美國藥典-USP-561-植物源性物質(zhì)VIP

第11頁/共23頁<561>植物源性物質(zhì)抽樣為了減少取樣偏差對定性、定量結(jié)果的影響，就必須保證所抽樣品的組成在該批藥品中具有代表性。對于植物藥來說，以下取樣步驟是植物藥取樣的最低要求。某些品種或某些檢測，需要更加嚴格的抽樣步驟，包括從更多的容器中取樣或從單個容器中取更多的樣品。大批樣品某批次樣品的包裝總數(shù)(N)需要抽檢的包裝數(shù)量(n)1～10全部11～1911＞19n=10+(N/10)(“四舍五入”計算“n”至鄰近的最高位整數(shù)。)從每個包裝的上部、中部、下部分別取樣。如果樣品由尺寸為1cm或者小于1cm的部分組成，以及由粉末或者研碎的小顆粒組成的樣品，可借用取樣裝置取樣，該裝置能移取從包裝的頂端至底部包括中心的一段，從不同的方向移取至少兩次。如果樣品尺寸大于1cm，手工取樣。對于大捆或大包樣品，應(yīng)從樣品10cm深處取樣，因為表層樣品的水分含量可能不同于內(nèi)層。從每個開口包裝取出單個的樣品進行混合制成大批樣品，務(wù)必不要增加樣品的粉碎程度和顯著改變其濕度。對于包裝小于1kg的樣品，將內(nèi)容物混勻，并移取足夠檢測使用的樣品。對于包裝在1-5kg的樣品，從包裝的上、中、下部移取等量的樣品，每一樣品足夠檢測使用。充分混合樣品，移取足夠檢測使用的樣品。對于包裝大于5kg的樣品，從包裝的上、中、下部移取三個樣品，每個樣品重量不得少于250g。充分混合樣品，移取足夠檢測使用的樣品。實驗室樣品實驗室樣品通過對大批樣品進行重復(fù)四分法獲得。注釋—四分法包括準備試樣、充分混合使之成均等的方形和按對角線平均分成四等份。取其中相對的兩份，充分混合，按照上述步驟重復(fù)進行直至達到要求的量。平均試樣必須有足夠的量以完成所有必檢項目。檢測樣品除非各論中或試驗操作下另有說明，按以下方法獲得試樣：依據(jù)四分法縮小實驗室樣品的量，注意確保每份取出的部分具有代表性。對于非粉末或者非研碎的樣品，研碎樣品使之能通過20號標準篩，并充分混合均勻；如果樣品不能被研碎，盡量研碎使樣品呈現(xiàn)盡量細的狀態(tài)，并混合，在紙上或者取樣布上通過碾軋混勻樣品，使之分散成一薄層，提取一部分作為分析備用。分析方法有機異物試樣—除非各論中另有說明，稱取下述質(zhì)量的實驗室樣品，確保樣品具有代表性(如有需要，可應(yīng)用四分法取樣)：根、莖、樹皮和草藥類5葉子、花、種子和果實2切碎的植物藥(平均片重不低于0.5g)5將樣品平鋪分散成一薄層，盡量用手工挑選出全部有機異物。稱重，計算有機異物占所取樣品的質(zhì)量百分比。總灰分精確稱定一定量檢測樣品(相當(dāng)于2～4g經(jīng)空氣干燥的樣品)于去皮重的坩堝中，灼燒，開始用小火，逐漸升高溫度至675±25°，直至完全灰化，稱灰分的重量。如果這種方法不能得到無碳灰分，用熱水提取焦化的物質(zhì)，收集不溶性殘渣于一張無灰濾紙上進行過濾，灼燒不溶性殘渣和濾紙直至使灰分變?yōu)榘咨蛘呓咨?，然后將濾液加入，蒸發(fā)至干，一起置于675±25°下灼燒。如果這種方法亦不能得到無碳灰分，冷卻坩堝，向其中加入15mL乙醇，玻璃棒搗碎灰分，蒸干乙醇，再次置于675±25°下灼燒。置于干燥器內(nèi)冷卻，稱重灰分，計算總灰分占所取藥品重量的百分含量。酸不溶性灰分向按上述總灰分中的指示操作得到的灰分中加入25mL3N鹽酸，煮沸5分鐘，用去皮重的過濾坩堝或者無灰濾紙收集不溶性物質(zhì)，熱水洗滌，灼燒，并稱重。計算酸不溶性灰分占所取藥品重量的百分含量。水溶性灰分按總灰分中的指示制備灰分，向其中加入25mL水，煮沸5分鐘。用熱壓結(jié)玻璃坩堝或者無灰濾紙收集不溶物。熱水洗滌，在不超過450°下灼燒15分鐘。用總灰分減去灼燒殘渣的質(zhì)量(mg)，計算水溶性灰分占總灰分項下測得的樣品質(zhì)量的百分含量。醇溶性浸出物方法1(熱浸提法)—精確稱定4g風(fēng)干的樣品粗粉，置于一具塞錐形瓶中，加入100mL乙醇，并稱重錐形瓶，搖勻，靜置1h后，接上回流冷凝管，水浴加熱回流1h，冷卻，稱重，用乙醇調(diào)整其質(zhì)量等于初始質(zhì)量，搖勻，用一干燥的過濾器迅速過濾，取濾液25mL置于一事先恒重的表面皿，水浴蒸干，105°干燥6h，置于干燥器冷卻30min，并立即稱重。計算醇溶性提取物質(zhì)占試驗樣品的比例，以mg/g表示。方法2(冷浸提法)—精確稱定4g風(fēng)干的樣品粗粉，置于一具塞錐形瓶中。加入100mL乙醇，向錐形瓶內(nèi)放入一塞子，浸提24h，前8h不時振蕩錐形瓶，靜置。快速過濾，注意乙醇的揮發(fā)損失。移取25mL濾液置于事先恒重的平底淺平皿中，蒸干溶劑，于105°烘干至恒重。計算醇溶性物質(zhì)占試驗樣品的比例，以mg/g表示。水溶性浸出物方法1(熱浸提法)—按照醇溶性浸出物中的方法1(熱浸提法)步驟處理，溶劑以水代替醇即可。方法2(冷浸提法)—按照醇溶性浸出物中的方法2(冷浸提法)步驟處理，溶劑以水代替醇即可。粗纖維稱取一定量(相當(dāng)于2g藥物)的檢測樣品用乙醚處理(揮干乙醚)。在一500mL燒瓶內(nèi)，向該無醚樣品中加入200mL沸騰的稀硫酸溶液(1:78)，接上回流冷凝管?