dá)載體

哺乳動(dòng)物的染色體是許多獨(dú)立、分散的區(qū)域組成,區(qū)域內(nèi)含有單個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄單元,包括調(diào)控基因表達(dá)的所有控制元件。乳蛋白基因以獨(dú)立區(qū)域的形式存在于染色體上。對乳蛋白區(qū)域進(jìn)行調(diào)控的一些重要控制元件可分為三類:①調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的元件,包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和激素應(yīng)答元件。乳蛋白的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子在大多數(shù)情況下位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)百個(gè)堿基處的5’側(cè)翼區(qū),有時(shí)可遠(yuǎn)至10kb。乳蛋白激素應(yīng)答區(qū)的表達(dá)受催乳素、胰島素、糖皮質(zhì)激素及細(xì)胞間質(zhì)的誘導(dǎo)。②具有使染色體變構(gòu)和開放功能的元件,有位點(diǎn)控制區(qū)和核基質(zhì)黏附區(qū),主要用于對抗位點(diǎn)效應(yīng)。位點(diǎn)控制區(qū)位于5’遠(yuǎn)端,是大區(qū)域的DNaseI高敏區(qū)。位點(diǎn)控制區(qū)包括多個(gè)DNaseI高敏區(qū),各個(gè)高敏區(qū)與其反式因子結(jié)合成一個(gè)單元,然后對啟動(dòng)子復(fù)合物起作用。因此,一般認(rèn)為位點(diǎn)控制區(qū)具有增強(qiáng)子和絕緣子的雙重功效[2]。核基質(zhì)黏附區(qū)也起到絕緣子的作用,并且還具有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)活性,多數(shù)位于區(qū)域的兩端,可以把區(qū)域拴在核基質(zhì)上。③與轉(zhuǎn)錄后翻譯有關(guān)的元件,主要包括5’和3’非翻譯區(qū)及PolyA位點(diǎn)。它們主要影響mRNA的加工過程、翻譯效率和穩(wěn)定性[1]。這種載體使用的一般是cDNA,因而有可能丟失一些增強(qiáng)表達(dá)的元件,轉(zhuǎn)錄后的mRNA也不穩(wěn)定。另外,這種載體的容量較小,不可能包含整個(gè)乳蛋白基因座,往往不含位點(diǎn)控制區(qū)和核基質(zhì)黏附區(qū)等序列,因而易受整合位點(diǎn)鄰近基因簇序列的影響,出現(xiàn)表達(dá)沉默或異位表達(dá)的情況,即“位點(diǎn)效應(yīng)”。

用普通質(zhì)粒的表達(dá)載體制備乳腺生物反應(yīng)器的研究中,外源蛋白高水平表達(dá)的報(bào)道較少,絕大多數(shù)研究中只能達(dá)到微克級(jí)甚至納克級(jí)。但是,于其操作技術(shù)成熟,成本較低,仍被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的研究。

基于酵母人工染色體的表達(dá)載體

為了保持表達(dá)調(diào)控序列的天然狀態(tài),最好將包含所有調(diào)控序列的乳蛋白基因座組裝到一個(gè)載體中,這樣就可以克服位點(diǎn)效應(yīng)的影響,實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)獨(dú)立性表達(dá),這就需要大容量的載體,如酵母人工染色體(Yeastartificialchromosome,YAC)。YAC著絲粒、端粒和復(fù)制原點(diǎn)三大要素構(gòu)成,第1個(gè)YAC于1983年創(chuàng)建[3]。利用YAC制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器一般有2種方法:ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染法和顯微注射法。前者是用脂質(zhì)體將YAC轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞,利用YAC左臂上的neo標(biāo)記基因來篩選整合YAC的ES細(xì)胞,再經(jīng)胚胎注射形成嵌合體。其缺點(diǎn)是難以得到完整YAC插入的動(dòng)物,如Jakobovits等[4]所制備的YAC轉(zhuǎn)基因小鼠必須通過選種選配,將2個(gè)半合子轉(zhuǎn)基因小鼠成功交配,才能得到純合子轉(zhuǎn)基因小鼠;后者是將YAC注入受精卵的原核,該方法可以得到Y(jié)AC完整插入的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,但顯微注射操作比較困難,容易對YAC造成損傷[5]。雖然2種方法均可以生產(chǎn)YAC轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,但是如何純化完整的YAC,制備攜帶完整YAC的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,仍然是一個(gè)亟待解決的難題。

基于同源重組的定點(diǎn)打靶載體

除同源重組技術(shù)外,無論采用何種技術(shù)導(dǎo)入外源基因,外源基因均是隨機(jī)插入受體細(xì)胞基因組的任何位置。利用同源重組原理的基因打靶技術(shù)的出現(xiàn),能夠?qū)⒛康幕蚨ㄎ徽嫌谌榈鞍?或其他合適的)基因座,充分利用天然乳蛋白固有的高效表達(dá)調(diào)控機(jī)制,克服拷貝數(shù)依賴性和隨機(jī)整合的“位點(diǎn)效應(yīng)”,保證目的基因在乳腺中的特異性表達(dá),并可能取得與乳蛋白同步的表達(dá)水平。如將攜帶啟動(dòng)子的外源基因敲入一些開放的活躍轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)中(如HPRT位點(diǎn))可以克服“位點(diǎn)效應(yīng)”的影響[6]。

