木黃酮對(duì)小鼠胰島β細(xì)胞膜電位的影響-醫(yī)藥衛(wèi)生論文

1、木黃酮對(duì)小鼠胰島細(xì)胞膜電位的影響-醫(yī)藥衛(wèi)生論文        作者摘要：趙玉峰，朱運(yùn)龍，胡玉珍，周京軍，鐘延清 【 染料木黃酮Effect of genistein on membrane potentials of mouse pancreatic cells in vitro【AbstractAIM摘要: To determine the effect of longterm inactivation of protein tyrosine kinases on pancreatic cells. METHOD

2、S摘要: Primarily cultured mouse pancreatic cells were pretreated by 0.1 mmol%26#12539;L-1 genistein for 12 hours. The membrane potentials of cells were recorded by using perforated patchclamp techniques with wholecell mode. RESULTS摘要: Genistein treatment significantly decreased the resting membrane po

3、tentials of cells under the condition of both 2 mmol%26#12539;L-1 glucose and 0.2 mmol%26#12539;L-1 diazoxide, the opener of KATP channels. After stimulated by 15 mmol%26#12539;L-1 glucose, normal cells depolarized with short latent periods and provided the bursts of action potentials. In contrast,

4、mouse cells treated by genistein had significant increase in latent periods before depolarization, significant attenuation of action potentials, and significant elevation in membrane potentials at interval of action potentials. CONCLUSION摘要: Longterm treatment with genistein impairs the responses of

5、 pancreatic cells to glucose, and it is indicated that decrease in tyrosine kinases activity causes the dysfunction of pancreatic cells.【Keywords genistein; pancreatic cells; membrane potentials【摘要 目的摘要： 觀察長(zhǎng)期降低蛋白酪氨酸激酶活性對(duì)胰島細(xì)胞的影響. 方法摘要： 原代培養(yǎng)的小鼠胰島細(xì)胞被0.1 mmol%26#12539;L-1木黃酮（蛋白酪氨酸激酶抑制劑）處理12 h. 采用穿孔式全細(xì)胞記

6、錄方法記錄胰島細(xì)胞膜電位的變化. 結(jié)果摘要： 在2 mmol%26#12539;L-1葡萄糖條件下以及0.2 mmol%26#12539;L-1二氮嗪（KATP通道開放劑）的功能下，木黃酮處理組細(xì)胞的靜息電位均較對(duì)照組明顯升高. 在15 mmol%26#12539;L-1葡萄糖的刺激下，小鼠正常胰島細(xì)胞經(jīng)短暫的潛伏期后發(fā)生往極化，爆發(fā)動(dòng)作電位，而木黃酮處理組細(xì)胞的往極化潛伏期明顯延長(zhǎng)，動(dòng)作電位幅度明顯減弱，動(dòng)作電位間期的膜電位明顯抬高. 結(jié)論摘要： 木黃酮長(zhǎng)期處理可損害小鼠胰島細(xì)胞對(duì)葡萄糖的反應(yīng)，提示蛋白酪氨酸激酶活性降低可能是胰島細(xì)胞功能障礙的重要原因. 【 染料木黃酮；胰島細(xì)胞；膜電位0引

7、言葡萄糖引發(fā)胰島素分泌的過程是摘要：在胰島細(xì)胞，葡萄糖代謝產(chǎn)生的ATP封閉ATP敏感性鉀通道（KATP通道），引起細(xì)胞往極化，進(jìn)而激活電壓依靠性鈣通道，引起Ca2+內(nèi)流. 胞內(nèi)Ca2+濃度升高激發(fā)胰島素分泌1. 目前已知蛋白酪氨酸激酶在維持胰島細(xì)胞正常功能中具有重要功能2. 蛋白酪氨酸激酶抑制劑木黃酮急性處理胰島細(xì)胞可引起細(xì)胞電活動(dòng)和胰島素分泌的改變3. 但是，長(zhǎng)期降低胰島細(xì)胞中蛋白酪氨酸激酶活性對(duì)葡萄糖引起的胰島細(xì)胞電活動(dòng)的影響尚不清楚. 我們用蛋白酪氨酸激酶抑制劑木黃酮預(yù)處理原代培養(yǎng)的小鼠胰島細(xì)胞12 h后，記錄了小鼠胰島細(xì)胞在靜息狀態(tài)下以及受葡萄糖刺激后其膜電位的變化.1材料和方法1.1

8、材料雄性C57BL/6J小鼠10只，年齡1012 wk，體質(zhì)量2025 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供. 電生理實(shí)驗(yàn)所用設(shè)備為Axon公司產(chǎn)品. 木黃酮以及其他所有實(shí)驗(yàn)用試劑均購(gòu)自Sigma公司.1.2方法1.2.1小鼠胰島細(xì)胞原代培養(yǎng)C57BL/6J小鼠被脫臼正法. 沿膽總管注射型膠原酶液進(jìn)胰腺. 分離胰腺，37消化15 min. 振搖分散胰腺組織，用密度梯度離心法收集胰島. 胰島用蛋白酶消化分散為單個(gè)細(xì)胞4. 胰島細(xì)胞種植于35 mm塑料培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)液中. 液中加進(jìn)終濃度為100 mL%26#12539;L-1的胎牛血清，1×105 U%26#1253