；亓骰旌衔?0min，準確計時，然后用亞麻布或者硬紙過濾器過濾，用沸水洗滌濾紙上的殘渣，直至流出液不呈酸性為止。再用200mL沸騰的氫氧化鈉溶液(通過滴定調(diào)節(jié)濃度至1.25%，且不含碳酸鈉)將殘渣洗回?zé)績?nèi)。回流30min，準確計時，用已去皮重的濾器快速過濾，用沸水洗滌濾紙上的殘渣，直至最后的流出液為中性，將濾紙和殘渣置于110°干燥至恒重。灼燒干燥殘渣至恒重，在干燥器中冷卻，稱重灰分：110°在干燥得到的質(zhì)量和灰分質(zhì)量的差值即為粗纖維的質(zhì)量。注釋—從液體(通過將液體加入冷的燒瓶，使其溫度降至沸點以下)再次沸騰開始，酸堿須持續(xù)沸騰30min，準確計時。液體沸騰后，應(yīng)該降低加熱溫度，只要能保證燒瓶內(nèi)液體持續(xù)沸騰即可。沸騰期間須不時輕輕地旋轉(zhuǎn)燒瓶，洗下附著在燒瓶壁的微小顆粒。在沸騰過程中，如果泡沫過多，可向燒瓶內(nèi)通入空氣。淀粉含量方法1—以下步驟是測定總還原糖的一般方法并可能用于確定植物性樣品中的淀粉含量。麥芽提取物—使用具有確定效能的新鮮大麥麥芽，臨用前研磨。臨用前制備麥芽提取物。每制備80mL麥芽提取物，需將5g磨碎的麥芽用100mL水在室溫消化2h。[注釋—如果用電動攪拌器，攪拌混合物20min即可。]過濾得澄清提取液，如有需要再過濾，混勻浸出液。供試溶液一稱取約5g充分磨碎的樣品，用10mL乙醚提取5次，用能截留所有細小淀粉顆粒的過濾皿過濾，蒸發(fā)除去殘留物中的醚，用250mL乙醇水溶液(10mL乙醇用水定容至100mL)洗滌。用約100mL水小心將濾紙上的殘渣洗脫至500mL大口燒杯中，加熱至60°(盡可能避免淀粉加熱糊化)，維持1h，這期間不停地攪拌使糖類能完全溶解形成溶液。轉(zhuǎn)移至一廣口瓶中，用少量溫水洗滌，冷卻。加入等體積的乙醇，混勻，放置1h以上。離心使沉淀聚集至瓶底，輕輕倒出上層清液。用50mL乙醇溶液(50mL乙醇用水定容至100mL)連續(xù)洗滌，并離心，傾出液通過適當(dāng)?shù)倪^濾器，直到濾出液無糖為止。[注釋—為了檢驗是否含糖，可向試管中滴加幾滴洗出液，并加入3~4滴20%的1-萘酚乙醇溶液，200mg1-萘酚溶解于1mL乙醇和2mL水即得20%的1-萘酚乙醇溶液。搖勻混合液，沿著試管壁加入2～4mL濃硫酸，保持試管豎直放置。如果洗滌液含糖，兩液體的界面處出現(xiàn)淡紫色并逐漸變?yōu)樯钭仙?，振蕩試管，整個溶液呈現(xiàn)藍紫色。]將瓶底和硬紙濾紙的沉淀用50mL水轉(zhuǎn)移至一大口燒杯中，將燒杯浸入沸水浴，并攪拌，維持15min，或者直到所有的淀粉糊化，冷卻至55°，加入20mL麥芽提取物，在此溫度下維持1h。繼續(xù)加熱至沸騰，并維持幾分鐘，冷卻至55°，再加入20mL麥芽提取物，在此溫度下維持1h或者直到殘留物加入碘TS，顯微鏡觀察不再顯示藍色為止。冷卻，用水稀釋淀粉水解液至250mL，過濾。一般步驟—移取200mL供試溶液置于燒瓶(連有回流冷凝管)內(nèi)，加入20mL鹽酸，沸水浴上加熱2.5h。冷卻，用氫氧化鈉TS中和至近中性，并用碳酸鈉TS中和至完全中性，用水稀釋至500mL，混勻，過濾。移取濾液的體積取決于待測樣品中淀粉的含量(參見表1)。所取濾液需含有100mg~200mg的葡萄糖。移取50mL濾液至一400mL耐堿玻璃燒杯中，加入50mL堿性酒石酸銅TS，用玻璃表面皿蓋住燒杯，加熱。調(diào)整電爐的溫度，使燒瓶內(nèi)的液體在4min內(nèi)開始沸騰，并精確持續(xù)沸騰2min。用熱壓結(jié)的玻璃濾器過濾該熱溶液。用約60°水徹底洗滌漏斗內(nèi)氧化亞銅沉淀，再用10mL乙醇洗滌，最后用10mL乙醚洗滌。表1最適宜的濾液體積的確定預(yù)計的淀粉含量，%所取濾液體積，mL60255035405030502050如果溶液還原糖純度比較高，按照方法1A項下所示操作，通過稱重干燥氧化亞銅的質(zhì)量來計算被還原的銅的量；如果溶液中還原糖混有大量的有機雜質(zhì)，包括蔗糖，按照方法1B項下所示操作，通過硫代硫酸鈉溶液滴定計算被還原的銅的量。方法1A—將一般步驟中獲得的沉淀在110±2°烘箱中干燥30min，置于干燥器中冷卻至室溫，稱重，參照表2，依據(jù)氧化亞銅的質(zhì)量找到對應(yīng)的葡萄糖含量(mg)，計算葡萄糖的百分含量并按下式計算淀粉含量。淀粉含量(%)=葡萄糖%×0.9表2計算的葡萄糖(當(dāng)Cu2O直接稱重時適用)(單位mg)104.09038.917075.1250112.8330152.2410193.7124.99239.817276.0252113.7332153.2412194.7145.79440.617476.9254114.7334154.2414195.8166.69641.517677.8256115.7336155.2416196.8187.59842.417878.8258116.6338156.3418197.9208.310043.318079.7260117.6340157.3420199.0229.210244.218280.6262118.6342158.3422200.12410.010445.118481.5264119.5344159.3424201.12610.910646.018682.5266120