《化妝品常用植物提取物中16種香豆素類化合物的測(cè)定 液質(zhì)聯(lián)用法》

ICS71.100.70

CCSY42

T/FSBMEA

佛山市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/FSBMEAXXXX—XXXX

化妝品常用植物提取物中16種香豆素類

化合物的測(cè)定液質(zhì)聯(lián)用法

SimultaneousDeterminationof16CoumarinCompoundsin

CosmeticsPlantExtractRawMaterialsbyUltra

PerformanceLiquidChromatography-MassSpectrometry

（征求意見稿）

在提交反饋意見時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

佛山市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)發(fā)布

T/FSBMEAXXXX—XXXX

化妝品常用植物提取物中16種香豆素類

化合物的測(cè)定液質(zhì)聯(lián)用法

1范圍

本文件規(guī)定了化妝品中常用植物提取物中16種香豆素類化合物的液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定方法。

本文件適用于液體類常用植物提取物中16種香豆素類化合物的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期

的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括

所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4原理

樣品提取后，采用高效液相色譜儀分離，質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)。根據(jù)保留時(shí)間和特征離子對(duì)

的相對(duì)豐度比定性、定量離子對(duì)峰面積定量，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

5試劑

除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

5.1乙腈：色譜純。

5.2甲酸：色譜純。

5.3甲醇：色譜純。

5.40.1%甲酸溶液：取1mL甲酸（5.2）用水定容至1000mL，混勻。

5.5標(biāo)準(zhǔn)品：香豆素、7-羥基香豆素、補(bǔ)骨酯素、7-甲基香豆素、異補(bǔ)骨酯素、8-甲氧基補(bǔ)

骨酯素、歐前胡素、異歐前胡素、6,7-二甲氧基香豆素、新補(bǔ)骨酯異黃酮、補(bǔ)骨酯二氫黃酮、

4-甲基-7-羥基香豆素、4-甲基-7-乙氧香豆素、5-甲氧基補(bǔ)骨酯素、2,4,8-三甲基補(bǔ)骨酯素、

環(huán)香豆素標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥98%。

5.6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱取香豆素、7-羥基香豆素、補(bǔ)骨酯素、7-甲基香豆素、異補(bǔ)骨酯素、

8-甲氧基補(bǔ)骨酯素、歐前胡素、異歐前胡素、6,7-二甲氧基香豆素、新補(bǔ)骨酯異黃酮、補(bǔ)骨

酯二氫黃酮、4-甲基-7-羥基香豆素、4-甲基-7-乙氧香豆素、5-甲氧基補(bǔ)骨酯素、2,4,8-

三甲基補(bǔ)骨酯素、環(huán)香豆素各10mg（精確到0.00001g），分別置于10mL棕色容量瓶中，

用甲醇(5.3)溶解并定容至刻度，混勻。制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的質(zhì)量濃度均為1000mg/L。置

于-18℃以下冰箱中保存，有效期3個(gè)月。

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5.7混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量置于20mL棕色容量瓶中，用甲醇(5.3)

并定容至刻度，搖勻，制成配制香豆素質(zhì)量濃度范圍約為80μg/mL，7-羥基香豆素、補(bǔ)骨

酯素、7-甲基香豆素、異補(bǔ)骨酯素、8-甲氧基補(bǔ)骨酯素質(zhì)量濃度范圍約為40μg/mL，歐前

胡素、異歐前胡素、6,7-二甲氧基香豆素、新補(bǔ)骨酯異黃酮、補(bǔ)骨酯二氫黃酮質(zhì)量濃度范圍

約為8.0μg/mL，4-甲基-7-羥基香豆素、4-甲基-7-乙氧香豆素、5-甲氧基補(bǔ)骨酯素、2,4,8-

三甲基補(bǔ)骨酯素、環(huán)香豆素質(zhì)量濃度范圍約為4.0μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。置于-18℃

中避光保存，有效期1個(gè)月。

5.8混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備：精密移取適量混合對(duì)照品中間溶液，用甲醇(5.3)配制香豆

