液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 第7部分：羊肚菌（征求意見稿）

DBXX/XXXX—XXXX液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程第7部分：羊肚菌(征求意見稿)XXXX-XX-XX發(fā)布遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口管理。本文件起草單位：鐵嶺縣茂森食用菌培育中心遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院食用菌研究所撫順市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊遼東學(xué)院本文件主要起草人：代勇李娟高靜趙哲李來晶解桂華陳靜郭龍祥李躍史明文羅秋曼代巖本文件發(fā)布實施后，任何單位和個人如有問題和意見建議，均可以通過來電和來函等方式進行反饋，我們將及時答復(fù)并認真處理，根據(jù)實際情況依法進行評估及復(fù)審。歸口管理部門通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳（沈陽市和平區(qū)太原北街2號聯(lián)系電話文件起草單位通訊地址：鐵嶺縣茂森食用菌培育中心（鐵嶺市鐵嶺縣熊官屯鎮(zhèn)上峪村聯(lián)系電話前言 II 12規(guī)范性引用文件 23術(shù)語和定義 34生產(chǎn)基本要求 45生產(chǎn)技術(shù) 56液體菌種質(zhì)量標準 67貯藏 78記錄與存檔 85生產(chǎn)技術(shù)液體菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程第7部分：羊肚菌本標準規(guī)定了羊肚菌液體菌種生產(chǎn)基本要求、生產(chǎn)技術(shù)、工藝流程、液體菌種質(zhì)量指標、貯藏、記錄及生產(chǎn)檔案等技術(shù)要求。本標準適用于羊肚菌液體菌種生產(chǎn)。2.規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB150.1壓力容器第1部分：通用要求GB4789.28食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求GB5749食品安全國家標準生活飲用水衛(wèi)生標準GB50073潔凈廠房設(shè)計規(guī)范GB/T12728食品安全國家標準食用菌術(shù)語NY/T528食品安全國家標準食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程NY/T1846食用菌菌種檢驗規(guī)程NY/T1731食品安全國家標準食用菌菌種良好作業(yè)規(guī)范3.術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4.生產(chǎn)基本要求4.1工作人員具有食用菌菌種生產(chǎn)能力的專業(yè)技術(shù)人員和檢驗人員。4.2場地生產(chǎn)場所應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。環(huán)境衛(wèi)生應(yīng)符合NY/T1731的規(guī)定。4.3廠房廠房設(shè)計應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。4.4生產(chǎn)設(shè)施與設(shè)備要求設(shè)備與設(shè)施應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。液體種發(fā)酵罐質(zhì)量應(yīng)符合GB150.1的規(guī)定。4.5培養(yǎng)原料培養(yǎng)基原料應(yīng)符合NY/T528的規(guī)定。生產(chǎn)用水標準應(yīng)符合GB5749要求。4.6生產(chǎn)品種選用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強、商品性好的羊肚菌品種，從具相應(yīng)資質(zhì)的供種單位引種或本單位選育，并清楚地追溯菌種來源。菌種生產(chǎn)過程應(yīng)符合NY/T528的要求。5.1工藝流程圖1羊肚菌液體菌種工藝流程5.2母種制備5.2.1培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨4g/L,磷酸二氫鉀3g/L，硫酸鎂1.5g/L，瓊脂20g/L，pH自然。5.2.2母種活化母種活化操作流程應(yīng)符合NY/T528要求。將保存的初始菌種切割成直徑4～6mm的菌絲塊，接種到培養(yǎng)基中，18～20℃避光恒溫培養(yǎng)4～6d，菌絲長滿試管或者培養(yǎng)皿檢驗合格即可使用。5.2.3母種質(zhì)量檢查培養(yǎng)期間每天檢查菌體生長情況，及時淘汰染菌或劣勢菌種。菌絲長滿管后按照NY/T1846規(guī)程進行檢驗，合格菌種進入生產(chǎn)流程。5.3搖瓶液體菌種制備5.3.1容器使用無色專用玻璃菌種甁，可用棉塞、硅膠塞、專用封口透氣膜封口。5.3.2培養(yǎng)基配方馬鈴薯200g/L,葡萄糖20g/L,蛋白胨4g/L,磷酸二氫鉀3g/L,硫酸鎂1.5g/L,pH5.3.3培養(yǎng)基配制按液體培養(yǎng)基配方配制，混合均勻，裝入搖瓶中，裝液量為搖甁容量的50～60%，加入0.01%消泡劑，搖瓶中放置磁力攪拌棒，封口。