.5346160.3426202.22811.810846.918883.4268121.5348161.4428203.33012.611047.819084.3270122.5350162.4430204.43213.511248.719285.3272123.4352163.4432205.53414.311449.619486.2274124.4354164.4434206.53615.211650.519687.1276125.4356165.4436207.63816.111851.419888.1278126.4358166.5438208.74016.912052.320089.0280127.3360167.5440209.84217.812253.220289.9282128.3362168.5442210.94418.712454.120490.9284129.3364169.6444212.04619.612655.020691.8286130.3366170.6446213.14820.412855.920892.8288131.3368171.6448214.15021.313056.821093.7290132.3370172.7450215.25222.213257.721294.6292133.2372173.7452216.35423.013458.621495.6294134.2374174.7454217.45623.913659.521696.5296135.2376175.8456218.55824.813860.421897.5298136.2378176.8458219.66025.614061.322098.4300137.2380177.9460220.76226.514262.222299.4302138.2382178.9462221.86427.414463.1224100.3304139.2384180.0464222.96628.314664.0226101.3306140.2386181.0466224.06829.214865.0228102.2308141.2388182.0468225.17030.015065.9230103.2310142.2390183.1470226.27230.915266.8232104.1312143.2392184.1472227.47431.815467.7234105.1314144.2394185.2474228.37632.715668.6236106.0316145.2396186.2476229.67833.615869.5238107.0318146.2398187.3478230.78034.416070.4240108.0320147.2400188.4480231.88235.316271.4242108.9322148.2402189.4482232.98436.216472.3244109.9324149.2404190.5484234.18637.116673.2246110.8326150.2406191.5486235.28838.016874.1248111.8328151.2408192.6488236.3方法1B—硫代硫酸鈉溶液—稱取3.9g硫代硫酸鈉，精密稱定，至100mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度線，混勻。碘化鉀溶液—稱取42g碘化鉀，溶解于100mL水中。乙酸鈉溶液—稱取5.74g乙酸鈉，溶解于10mL水。銅溶液—稱取約0.3g純電解銅，精密稱定，置于250mL燒瓶，加入5mL硝酸溶解銅，加入約25mL水，加熱沸騰排去紅色煙霧。加入5mL溴TS，煮沸直至完全除去溴。冷卻后，加入10mL乙酸鈉溶液，然后再加入10mL碘化鉀溶液，用硫代硫酸鈉溶液滴定至溶液呈亮黃色。接著加入足夠的淀粉TS，使之呈現(xiàn)顯著的藍色，并繼續(xù)滴定，臨近滴定終點時，加入2g硫氰酸鉀固體，攪拌至完全溶解，繼續(xù)滴定至沉淀物完全變白為止。每mL硫代硫酸鈉溶液相當(dāng)于約10mg銅。[注釋—須小心調(diào)整碘化鉀溶液的濃度。如果滴定結(jié)束時溶液所含的銅小于320mg，加入4.2～5g碘化鉀制成總體積為100mL的溶液；如果有過量的銅存在，用滴定管緩慢加入碘化鉀溶液，并不斷攪拌，逐漸增大攪拌速率。]步驟—用水洗滌一般步驟中得到的氧化亞銅沉淀，用玻璃表面皿蓋住過濾器，用吸量管吸取5mL硝酸溶解氧化亞銅于玻璃表面皿中，收集濾液于250mL燒瓶中，用水洗滌玻璃表面皿和過濾器，收集洗滌液于燒瓶中。煮沸燒瓶內(nèi)的液體去除紅色煙霧，加入約5mL溴TS，煮沸直至完全除去溴。冷卻后，從“加入10mL乙酸鈉溶液”處開始，按照銅溶液方法處理。根據(jù)消耗的硫代硫酸鈉溶液體積，計算銅的質(zhì)量(mg)，乘以1.1259得到氧化亞銅的質(zhì)量(mg)。參照表2，找到對應(yīng)的葡萄糖的質(zhì)量(mg)，淀粉的質(zhì)量(mg)相當(dāng)于葡萄糖質(zhì)量乘以0.9。以加入50mL堿性酒石酸銅TS和50mL麥芽提取物做空白對照試驗，如果得到的氧化亞銅超過0.5mg，相應(yīng)的校正結(jié)果。