素質(zhì)量濃度范圍約為0.20μg/mL～8.0μg/mL，7-羥基香豆素、補(bǔ)骨酯素、7-甲基香豆素、

異補(bǔ)骨酯素、8-甲氧基補(bǔ)骨酯素質(zhì)量濃度范圍約為0.10μg/mL～4.0μg/mL，歐前胡素、

異歐前胡素、6,7-二甲氧基香豆素、新補(bǔ)骨酯異黃酮、補(bǔ)骨酯二氫黃酮質(zhì)量濃度范圍約為

0.02μg/mL～0.80μg/mL，4-甲基-7-羥基香豆素、4-甲基-7-乙氧香豆素、5-甲氧基補(bǔ)

骨酯素、2,4,8-三甲基補(bǔ)骨酯素、環(huán)香豆素質(zhì)量濃度范圍約為0.01μg/mL～0.40μg/mL

的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，具體濃度見表1。

表1香豆素等16種組分的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度

序號(hào)名稱混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度（μg/mL）

1香豆素0.200.501.02.04.08.0

27-羥基香豆素0.100.250.501.02.04.0

3補(bǔ)骨酯素0.100.250.501.02.04.0

47-甲基香豆素0.100.250.501.02.04.0

5異補(bǔ)骨酯素0.100.250.501.02.04.0

68-甲氧基補(bǔ)骨酯素0.100.250.501.02.04.0

7歐前胡素0.020.050.100.200.400.80

8異歐前胡素0.020.050.100.200.400.80

96,7-二甲氧基香豆素0.020.050.100.200.400.80

10新補(bǔ)骨酯異黃酮0.020.050.100.200.400.80

11補(bǔ)骨酯二氫黃酮0.020.050.100.200.400.80

124-甲基-7-羥基香豆素0.010.0250.050.100.200.40

134-甲基-7-乙氧香豆素0.010.0250.050.100.200.40

145-甲氧基補(bǔ)骨酯素0.010.0250.050.100.200.40

152,4,8-三甲基補(bǔ)骨酯素0.010.0250.050.100.200.40

16環(huán)香豆素0.010.0250.050.100.200.40

6儀器和設(shè)備

6.1高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配電噴霧離子源（ESI源）。

6.2分析天平：感量0.0001g和0.00001g。

6.3超聲波清洗器。

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6.4渦旋混合儀。

6.5高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于6000r/min。

6.6微孔濾膜：0.22μm。

7樣品

精密稱取不同柑橘類、石斛類、當(dāng)歸類、馬齒莧類等化妝品植物提取物品種植物提取物

1.0g（精確至0.1mg）于20mL容量瓶中，加入適量甲醇，漩渦2min后，移至超聲器超

聲提取20min，甲醇定容，混勻后取適量溶液至離心管中，8000r/min離心8min，取上

清液用0.22μm濾膜過濾，進(jìn)樣，分析測(cè)定。

8試驗(yàn)步驟

8.1儀器參考條件

8.1.1色譜條件

色譜柱：C18柱（2.1mm×100.0mm，1.7μm），或等效色譜柱；

流動(dòng)相：A為乙腈（5.1)，B為0.1%甲酸溶液（5.4)，梯度洗脫程序見表2。

流速：0.30mL/min；

柱溫：30℃；

進(jìn)樣量：1μL。

表2梯度洗脫程序

時(shí)間（min）流動(dòng)相A（%）流動(dòng)相B（%）

0.00595

1.00595

2.002575

7.002575

9.007030

11.007030

13.009010

15.009010

15.10595

17.10595

8.1.2質(zhì)譜條件

監(jiān)測(cè)模式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表3。

毛細(xì)管電壓：3600V

毛細(xì)管溫度：500℃

離子源溫度：150℃

表316種香豆素類化合物質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

Table3Massspectrometricconditionformonitoringof16coumarincompounds

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保留時(shí)母離子子離子錐孔電碰撞電壓

序號(hào)名稱

間(min)（m/z）（m/z）壓（V）(v)