9、9;L-1的青霉素和1×105 U%26#12539;L-1的鏈霉素. 細(xì)胞隨機(jī)分為兩大組，一組為處理組，用0.1 mmol%26#12539;L-1木黃酮處理12 h，一組為對(duì)照組. 在實(shí)驗(yàn)記錄時(shí)每組細(xì)胞又分為兩組，一組用于靜息電位記錄，一組用于觀察葡萄糖誘導(dǎo)的膜電位變化. 每組記錄細(xì)胞數(shù)為6個(gè).1.2.2電生理實(shí)驗(yàn)采用穿孔式全細(xì)胞記錄的方法記錄胰島細(xì)胞膜電位的變化. 實(shí)驗(yàn)中通過灌流系統(tǒng)給藥. 電極電阻在布滿電極內(nèi)液后為35 M. 電信號(hào)采集用Axopatch 200A放大器，數(shù)據(jù)采集用Axoscpoe8.2軟件系統(tǒng). 電極和細(xì)胞間的巨阻抗（G）封接形成后，細(xì)胞被鉗制于-70 mV

10、，補(bǔ)償電極的電容電流. 在示波器上監(jiān)測(cè)細(xì)胞穿孔進(jìn)展，串聯(lián)阻抗小于25 M被視為細(xì)胞穿孔良好，補(bǔ)償細(xì)胞的串聯(lián)阻抗和細(xì)胞電容電流，形玉成細(xì)胞鉗制狀態(tài). 膜電位記錄時(shí)，細(xì)胞被鉗制于-70 mV，待形玉成細(xì)胞狀態(tài)后，靜置細(xì)胞10 min. 然后轉(zhuǎn)變至電流鉗制狀態(tài)，開始信號(hào)采集. 細(xì)胞記錄用細(xì)胞外液成分為（mmol%26#12539;L-1）摘要: NaCl 142.0, KCl 4.7, CaCl2 2.6, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, NaHCO3 2, HEPES 5, Glucose 2 (pH=7.4). 細(xì)胞內(nèi)液的成分為（mmol%26#12539;L-1）摘要: K2SO

11、4 76, KCl 10, NaCl 10, MgCl2 1, HEPES 10, Sucrose 36 (pH 7.3). 細(xì)胞內(nèi)液中加進(jìn)終濃度為0.24 g%26#12539;L-1的兩性霉素B以在細(xì)胞膜上穿孔形玉成細(xì)胞鉗制.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理摘要：各組數(shù)據(jù)以x±s表示. 采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析對(duì)照組和處理組之間的差異，以P%26lt;0.05為有明顯性差異.2結(jié)果2.1木黃酮處理減弱小鼠胰島細(xì)胞的靜息電位在2 mmol%26#12539;L-1葡萄糖狀態(tài)下，木黃酮處理組的小鼠胰島細(xì)胞的膜電位較正常對(duì)照組明顯減小對(duì)照組（-58.9±1.35） mV vs處理組（-47

12、.5±5.18） mV, P%26lt;0.01, n=6. 在2 mmol%26#12539;L-1葡萄糖的基礎(chǔ)上加進(jìn)0.2 mmol%26#12539;L-1 二氮嗪后（Diazoxide, KATP通道開放劑），正常小鼠胰島細(xì)胞的膜電位增加到（-75.2±2.15） mV，木黃酮處理組細(xì)胞的膜電位增加到（-54.5±2.78） mV，較對(duì)照組仍然明顯減?。≒%26lt;0.01, n6, Fig 1）. 2.2木黃酮處理?yè)p害小鼠胰島細(xì)胞對(duì)葡萄糖的反應(yīng)在給予15 mmol%26#12539;L-1葡萄糖刺激后，小鼠正常胰島細(xì)胞經(jīng)過短暫的潛伏期后，其膜電位開始往

13、極化，逐漸升高，并變得不穩(wěn)定，出現(xiàn)小的波動(dòng). 往極化達(dá)到近-40 mV時(shí)，爆發(fā)出明顯的動(dòng)作電位. 動(dòng)作電位由快速往極化和快速?gòu)?fù)極化兩相組成，動(dòng)作電位往極化達(dá)0 mV左右，時(shí)程為80 ms. 動(dòng)作電位間期的膜電位維持于-40 mV左右. 動(dòng)作電位發(fā)生頻率在不同的細(xì)胞變化極大，本實(shí)驗(yàn)所記錄的正常胰島細(xì)胞的動(dòng)作電位發(fā)生的頻率在120次%26#12539;min-1到240次%26#12539;min-1之間（Fig 2A）. 木黃酮處理的胰島細(xì)胞在受到15 mmol%26#12539;L-1葡萄糖刺激后，往極化的潛伏期較正常細(xì)胞明顯延長(zhǎng). 往極化至-40 mV時(shí)，處理組細(xì)胞發(fā)生動(dòng)作電位，但其幅度較對(duì)