[注釋—堿性酒石酸銅TS長期存放后會變質(zhì)，導(dǎo)致空白對照試驗中得到的氧化亞銅質(zhì)量增加。]方法2—下述方法以葡萄糖為例，因為葡萄糖的高靈敏性，可能會引起同一種樣品得到不同的數(shù)值。重復(fù)試驗結(jié)果的誤差不得超過2%。葡萄糖糖化酶溶液—制備每毫升含30個國際單位(IU)的葡萄糖糖化酶溶液，糖化酶的最佳來源為德氏根霉。所用樣品的葡萄糖糖化酶總酶活性應(yīng)不低于150IU。乙酸鹽緩沖溶液—用100mL水溶解16.4g乙酸鈉，加入12.0mL冰乙酸，混勻即可，該溶液的pH為4.8。磷酸鹽緩沖液—將3.63g三羥甲基氨基甲烷和5.0g磷酸二氫鈉溶解于50.0mL水中。37°下，用磷酸調(diào)節(jié)溶液的pH為7.0，并用水稀釋至100.0mL，混勻。[注釋—磷酸緩沖液的pH對溫度敏感，須在孵育溫度調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH。]酶溶液—溶解30mg葡萄糖氧化酶(黑曲霉Ⅱ型酶)，3mg過氧化物酶(辣根過氧化物酶=1\*ROMANI型)和10mg亞鐵氰化鉀于100mL磷酸緩沖液中(注釋—該混合物可在冰箱中保存10天。)18N硫酸溶液—將54mL濃硫酸緩慢加入102mL水中，并不斷攪拌，冷卻至25°，混勻。標準溶液—精密稱定一定量的USP葡萄糖RS，溶解于水中，配成每毫升含有1.0mgUSP葡萄糖RS的溶液。用水將已知體積的該溶液定量稀釋以制備一系列已知濃度的標準溶液A、B、C、D和E，每mL標準稀釋液含有的USP葡萄糖RS分別為10、20、25、40和50μg。[注釋—臨用前允許4h待其發(fā)生完全變旋作用。]供試溶液—稱取約5g充分磨碎的供試樣品，用25mL80%乙醇提取五次，過濾，將殘渣置于105°烘箱中干燥8h以完全除去殘留的乙醇。[注釋1—任何痕量的乙醇殘留將會抑制葡萄糖糖化酶活性。]冷卻，將含有干燥供試品的燒瓶置于干燥器內(nèi)。稱取1g供試品，精密稱定，置于事先干燥恒重的燒瓶，加入25mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH值為5.0～7.0，如果需要，煮沸懸浮液3min。然后將燒瓶轉(zhuǎn)入高壓鍋內(nèi)，135°持續(xù)2h。從高壓鍋取出燒瓶，保持燒瓶溫度在55°左右，加入2.5mL乙酸鹽緩沖溶液和足量的水，調(diào)節(jié)燒瓶內(nèi)溶液的總質(zhì)量為45±1g。55±1°水浴加熱，并加入5mL葡萄糖糖化酶溶液。燒瓶持續(xù)渦旋振蕩2h使淀粉水解，用濾紙過濾至250mL容量瓶，用一定量水洗滌，洗滌液一并轉(zhuǎn)入容量瓶，用水定容至刻度線，混勻。分別向5支試管中移取1mL供試液(含有20～60μg的D-葡萄糖)。[注釋2—為了使水解產(chǎn)物的D-葡萄糖濃度在此范圍，如有必要，用水將供試液定量稀釋定容。]分別向5支試管中加入2mL酶溶液，并將試管置于暗處，37±1°溫度下，準確放置30min顯色。30min結(jié)束時，再分別向5支試管中加入2mL18N硫酸溶液終止反應(yīng)，并混勻。對照溶液—稱量約0.4g淀粉，精密稱定，置于一事先恒重的燒瓶，從“加入25mL水，并用磷酸調(diào)節(jié)pH”處開始按照供試溶液中的指示操作。步驟—選用適當(dāng)?shù)姆止夤舛扔?，連續(xù)地在最大波長處(約540nm)測定標準溶液和供試溶液的吸光值，并以對照溶液為空白校正儀器。以吸光值和標準溶液中葡萄糖溶液的濃度(μg/mL)繪制直線，使該直線能很好的擬合這5個點。根據(jù)繪制的標準曲線，確定各供試溶液中葡萄糖的濃度C(μg/mL)，計算待測溶液的平均濃度(μg/mL)。根據(jù)下面方程計算供試樣品中淀粉含量：(0.9C/106)(V1)(250/V0)(100/E)(100/W)=2.25CV1/V0式中，E為所取供試樣品的質(zhì)量，g；V0為從250mL容量瓶中所移取的體積；W為供試樣品干重的質(zhì)量百分比；V1為供試溶液的體積，mL，如有稀釋(見供試溶液中的注釋2)。[注釋—如果沒有再稀釋，V0=1.0]揮發(fā)油含量測定將一圓底短頸1L燒瓶固定于放在磁力攪拌器上的加熱套內(nèi)，并在燒瓶內(nèi)放一卵形攪拌轉(zhuǎn)子，接上指型冷凝管和合適的揮發(fā)油收集器，如圖示。揮發(fā)油裝置的管子粗略地粉碎足夠量的待測藥品，使其能產(chǎn)生1～3mL揮發(fā)油。小的種子、果實、或者破碎的葉子和藥草通常不需要粉碎。要避免樣品顆粒非常細，如果不可避免，可以混入經(jīng)純化的鋸末屑或者沙子。將適量的藥品，精確稱定，置于燒瓶內(nèi)，加入一半體積的水，接上冷凝管和合適的分離器，加熱燒瓶至微沸并保持2h，或者直到藥品中的揮發(fā)油完全被蒸餾出，分離器中的刻度管體積不再增加為止。如果已經(jīng)從分離器的刻度管中獲得一定量的揮發(fā)油，可從刻度管中讀數(shù)，能精確至0.1mL?？梢杂嬎愠?00g藥品中揮發(fā)油的含量。對于“密度比水重的揮發(fā)油”的分離器刻度管，油在冷凝水的下部，會自動流回?zé)績?nèi)。水分含量對于未研碎或非粉末狀的藥品，通過剪切、打粉或者切碎制備約10g實驗室樣品，使其破碎部分約為3mm厚。對于小于3mm的種子和果實需要粉碎。