5.3.4滅菌將分裝好的搖瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi)進行滅菌，滅菌蒸汽壓力升至0.11～0.13MPa，恒壓維持25～30min。5.3.5接種待培養(yǎng)基冷卻至25℃以下，在無菌條件下，用打孔器打孔（5mm孔徑）或接種鉤取（5mm×5mm）的4塊活化母種塊迅速轉(zhuǎn)接于搖甁培養(yǎng)基內(nèi)，封口。5.3.6培養(yǎng)搖瓶接種后移至恒溫搖床中，培養(yǎng)溫度18～20℃,轉(zhuǎn)速150r/min，避光培養(yǎng)4～6d。5.3.7搖瓶液體菌種質(zhì)量要求菌液澄清透明，菌絲體分布均勻，無異味；鏡檢無雜菌、菌絲形態(tài)正常。5.4發(fā)酵罐液體菌種制備5.4.1發(fā)酵罐空消發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長期放置及更換品種時，應(yīng)進行空消滅菌。蒸氣壓力0.11~0.14MPa、恒壓維持40min。5.4.2培養(yǎng)基配方宜選用以下配方，且培養(yǎng)基質(zhì)應(yīng)符合NY/T528要求。馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨4g/L，磷酸二氫鉀3g/L，硫酸鎂1.5g/L,pH5.4.3投料與定容將原料、水按比例攪拌均勻，加入罐內(nèi)，裝液量為罐體容量的70～80%，加入0.01%消泡劑，擰緊上料口蓋。5.4.4發(fā)酵罐實消液體種發(fā)酵罐內(nèi)蒸汽壓力控制在0.11～0.12MPa，恒壓維持60～90min。5.4.5冷卻滅菌結(jié)束，關(guān)閉空氣過濾器滅菌閥與排氣閥，緩慢打開夾套排氣閥降壓至0MPa，通入冷水降溫；同時緩慢打開發(fā)酵罐罐內(nèi)排氣閥降壓，待壓力接近0.02～0.04MPa時向罐內(nèi)通入無菌空氣，調(diào)整排氣閥，維持罐壓0.04～0.05MPa，培養(yǎng)液溫度降至25℃以下時，關(guān)閉夾套進水閥。5.4.6接種將搖瓶接種管和發(fā)酵罐接種口用75%酒精消毒，用95%酒精的火焰圈套在接種口上，輕微打開閥門，使發(fā)酵罐罐內(nèi)壓力為0.01MPa。點燃火焰圈，在火焰保護下用鑷子去掉瓶塞，打開接種口閥門，將搖瓶菌種注入發(fā)酵罐。接種量為0.5～1.0%。接種后迅速關(guān)閉接種閥門，去掉火焰圈，繼續(xù)通入無菌空氣。5.4.7發(fā)酵培養(yǎng)根據(jù)菌絲生長情況，適時調(diào)節(jié)進氣閥門，通入適量無菌空氣，通氣量一般為1：0.8V/V?min～1：1V/V?min，同時調(diào)節(jié)排氣閥，維持罐壓0.01～0.02MPa，培養(yǎng)溫度控制在20～22℃,培養(yǎng)4～6d。5.4.8檢測發(fā)酵后第4d開始定期檢測，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長狀況以及有無雜菌污染。6液體菌種質(zhì)量標準6.1感官要求應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1羊肚菌液體菌種感官要求項目感官指標菌液色澤菌液澄清，呈淡黃色，菌絲球呈白色菌液形態(tài)菌液粘稠不分層，菌絲體分布均勻。菌液氣味有羊肚菌液體培養(yǎng)時特有的香氣，無異味，搖瓶氣味正常，發(fā)酵罐排氣口氣味正常6.2理化指標應(yīng)符合表2的規(guī)定。表2羊肚菌液體菌種理化指標項目理化指標pH值4.5～5.5菌絲濕重（mg/mL）菌絲球直徑（cm）<0.45顯微鏡下菌絲形態(tài)菌絲著色深，均勻、粗壯、分支呈樹枝狀雜菌鑒別無霉菌、酵母和細菌菌體6.3液體菌種檢測6.3.1形態(tài)學(xué)觀察通過肉眼觀察菌絲球形態(tài)，通過顯微鏡觀察菌絲體形態(tài)。6.3.2霉菌檢驗按照無菌操作從取樣閥取少量培養(yǎng)液，接種于GB4789.28中規(guī)定的PDA培養(yǎng)基中，25~30℃恒溫培養(yǎng)48～72h，采用顯微鏡和感官觀察菌絲生長狀況和有無霉菌污染，必要時進行水封片鏡檢。6.3.3細菌檢驗按照無菌操作從取樣閥取少量培養(yǎng)液，接種于GB4789.28中規(guī)定的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，30～35℃恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察是否有細菌污染,必要時進行鏡檢和劃線培養(yǎng)檢驗。6.3.4pH測定用pH計測定菌液酸堿度。6.3.5菌絲濕重測定稱取一定體積的培養(yǎng)液，經(jīng)10000r/min離心5min，稱重。6.3.6菌絲球直徑隨機吸取1mL培養(yǎng)液，將其中的菌絲球排列成直線，查出菌球數(shù)量，用刻度尺測其總長度，計算每個菌絲球的平均直徑。7.1標簽生產(chǎn)的菌種必須貼有質(zhì)量合格標簽，其內(nèi)容包含菌種種類、級別、品種、生產(chǎn)單位、接種7.2貯存條件7.2.1母種保存母種在0～4℃條件下貯存，貯存期不超過60d。7.2.2搖瓶菌種保存搖瓶菌種如不能立即使用，需降溫保存。4℃