14、照組明顯減小. 動(dòng)作電位間期的膜電位不能維持于-40 mV左右，而是進(jìn)一步往極化達(dá)到-20 mV左右（Fig 2B）. 兩組胰島細(xì)胞在葡萄糖刺激下的膜電位變化的統(tǒng)計(jì)分析見Tab 1.圖1圖2(略)表1木黃酮處理對(duì)葡萄糖誘導(dǎo)的小鼠胰島細(xì)胞膜電位變化的影響(略)3討論KATP通道是維持胰島細(xì)胞膜電位的關(guān)鍵通道，KATP通道的多少和開放狀態(tài)決定了胰島細(xì)胞的靜息電位1. 木黃酮處理的胰島細(xì)胞的靜息電位較正常對(duì)照組明顯減小. 在用0.2 mmol%26#12539;L-1二氮嗪將KATP通道充分開放后，木黃酮處理組胰島細(xì)胞的靜息電位仍然較正常對(duì)照組明顯減小. 這說明木黃酮處理可減少小鼠胰島細(xì)胞上的KAT

15、P通道. 2型糖尿病動(dòng)物的胰島細(xì)胞上KATP通道的表達(dá)明顯減少，其原因尚不清楚5. 我們的實(shí)驗(yàn)提示，蛋白酪氨酸激酶的活性降低可能是2型糖尿病中胰島細(xì)胞上KATP通道減少的重要原因.在木黃酮處理的胰島細(xì)胞，葡萄糖刺激引起往極化的潛伏期明顯延長(zhǎng). 葡萄糖激酶活性的降低很可能是潛伏期延長(zhǎng)的原因. 葡萄糖激酶是葡萄糖代謝中的關(guān)鍵酶，其活性和表達(dá)受胰島素的調(diào)節(jié)6. 木黃酮是蛋白酪氨酸激酶的抑制劑，可阻斷胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)，從而降低葡萄糖激酶的表達(dá)7,8. 葡萄糖激酶活性降低使葡萄糖不能被正常代謝從而抑制了ATP的產(chǎn)生. 因此，細(xì)胞不能迅速封閉KATP通道和發(fā)生往極化，刺激分泌偶聯(lián)過程被延遲. 糖耐量異常以

16、及2型糖尿病患者進(jìn)食后胰島素分泌較正凡人滯后，也可能是由于酪氨酸激酶活性降低，胰島細(xì)胞的反應(yīng)潛伏期延長(zhǎng)所致.胰島細(xì)胞具有興奮性，其動(dòng)作電位的往極化由Ca2+電流所致，復(fù)極化由電壓依靠性K+電流所致9. 正常胰島細(xì)胞具有典型的動(dòng)作電位，而木黃酮處理組細(xì)胞的動(dòng)作電位幅度減小，其主要原因很可能是電壓依靠性鈣電流的減小. 復(fù)極化過程嚴(yán)重受損也是動(dòng)作電位幅度減小的一個(gè)原因. 木黃酮處理的胰島細(xì)胞在動(dòng)作電位間期的膜電位不能維持于-40 mV左右，而是逐漸升高，這說明電壓依靠性鉀電流在木黃酮處理的胰島細(xì)胞上減小. 這種變化必然減弱葡萄糖刺激的細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高和胰島素分泌的過程. 可見，木黃酮長(zhǎng)期處理可以減

17、弱小鼠胰島細(xì)胞上多種電流，并損害葡萄糖的代謝過程，從而損害小鼠胰島細(xì)胞中葡萄糖引起的刺激分泌偶聯(lián)過程. 這提示蛋白酪氨酸激酶活性降低可能是胰島細(xì)胞功能障礙的重要原因.【參考文獻(xiàn)1 Rorsman P. The pancreatic betacell as a fuel sensor摘要: an electrophysiologists viewpoint J. Diabetologia, 1997; 40(5)摘要:487-495.2 Persaud SJ, Harris TE, Burns CJ, Jones PM. Tyrosine kinases play a permissive ro

18、le in glucoseinduced insulin secretion from adult rat islets J. J Mol Endocrinol, 1999;22(1)摘要:19-28.3 Jonas JC, Plant TD, Gilon P, Detimary P, Nenquin M, Henquin JC. Multiple effects and stimulation of insulin secretion by the tyrosine kinase inhibitor genistein in normal mouse islets J. Br J Pharm

19、acol, 1995;114(4)摘要:872-880.4 Liu M, Shapiro ME. A new method for isolation of murine islets with markedly improved yields J. Transplant Proc, 1995;27(6)摘要:3208-3210.5 Stoffel M, Tokuyama Y, Trabb JB, German MS, Tsaar ML, Jan LY, Polonsky KS, Bell GI. Cloning of rat KATP2 channel and decreased expression in pancreatic islets of male Zucker diabetic fatty rats J. Biochem Biophys Res Commun, 1995;212(3)摘要:894-899.6 Postic C, Shiota M, Magnuson MA. Cellspecific roles of glucok