樣品制備時避免使用高轉(zhuǎn)速的磨碎機，且樣品制備過程中還要注意避免大量水分的損失以及所取樣品具有實驗室樣品代表性。按照水分測定<921>項下的方法Ⅲ(重量法)中的植物源性藥品的操作步驟測定水分含量。黃曲霉毒素的檢測注意—黃曲霉毒素危險性很高，在處理含有黃曲霉毒素的樣品時須極其小心。如果各論中要求黃曲霉毒素的順應(yīng)性限量，則黃曲霉毒素B1（AFB1）不超過5ppb，黃曲霉毒素B1（AFB1）,B2(AFB2),G1(AFG1)和G2(AFG2)總和不超過20ppb。測試中可能采用存在污染風(fēng)險的方法。測定黃曲霉毒素的順應(yīng)性時將考慮存在的意外污染。以下分析步驟用于測定順應(yīng)性。除非各論中另有說明，按方法Ⅰ。如果方法不合適，按方法Ⅱ或方法Ⅲ。方法ⅠTLC測試法用于測定任何植物源性物質(zhì)中可能存在的AFB1,AFB2,AFG1和AFG2。乙酸鋅-氯化鋁試劑—用足量的水溶解20g乙酸鋅和5g氯化鋁，定容至100mL。氯化鈉溶液—溶解5g氯化鈉于50mL水中。供試溶液1—研磨約200g植物性樣品至精細的粉末。稱取約50g該粉末狀樣品，精確稱定，置于一具玻璃塞燒瓶中。加入約200mL甲醇-水(17：3)的混合液。用機械方法強烈振搖燒瓶至少30min，并過濾。[注釋—如果溶液干擾植物色素，參照供試溶液2方法處理。]棄除初濾液50mL，并收集續(xù)濾液40mL。將續(xù)濾液轉(zhuǎn)移至一分液漏斗中。加入40mL氯化鈉溶液和25mL正己烷溶劑，振搖1min。靜置使液面分層，分離下層水相至另一分液漏斗中，每次用25mL二氯甲烷萃取分液漏斗中的水相，并振搖1min，萃取2次。每次使液面分層，分離下層有機相，收集合并后的有機相，置于一125mL錐形瓶中。水浴上蒸干有機溶劑。移取剩下的萃取物至合適的試管，水浴蒸干，冷卻殘渣。如果殘渣中有干擾物存在，按照供試溶液2中的凈化步驟處理；否則，用0.2mL氯仿-乙腈(9.8：0.2)混合液溶解上述殘渣，如有需要，用機械方法振蕩溶解。供試溶液2—參照上述流程收集100mL濾液，轉(zhuǎn)移至250mL燒杯中。加入20mL乙酸鋅-氯化鋁試劑和80mL水。攪拌，靜置5min。加入5g適當(dāng)?shù)倪^濾助劑，例如硅藻土，混勻，過濾。棄除初濾液50mL，并收集續(xù)濾液80mL。從“將續(xù)濾液轉(zhuǎn)移至一分液漏斗中”步驟開始按照供試溶液1中的步驟操作。凈化步驟—將多孔介質(zhì)的熱壓結(jié)玻璃盤或者玻璃棉固定在10mm×300mm柱子的底端。將2g硅膠與乙醚-正己烷(3：1)混合液混合制成漿狀液，裝柱，并用5mL乙醚-正己烷(3：1)混合液淋洗柱子，放置使吸收劑沉降。從柱子頂端加入1.5g無水硫酸鈉，形成一薄層。用3mL二氯甲烷溶解上述步驟制備的殘渣，并轉(zhuǎn)移至柱子中，用1mL二氯甲烷洗滌燒瓶2次，將洗滌液也一并轉(zhuǎn)移至柱子中，以不超過1mL/min的流速洗脫柱子；繼續(xù)向柱子中加入3mL正己烷、3mL乙醚和3mL二氯甲烷，以不超過3mL/min的流速洗脫柱子；棄去洗脫液，向柱子中加入6mL二氯甲烷-丙酮混合液(9:1)，以不超過1mL/min的流速洗脫柱子，最好不用真空輔助洗脫。用小瓶收集洗脫液，如有必要，加入沸石，水浴揮干溶劑，殘渣用0.2mL氯仿-乙腈(9.8：0.2)混合液溶解，如有必要，可用機械裝置振搖幫助溶解。供試溶液3—如果殘渣中干擾物仍然存在，按照方法Ⅱ中供試溶液中IAC的凈化步驟操作。黃曲霉毒素溶液—[注意—黃曲霉毒素具有極高毒性。小心操作。]用乙腈稀釋黃曲霉毒素RS1:5，得到AFB1和AFG1的濃度分別為0.4ug/ml，AFB2、和AFG2的濃度分別為0.1ug/ml。步驟—分別將2.5μL、5μL、7.5μL、10μL黃曲霉毒素溶液和3個10μL供試溶液1或者供試溶液2或供試溶液3點在鋪有0.25mm厚色譜硅膠混合物的薄層色譜板(見色譜法<621>)上，在其中一個供試溶液點樣孔中再點5μL黃曲霉毒素溶液。待點樣孔干后，置于裝有氯仿、丙酮、異丙醇(85：10：5)的不飽和層析缸里展開，直到溶劑前沿距原點不小于15cm。將硅膠板從層析缸中取出，標記溶劑前沿，使硅膠板風(fēng)干，在紫外燈365nm處觀察薄層板上的斑點。方法適用性—黃曲霉毒素溶液中的四個成分在板上顯示四個分離的藍色熒光斑點。對于再點加黃曲霉毒素溶液的供試溶液孔，其斑點強度不如相對應(yīng)的黃曲霉毒素溶液孔高?？山邮軜藴省c再點加黃曲霉毒素溶液的孔相比較，其他供試溶液孔中與之對應(yīng)的地方?jīng)]有斑點。如果供試溶液孔顯示黃曲霉毒素斑點，比對各供試溶液的熒光斑點位置與黃曲霉毒素溶液孔的熒光斑點位置，可鑒定該供試液中含有該種黃曲霉毒素。通過比較供試溶液孔與黃曲霉毒素溶液孔中斑點的熒光強度，可以確定供試溶液中黃曲霉毒素的大概濃度。如果各論中要求黃曲霉毒素的順應(yīng)性限量，黃曲霉毒素AFB1不超過5ppb，黃曲霉毒素AFB1，AFB2,AFG1和AFG2之和不超過20ppb，除非另外說明。方法Ⅱ氯化鈉溶液—查看方法Ⅰ。磷酸鹽緩沖溶液—10mM磷酸鹽緩沖溶液的制備：0.138M氯化鈉水溶液和0.0027M氫氧化鈉水溶液混合，2M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.4。