1香豆素5.43146.990.9*3220

76.922

27-甲基香豆素8.35160.9104.9*3420

90.820

37-羥基香豆素4.00162.9106.9*3422

76.828

44-甲基-7-羥基香豆素4.76176.9120.9*3822

104.920

5補(bǔ)骨酯素8.21186.9130.9*3426

76.836

6異補(bǔ)骨脂素8.47186.9130.8*3422

76.934

74-甲基-7-乙氧香豆素9.20205.0176.9*3220

104.922

86,7-二甲氧基香豆素5.06207.0106.9*3634

150.922

98-甲氧基補(bǔ)骨脂素8.54217.0201.9*3622

89.536

105-甲氧基補(bǔ)骨脂素8.92217.0202.0*3424

117.932

112,4,8-三甲基補(bǔ)骨脂素9.73229.1141.8*4224

173.022

12異歐前胡素10.14271.1203.0*1612

90.840

13歐前胡素9.79271.1146.9*1834

202.912

14環(huán)香豆素10.44323.2120.9*2444

251.018

15新補(bǔ)骨酯異黃酮9.35323.2267.0*3218

255.020

16補(bǔ)骨酯二氫黃酮9.47325.264.8*3444

148.924

*為推薦的定量離子。

注：當(dāng)采用不同質(zhì)譜儀器時(shí)，儀器參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。

8.2定性判定

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取樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同分析條件下測(cè)定，樣品中如呈現(xiàn)定量離子對(duì)和定性離子對(duì)

的色譜峰，被測(cè)成分的特征離子峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間一致，且選擇的定性

離子的相對(duì)豐度比與相當(dāng)濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的定性離子的相對(duì)豐度比的最大偏差不超過表4

規(guī)定的范圍，則可以確定試樣中檢出對(duì)應(yīng)的成分。

表4定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度比的最大允許偏差

相對(duì)離子豐度（X）/%X>5050≥X>2020≥X>10X≤10

允許的最大偏差/%±20±25±30±50

8.3定量測(cè)定

取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（5.8）依次測(cè)定，以待測(cè)組分的系列濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)組分的

峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。取樣品溶

液（7.1）測(cè)定，將對(duì)應(yīng)的定量離子色譜峰面積代入線性回歸方程。按“8”計(jì)算樣品中待測(cè)

組分的含量。供試品溶液中待測(cè)組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。

8.4平行試驗(yàn)

按以上步驟，對(duì)同一樣品進(jìn)行平行試驗(yàn)測(cè)定。

8.5空白試驗(yàn)

除不加試樣外，均按上述步驟完成測(cè)定。

9結(jié)果計(jì)算

結(jié)果按式(1)計(jì)算：

…………(1)

式中：

ω—樣品中16種香豆素類化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；

ρ—供試品溶液中16種香豆素類化合物質(zhì)量濃度，μg/mL；

V—樣品定容體積，mL；

m—樣品取樣量，g；

D—稀釋倍數(shù)（如未稀釋則為1）。

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計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有

效數(shù)字。在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

10精密度和準(zhǔn)確度

定量下限濃度回收率為70%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.5%（n=6），中、高濃度回收

率為85%～115%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.0%（n=6）。

11檢出限和定量限

本方法中各組分的檢出限、定量下限和取樣量為0.2g時(shí)的檢出濃度、最低定量濃度見

表5。

表516種香豆素類化合物的檢出限、定量下限、檢出濃度和最低定量濃度

序檢出限定量下限檢出濃度最低定量濃度

組分名稱

號(hào)（μg/L）（μg/L）（μg/kg）（μg/kg）

1香豆素0.180.618.060.0

27-羥基香豆素0.130.4313.043.0

3補(bǔ)骨酯素0.280.9328.093.0

47-甲基香豆素0.230.7723.077.0

5異補(bǔ)骨脂素0.270.927.090.0

68-甲氧基補(bǔ)骨脂素0.10.3310.033.0

7歐前胡素0.03