乳腺生物反應(yīng)器的基本原理是用乳蛋白基因啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)指導(dǎo)外源基因在乳腺中特異性表達(dá)。常用的乳蛋白有乳清酸性蛋白(WheyAcidicProtein,WAP)、α-乳蛋白、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)、β-酪蛋白和αsl-酪蛋白等。其中,BLG是牛、羊等反芻動(dòng)物乳汁中含量最高的乳清蛋白,說明驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的啟動(dòng)子效率較高。在目前有關(guān)乳腺生物反應(yīng)器的研究報(bào)道中,以BLG基因調(diào)控序列指導(dǎo)人α-1-抗胰蛋白酶基因在綿羊乳腺中的表達(dá)水平最高,達(dá)到35g/L。此外,BLG基因調(diào)控區(qū)相對較短,大部分乳腺特異性表達(dá)調(diào)控元件位于-406bp范圍內(nèi)[7],易于進(jìn)行分子克隆。因此,BLG基因調(diào)控序列是構(gòu)建反芻動(dòng)物乳腺特異表達(dá)載體的首選調(diào)控序列。

3動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的發(fā)展現(xiàn)狀

全球已經(jīng)有幾十家大公司在進(jìn)行動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。其中英國的PPL公司、荷蘭的Pharming以及美國最大的生物技術(shù)公司GenzymeTransgenicsCorporation是3個(gè)最為出色的公司。他們在藥物開發(fā)、市場和產(chǎn)業(yè)化方面投入大量資金。到目前為止,已有2種藥物完成臨床試驗(yàn)(其中重組人抗凝血酶Ⅲ(ATryn?)已于2006年批準(zhǔn)上市),5種進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn),37種進(jìn)入Ⅱ期臨床研究階段?，F(xiàn)在,許多國家正在進(jìn)行相應(yīng)的工作,如美國、英國、俄羅斯、瑞典、荷蘭、澳大利亞、加拿大、法國等。在國內(nèi),早在1983年,施履吉院士就提出利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的構(gòu)想。與國外相比,中國在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研究方面比較落后。但是,國家“863”計(jì)劃已經(jīng)將乳腺生物反應(yīng)器的研究作為重大項(xiàng)目進(jìn)行資助,將使中國轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究和開發(fā)進(jìn)入一個(gè)蓬勃發(fā)展的新時(shí)期,目前已經(jīng)取得一些重要成果[8-10]。

盡管動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究和發(fā)展很快,但仍面臨一些問題,諸如生產(chǎn)周期長、基因整合效率不高等。此外,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物死亡率較高,常出現(xiàn)不育導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因動(dòng)物續(xù)代難,從而無法大規(guī)模生產(chǎn)?？v觀全球,外源基因能夠在大動(dòng)物乳汁中高效表達(dá)的成功實(shí)例很少,真正達(dá)到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的更是屈指可數(shù)。

動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器研究的現(xiàn)狀,特別是奶用家畜乳腺生物反應(yīng)器的研究現(xiàn)狀,可以用“難度大、效率低、時(shí)間長和費(fèi)用高”來形容。其中,生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率低和外源基因表達(dá)受“位置效應(yīng)”的瓶頸影響最為嚴(yán)重,是構(gòu)建動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器必須克服的最大難題?？寺〖夹g(shù)可以將體外培養(yǎng)的、基因定點(diǎn)修飾后的動(dòng)物體細(xì)胞(或者干細(xì)胞)轉(zhuǎn)變成動(dòng)物個(gè)體,從而可以很好地解決動(dòng)物轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率低的問題。因此,采用以體細(xì)胞克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞技術(shù)為核心的各種技術(shù)平臺(tái),可能是未來生產(chǎn)動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器動(dòng)物的希望和必然趨勢。目前,在這方面已有成功的報(bào)道[10,11]。21世紀(jì),轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞技術(shù)和動(dòng)物克隆技術(shù)的有機(jī)結(jié)合,必將實(shí)現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新和技術(shù)突破。乳腺生物反應(yīng)器的產(chǎn)品將大量進(jìn)入市場,為人類的生存與健康發(fā)展作出貢獻(xiàn)。

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[4]JAKOBOVITSA,MOOREAL,GREENLL,ettransmi-ssionandexpressionofahuman-derivedyeastartificalchromosome[J].Nature,1993(362):255-258.

[5]STRAUSSWM,DAUSMANJ,BEARDC,etlinetransmissionofayeastartificialchromosomespanningthemurinealpha1(I)collagenlocus[J].Science,1993(259):1904-1907.

[6]GUTIERREZ-ADANA,PINTADOofflankingmatrixattachmentregionsontheexpressionofmicroinjectedtransgenesduringpreimp-lantationdevelopmentofmouseembryos[J].TransgenicRes,2000(9):81-89.

[7]WHITELAWCB,HARRISS,MCCLENAGHANM,etinde-pendentexpressionoftheovinelaetoglobulingeneintransgenicmice[J].BiochemJ,1992(286):3l-39.

[8]黃淑幀,陳美玨,黃英,等.乳汁中分泌有活性的人凝血因子Ⅸ的轉(zhuǎn)基因羊的研制[J].科學(xué)通報(bào),1998(7):112-113.

[9]吳應(yīng)積,張學(xué)明,楊東山,等.藥用蛋白質(zhì)乳腺生物反應(yīng)器的制作技術(shù)及新方法進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2009(Z1):54-59.

[10]YANGP,WANGJ,GONGG,etmammarybioreactorgeneratedbyanovelprocedureoftransgeniccloningforlarge-scaleproductionoffunctiona