免疫親和性柱子（IAC）—條件形成之前先調(diào)節(jié)IAC至室溫。10mL磷酸鹽緩沖溶液在重力作用下2~3mL/min流經(jīng)柱子，使用供試溶液前，在柱子上剩余0.5mL磷酸鹽緩沖溶液。供試溶液—樣品萃取物—精確稱取5g具有代表性的粉末樣品，置于一帶有玻璃塞的燒瓶中。加入20mL甲醇—水（17:3）的混液，用機械方法強烈振搖至少30min，并過濾。棄除5mL初濾液，并收集4mL續(xù)濾液。將續(xù)濾液移至一分液漏斗，加入4mL氯化鈉溶液和2.5mL正己烷溶劑，振搖1min。靜置使液面分層，分離下層水相至另一分液漏斗中，每次用2.5mL二氯甲烷萃取分液漏斗中的水相，并振搖1min，萃取2次。每次使液面分層，分離下層有機相，收集合并后的有機相，置于一50mL錐形瓶中。水浴蒸干有機溶劑。移取剩下的萃取物至合適的試管，水浴蒸干，冷卻殘渣。如果殘渣中有干擾物存在，按照IAC凈化步驟處理；否則，用200μl乙腈溶解上述殘渣，如有需要，用機械方法振搖溶解。IAC凈化步驟—用5mL甲醇—水（60:40）混液溶解殘渣并用5mL水稀釋。樣品萃取物流經(jīng)已優(yōu)化的柱子。用10mL的磷酸鹽緩沖溶液沖洗IAC兩次，并用2mL甲醇緩慢洗脫。充入氮氣使剩余洗脫液蒸發(fā)，并用200μl乙腈溶解殘渣。黃曲霉毒素溶液—[注意—黃曲霉毒素具有極高毒性。小心操作。]用乙腈稀釋一定量的USP黃曲霉毒素RS1:5，得到AFB1和AFG1的濃度分別為0.04ug/ml，AFB2、和AFG2的濃度分別為0.01ug/ml。分析—分別將5μL、7.5μL、10μL黃曲霉毒素溶液和10μL供試溶液點在鋪有200μm厚色譜硅膠混合物的HPTLC(見色譜法<621>)板上，在其中一個供試溶液點樣孔中再點5μL黃曲霉毒素溶液。待點樣孔干后，置于裝有氯仿、丙酮、異丙醇(140：20：0.3)的不飽和層析缸里展開，直到溶劑前沿距原點不小于7.2mm(距板較低邊沿80mm)。將硅膠板從層析缸中取出，標記溶劑前沿，待硅膠板風(fēng)干5min，熒光（>400nm）掃描，紫外燈366nm處觀察薄層板上的斑點。對照黃曲霉毒素溶液鑒別供試溶液中出現(xiàn)的每個斑點對應(yīng)的黃曲霉毒素種類。供試溶液中黃曲霉毒素的濃度可以根據(jù)由黃曲霉溶液的掃描數(shù)據(jù)得到的標準曲線計算得出。方法適用性—黃曲霉毒素溶液中的四個成分在板上顯示四個分離的藍色熒光斑點。對于再點加黃曲霉毒素溶液的供試溶液孔，其斑點強度不如相對應(yīng)的黃曲霉毒素溶液孔高。此方法得到已失效的AFB1和AFG1回收率不低于70%?？山邮軜藴省?dāng)各論中要求黃曲霉毒素的順應(yīng)性限度時，黃曲霉毒素AFB1不超過5ppb，黃曲霉毒素AFB1，AFB2,AFG1和AFG2之和不超過20ppb，除非有另外說明。方法Ⅲ該測試方法被作為實例用于檢測AFB1和總的黃曲霉毒素（AF:AFB1,AFB2,AFG1和AFG2之和）是否存在，并已證明適用于人參和生姜粉末，必須經(jīng)過證明判斷是否適用其他植物源性藥物。0.1M磷酸鹽緩沖溶液—用800mL水溶解8.69g無水磷酸氫二鈉和4.66g無水磷酸二氫鈉或用800mL水溶解5.36g磷酸二氫鈉水合物，再用2M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.4，加入10mL聚山梨酯20，稀釋至1L。磷酸鹽緩沖溶液—按照方法Ⅱ制備。黃曲霉毒素工作標準溶液-根據(jù)表3分別使用10-ml容量瓶制備6個溶液。用甲醇和水（1:1，V/V）稀釋至刻度。儲藏于冰箱，使用前平衡至室溫。當(dāng)天制備溶液。表3各黃曲霉毒素工作標準溶液黃曲霉毒素工作標準溶液USP黃曲霉毒素RS(ul)黃曲霉毒素工作對照溶液最終黃曲霉毒素濃度（ng/ml）AFB1AFB2AFG1AFG210000006250.250.06250.6253250.50.1250.50.1251.2545010.2510.252.5510020.520.556200414110免疫親和性柱子（IAC）2使用一裝有單克隆抗體與AFB1，AFB2，AFG1和AFG2會產(chǎn)生雜交反應(yīng)的免疫親和性柱子。這種免疫親和性柱子對黃曲霉毒素的最小容量不少于100ng，當(dāng)AFB1，AFB2，AFG1和AFG2各5ng混合在10mL10%甲醇的磷酸鹽緩沖溶液（v/v）時，AFB1，AFB2，AFG1和AFG2的回收率不小于80%。供試溶液萃取物—稱取5g具有代表性的試樣于50mL離心管中。加入1g氯化鈉和25mL甲醇和0.5%氫氧化鈉的混液（700:300，v/v）。用渦旋混合器混合，直至樣品微粒和萃取溶劑混合充分。400rpm下振搖10min。7000rpm下離心10min（重力加速度g=5323mm/s2）或以能致使殘渣成堅硬球狀的速度離心。快速用移液管移取7mL上層液體于50mL的離心管，加入28mL0.1M的磷酸鹽緩沖溶液，混勻，并用玻璃微纖維紙過濾。用25mL的量筒收集25mL濾液，并迅速用IAC色譜法分析。IAC的凈化—[注釋—使用前柱子必須保持室溫至少15min。]取下頂部的柱帽，并與貯液器連接；取下底部的柱帽，并與歧管連接（接口處必須緊密）。讓液體流經(jīng)柱子，直到液體離柱床約2~3mm時，貯液器中加入25mL濾液。