DB15-T 3747-2024 羊布魯氏菌免疫抗體(M5-90△26株)與感染抗體鑒別檢測(cè)ELISA法

15ELISAmethodfordistinguishingm5-90Δ26vaccinatedI本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC1本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中1羊布魯氏菌免疫抗體(M5-90Δ26株)與感染抗體鑒別檢測(cè)ELISA法本文件規(guī)定了僅免疫羊布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90Δ26株）免疫抗體與感染抗體鑒別檢測(cè)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格GB/T18646-2018動(dòng)物布魯氏菌病NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImHRP辣根過氧化物酶（HorseradishPeroxidasTMB3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TetramethylbenzPBS磷酸鹽緩沖液（PhosphaPCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeDNA脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacBCA聚氰基丙烯酸正丁酯（BicinchoninicAci25.3恒溫培養(yǎng)箱（37℃)。5.5冰箱（4℃,-20℃)。5.6旋渦振蕩器。6.14血清稀釋板。6.15封板膜。6.16移液器相匹配的吸頭。6.17商品化試劑盒（可以選擇）。按照NY/T541執(zhí)行，按常規(guī)方法采血，采血管室溫（18℃~25℃)下傾斜30°靜置2h～4h，待r/min離心10min～15min收集血清。樣品采集生物安全規(guī)范7.2樣品保存血清樣品若在一周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，則置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。血清樣品若超過一周檢測(cè)，則置于-7.3樣品運(yùn)輸血清樣品若12h內(nèi)運(yùn)達(dá)實(shí)驗(yàn)室，在保溫箱內(nèi)加冰袋運(yùn)輸。若超過12h后 (-20℃)后，在保溫箱內(nèi)加大量冰袋運(yùn)輸，途中不能超過48h，樣品的包裝和運(yùn)輸應(yīng)符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村3感染抗體，指若羊感染布魯氏菌野毒株，則既會(huì)產(chǎn)生針對(duì)脂多糖LPS的抗體，也會(huì)產(chǎn)生針對(duì)膜間質(zhì)蛋白BP26的抗體。免疫抗體，指若羊免疫布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90Δ26株）以后，則只產(chǎn)生針對(duì)脂多糖LPS的抗體。鑒別ELISA檢測(cè)方法，通過同時(shí)檢測(cè)羊血清樣品中脂多糖LPS和膜間質(zhì)蛋白BP26的抗體，以鑒別羊布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90Δ8.2試劑平衡試劑在室溫（18℃~25℃)條件下放置至少30min，平衡至室溫（18℃~25℃)后使用，使用8.3試劑配制8.4稀釋充分混勻。置2℃~8℃保存?zhèn)溆谩＆蘈加入96孔酶標(biāo)板中，標(biāo)記為膜間質(zhì)蛋白BP26和脂多糖LPS包被板，貼封板膜，置2℃~8℃作用16h～18h。膜間質(zhì)蛋白BP26包被板標(biāo)記為B1、B2……，脂多糖LPS包被板標(biāo)記為L(zhǎng)1、L2……。按照附錄B8.6洗滌8.9加樣48.11洗滌8.12加酶結(jié)合物8.13孵育8.14洗滌8.16終止8.17測(cè)定若LPS/LPS＞2.1，且BP26/BP26＞2.1時(shí)，則判為試驗(yàn)成立。否則，本次試驗(yàn)無效，S/N值LPS=SLPS/LPS；S/N值BP26=S表示樣品在脂多糖LPS包被板上的OD450nm值；SBP26，表示樣品在膜間質(zhì)蛋白BP269.3結(jié)果判定59.3.1若S/N值LPS＜3.1時(shí)，與S/N值BP26無關(guān)，則結(jié)果判定為陰性，表示沒9.3.2若S/N值LPS≥3.1且S/N值BP26＜3.3，則結(jié)果判為脂多糖LPS抗體陽(yáng)性，表示羊布魯氏菌基6A.1抗原的制備從滅活的羊種布魯氏菌M5株中提取核酸，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼膜間質(zhì)蛋白BP26開放閱讀框的753用蛋白純化儀純化重組膜間質(zhì)蛋白BP26，取10μL膜間質(zhì)蛋白BP26進(jìn)行SDS電泳，對(duì)蛋白純度和分子量進(jìn)行測(cè)定，純化重組膜間質(zhì)蛋白BP26大小約26kDa，無其他明顯雜帶，蛋白較為純凈。BCA方法測(cè)定重組膜間質(zhì)蛋白BP26的濃度達(dá)到0.5mg/m脂多糖LPS的提取，按照GB/T18646-20加蒸餾水定容至1000mL。121℃,30min高壓滅菌，置2℃~8℃保存?zhèn)溆谩９?jié)pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1000mL。121℃,30min高壓滅菌，置2℃~8℃保存?zhèn)溆谩７Q取10g明膠，加入800mLPBSmL。過濾除菌，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。稱取58g磷酸氫二鈉（含12個(gè)結(jié)晶水）、4g磷酸二氫鉀、160g氯化鈉、4g氯化鉀，溶于800mL蒸餾水中，再加入10mL吐溫-20，最后加蒸餾水定容至1000mL。121℃,30min高壓滅菌，置2℃~A.6樣品稀釋液稱取50g脫脂奶粉、0.5mL吐溫-20最后再加PBS定容至1000mL。過濾除菌，置2℃~8℃保存?zhèn)溆谩.7酶結(jié)合物將商品化HRP標(biāo)記的驢抗山羊和HRP標(biāo)記的驢抗綿羊酶標(biāo)抗體，按照1:1混合后，