洋蔥內表皮細胞骨架的觀察

洋蔥內表皮細胞骨架的觀察

洋蔥內表皮細胞骨架的觀察一、實驗目的

1、掌握植物細胞骨架顯示的原理及染色方法.2、觀察光學顯微鏡下細胞骨架的網狀結構二、實驗原理

細胞骨架（cytoskeleton）是指真核細胞中的纖維蛋白所組成的網絡結構。①、細胞骨架的概念紅：微絲綠：微管微管主要成分微管蛋白微管主要分布在核周圍，呈放射狀向四周擴散電鏡下的微管1.微管蛋白（一）微管的化學組成微管蛋白

微管蛋白

微管蛋白異二聚體2個鳥嘌呤核苷酸（GTP)結合位點。可與秋水仙素、長春花堿結合。

微管蛋白

微管蛋白異二聚體聚合首位相連原纖維微管（13）微絲的形態(tài)與組分形態(tài)：是一類由蛋白纖維組成的實心纖維細絲。直徑5-7nm，長短不一。在細胞中，微絲可成束、成網或纖維狀分散分布，主要分布與細胞質膜的內側。在具有運動功能的細胞中比較發(fā)達。

微絲化學成分肌動蛋白肌動蛋白結合蛋白

中間絲

直徑介與微管與微絲之間，故得名中間絲（中間纖維IF）

8——10nm。中間纖維則分布在整個細胞中。

IF結構穩(wěn)定：既不受秋水仙素也不受細胞松弛B素影響，并且也沒有極性。二、實驗原理細胞骨架細胞生長、運動維持細胞形態(tài)分裂、分化基因表達能量轉換信息傳遞物質運輸②細胞骨架的功能微管微絲中間絲

二、實驗原理

③細胞骨架組成及分類

根據組成成分及形態(tài)結構細胞質骨架細胞骨架細胞膜骨架細胞核骨架細胞外基質細胞質骨架廣義狹義二、實驗原理

④細胞骨架觀察方法電鏡組織化學間接免疫熒光酶標觀察方法二、實驗原理

⑤試劑選用原因1TritonX-100可溶解抽提細胞中的蛋白質和脂質，但不破壞細胞骨架系統，因此顯得更清晰3M-緩沖液洗滌細胞，可以提高骨架穩(wěn)定性2戊二醛固定能較好保存骨架成分、考馬斯亮藍R250染色，使骨架蛋白著色，胞質背景著色弱，有利于骨架顯示

注意微絲微管和中間絲都是直徑很小的結構，最大的單根微管才25nm左右，只能在電鏡下觀察。本實驗用普通光鏡是因為骨架纖維成束分布，染色后有夸大作用。由于細胞經抽提后剩下的主要是細胞骨架，使之顯現更清晰。M緩沖液M緩沖液使細胞骨架中的微絲保持穩(wěn)定。在M緩沖液中，其中咪唑是緩沖劑EGTA和EDTA螯合Ca離子，溶液并提供Mg離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察。TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚)是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑）。分子量為646.86（C34H62O11）。它能溶解脂質，以增加抗體對細胞膜的通透性。非離子型表面活性劑它在水溶液中不產生離子的一種表面活性劑。它在水中的溶解是由于它具有對水親和力很強的官能團。表面活性劑表面活性劑分子結構具有兩親性：一端為親水基團，另一端為疏水基團。溶解于水中以后，表面活性劑能降低水的表面張力，并提高有機化合物的可溶性?？捡R斯亮藍G-250考馬斯亮藍有G-250和R-250兩種。其中考馬斯亮藍G-250由于與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。3%-戊二醛作為一種有機交聯劑戊二醛在一定條件下能將單體、線型高分子或預聚物轉變成三維網狀結構的物質。戊二醛在1%濃度時，交聯度已達到很高的程度，在此濃度以下，隨濃度下降，交聯度下降，溶脹度和降解率增加。濃度超過1%時，各指標無明顯變化。交聯劑是一種能在線型分子間起架橋作用，從而使多個線型分子相互鍵合交聯成網狀結構的物質。促進或調節(jié)聚合物分子鏈間共價鍵或離子鍵形成的物質。三、實驗用品1、材料2、器材3、試劑洋蔥鱗莖顯微鏡、小燒杯、滴管、載玻片、蓋玻片、鑷子⑴M-緩沖液⑵6mmol/L磷酸緩沖液⑶1%TritonX-100⑷0.2%考馬斯亮藍R250⑸3%戊二醛②3.0%戊二醛：用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液配制

③0.2％考馬斯亮藍R250：甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸餾水46.5ml三、實驗用品

4、試劑配制①1%TritonX-100：一般配成30%儲備液，通常TritonX-100與M-緩沖液以所需比例混合置于30-40℃水浴2-3小時，以便液體充分混勻。使用時將30%儲備液臨時稀釋成1%。

③M-緩沖液四、實驗方法1、撕取2、抽提3、沖洗4、固定吸去緩沖液，用1%TritonX-100處理洋蔥表皮25min。3％戊二醛固定30min撕取洋蔥鱗莖內表皮細胞約1cm2大小若干片，置于磷酸緩沖液的培養(yǎng)皿中，使其下沉，（1~2min)吸去TritonX—l00，用M一緩沖液洗3次，每次5分鐘四、實驗方法5、沖洗6、染色7、制片8、觀察PH6.8磷酸