濾液在重力作用下流經(jīng)柱子，直至流干。為了濾液下一次能容易地在柱子里開始流動，將柱子從歧管上拆下，柱子中加入約2mL的磷酸鹽緩沖溶液，將柱子重新與貯液器連接，另外添加3mL磷酸鹽緩沖液沖洗柱子，然后用5mL水沖洗（如果用其他方法可以驅(qū)趕柱子底部的氣泡并使濾液下一次能容易地在柱子里開始流動，那么5mL磷酸鹽緩沖液可以直接加入柱子的貯液器中。）。待柱子內(nèi)液體流干，用注射器射入3mL空氣。用1mL甲醇洗脫柱子，使洗脫液自由地滴落，并收集在3mL的容量瓶中作為分析物。待柱子內(nèi)液體流干，并保持1min，然后用另外1mL甲醇洗脫，并收集在同一個容量瓶中，待柱子內(nèi)液體流干，射入10mL空氣流經(jīng)柱子，用水稀釋至容量瓶刻度。將收集并稀釋后的洗脫物作為供試溶液，并立即進行黃曲霉毒素分析的操作。系統(tǒng)適用性溶液通過加入5ml黃曲霉毒素工作標準溶液5至一5g樣品中制備加標樣品，對供試溶液重復(fù)此操作，使用20ml替代25ml甲醇和0.5%碳酸氫鈉的混合物（700:300）。色譜條件流速：0.8mL/min檢測：熒光檢測器，激發(fā)波長362nm，發(fā)射波長440nm。柱子：L1填充柱（4.6-nm×15-cm,3μm）。流動相：等度洗脫使用光化學(xué)燈置后衍生化：水，甲醇，乙腈（600：250：150，v/v/v）。使用電化學(xué)溴化燈置后衍生化：1L水，甲醇，乙腈（600:250:15,v/v/v），350mL4M硝酸和120mg溴化鉀的混合溶液。置后衍生化系統(tǒng)—PHREDCELL：使用光化學(xué)燈3置后衍生化。KOBRACELL：使用裝有電化學(xué)溴化燈4置后衍生化。分析黃曲霉毒素的置后衍生化—使用一紫外燈或電化學(xué)溴化燈。進樣50μL試劑空白（黃曲霉毒素標準工作溶液1）黃曲霉毒素標準工作溶液2-6或供試溶液于液相色譜柱中。通過比較標準工作溶液的保留時間辨別供試溶液中黃曲霉毒素的峰。黃曲霉毒素按照AFG2，AFG1，AFB2和AFB1的順序洗脫出來。穿過光化學(xué)燈或電化學(xué)溴化燈后，AFG1和AFB1衍生形成AFG2a（AFG1為衍生物）和AFB2a（AFB1為衍生物）。[注釋—衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)過電化學(xué)溴化作用和光化學(xué)作用后不同。AFB1和AFG1光化學(xué)作用后的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不確定。]使用光化學(xué)燈衍生化后AFG2，AFG2a，AFB2，AFB2a的保留時間大概在14~27min之間；使用電化學(xué)溴化燈衍生化的保留時間更短。峰面積由基線決定，建立每種黃曲霉毒素的標準曲線。通過標準曲線計算供試溶液中各種黃曲霉毒素的濃度。黃曲霉毒素標準曲線—標準曲線根據(jù)包含四種黃曲霉毒素的黃曲霉毒素標準工作溶液建立，為各種黃曲霉毒素做準備。這些溶液包括0.25~4ng/mL的AFB1和AFG1，0.0625~1ng/mL的AFB2和AFG2。在分析前依據(jù)表3建立標準曲線，并驗證曲線的線性。如果測試部分的面積響應(yīng)值超出（較高）曲線范圍，那么供試溶液需要用甲醇和水的混液（1:1，v/v）稀釋并重新測定。系統(tǒng)適用性AFB1(2ug/kg)和黃曲霉毒素總量（5ug/kg）的平均加標回收率分別不得少于68%和70%。AFB1和黃曲霉毒素總量的相對標準偏差（RSD）不得過10%。計算以每種毒素標準溶液的峰面積為y軸，濃度為x軸繪制曲線，確定斜率（S）和截距（a），按照下面的式子計算樣品中毒素的濃度。毒素濃度（μg/kg）={[(R-a)/S]×V/W}×F式中R為供試溶液峰面積；V為供試溶液的最終進樣體積（mL）；F為稀釋因子。當(dāng)V=3mL時F=1。W為1g流經(jīng)免疫親和性柱子的試樣。黃曲霉毒素的總量為AFG2，AFG1，AFB2，AFB1之和。可接受標準如果各論中要求黃曲霉毒素的順應(yīng)性限量，黃曲霉毒素AFB1不超過5ppb，黃曲霉毒素AFB1，AFB2,AFG1和AFG2之和不超過20ppb，除非另外說明。農(nóng)藥殘留分析定義本藥典中所指的農(nóng)藥是指用于阻止、破壞或者控制任何害物的植物或動物的物質(zhì)或物質(zhì)的混合物，這些植物、真菌或動物會在純物品的生產(chǎn)、加工、儲存、運輸或銷售過程中產(chǎn)生危害或干擾這些過程。所指農(nóng)藥包括用作生長調(diào)節(jié)劑，脫葉劑，或干燥劑的物質(zhì)，和用于農(nóng)作物收獲前或后防止在貯存和運輸中變質(zhì)的任何物質(zhì)。限度在美國，許多植物性藥材被作為食品補充劑，根據(jù)聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法案依法供給，這些法案只負責(zé)管理食品而非藥品。食品中的農(nóng)藥限量由美國環(huán)境保護局(EPA)按照聯(lián)邦管理法規(guī)（40CFRPart180）或聯(lián)邦注冊(FR)制定。此外，F(xiàn)DA還設(shè)定了不可避免農(nóng)藥殘留的活動水平（21CFR109和209部分）。對于農(nóng)藥化學(xué)藥品如果EPA沒有設(shè)置容許量或FDA未設(shè)定活動水平，其殘留應(yīng)低于指定方法的檢出限。如果其結(jié)果小于EPA測定的，其限量值為0。在美國，當(dāng)植物源性藥品注明用于食品時，這里所包含的限量不能適用。然而，這里所包含的限量也許能使用于允許這些農(nóng)藥殘留的其他國家。除非各論中另有說明，所測物質(zhì)中含有的任何農(nóng)藥的數(shù)量不得高于表4所列限度。對于沒有列于表4中，而由于某些原因懷疑其存在的農(nóng)藥，其限度必須符合EPA中規(guī)定。如果表4和EPA規(guī)定中未列出農(nóng)藥的限量，按下式計算其限量：限度（mg/kg）=AM/100B式中，A為每日允許攝入量(ADI)，發(fā)布于FAO-WHO，mg/(kg體重)；M為體重，kg（60kg）；B為該物質(zhì)的每日攝入量，kg。如果該物質(zhì)是用來制備提取物、酊劑或者其他藥物形式，則應(yīng)根據(jù)其制備方法的差異修正成品中農(nóng)藥的含量，按以下公式計算其限量：限度（mg/kg）=AME/100B式中E為農(nóng)藥對應(yīng)制備方法的萃取因子，以植物原料中農(nóng)藥殘留量和最終制劑中農(nóng)藥殘留量的比值方式由實驗確定；B為該制劑的每日攝入量，kg，A和M的含義同上。若該批產(chǎn)品預(yù)處理的全部歷史（所用農(nóng)藥的性質(zhì)、數(shù)量、種植過過程中和采收后每次預(yù)處理的日期）一致，并且可根據(jù)良好種植和采集生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GACP）進行精確復(fù)查，那么該檢測的全部或部分免除是可以被允許的。 表4 物質(zhì)限度（mg/kg）Acephate乙酰甲胺磷0.1Alachlor甲草胺0.05Aldrinanddieldrin(sumof)艾氏劑和狄氏劑(總計)0.05Azinphos-ethyl谷硫磷0.1Azinphos-methyl谷速松1Bromide,inorganic(calculatedasbromideion)無機溴(以溴離子計)125Bromophos-ethyl溴硫磷0.05Bromophos-methyl甲基溴磷松0.05Bromopropylate溴螨酯3Chlordane(sumofcis-,trans-andoxychlordane)氯丹(以其順式、反式和氧化氯丹的總和計)0.05Chlrofenvinphos毒蟲畏0.5Chlorpyriphos-ethyl氯蜱硫磷0.2Chlorpyriphos-methyl甲基陶斯松0.1Chlorthal-dimethyl氯酞酸甲酯0.01Cyfluthrin氟氯氰菊酯（總計）0.1λ-Cyhalothrinλ-格林奈1Cypermethrinandisomers(sumof)氯氰菊酯及其同分異構(gòu)體（總和）1DDT(sumofo,p’-DDE,p,p’-DDE,o,p’-DDT,p,p’-DDT,o,p’-TDE,p,p’TDE)DDT(以o,p’-DDE,p,p’-DDE,o,p’-DDT,p,p’-DDT,o,p’-TDE,p,p’TDE的總和計)1Deltamethrin溴氰菊酯0.5Diazinon二嗪農(nóng)0.5Dichlofluanid抑菌靈0.1Dichlorvos敵敵畏1Dicofol三氯殺螨醇0.5Dimethoateandomethoate(sumof)樂果和氧(化)樂果（總計）0.1Dithiocarbamates(expressedadCS2)二硫代氨基甲酸鹽類（以CS2形式）2Endosulfan(sumofisomersandendosulfansulphate)硫丹（以其同分異構(gòu)體及其硫酸鹽的總和計）3Endrin異狄氏劑0.05Ethion乙硫磷2Etrimphos乙嘧硫磷0.05Fenchlorophos(sumoffenchlorophosandfenchlorophos-oxon)(以皮蠅磷及其氧化物的總和計)0.1Fennitrothion殺螟松0.5Fenpropathrin甲氰菊酯0.03Fensulfothion(sumoffensulfothion,fensulfothion-oxon,fensulfothion-oxonsulfon,andfensulfothionsulfon)豐索磷（以豐索磷、豐索磷-oxon、豐索磷-oxonsulfon及豐索磷-sulfon的總和計）0.05Fenthion(sumoffenthion,fenthion-oxon,fenthion-oxonsulfone,fenthion-oxonsulfoxid,fenthionsulfoneandfenthion-sulfoxide)倍硫磷(以倍硫磷，倍硫磷-oxon，倍硫磷-oxonsulfone，倍硫磷-oxonsulfoxide，倍硫磷砜和倍硫磷-sulfoxide總和計)0.05Fenvalerate氰戊菊酯1.5Flucythrinate氟氰戊菊酯0.05τ-Fluvalinateτ-氟胺氰菊酯0.05Fonophos地蟲磷0.05He