(高清版)DB22∕T 2050-2014 動物源性飼料中豬源性成分測定實(shí)時熒光PCR方法

Determinationofporcinederivedmaterialsinanimal-orig2014-02-28發(fā)布2014-04-30實(shí)施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院、國家農(nóng)業(yè)深加工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心、中華人民共和國吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：史艷宇、劉金華、華蕾、王瀟、亓?xí)云G、王穎、冷喜芳、吳桐、陳穎。1動物源性飼料中豬源性成分測定實(shí)時熒光PCR方法1范圍件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測3術(shù)語和定義5試劑2a)上游引物：5'-CATGCGTATC5.3dNTP:dATP(deoxyadenosinetriphosphate,脫氧腺苷三磷酸)、dGTP(deoxycytidinetriphosphate,脫氧鳥苷三磷酸)、dCTP(deoxycytidinetriphosphate,脫氧胞苷三磷酸)、dTTP(deoxythymidinetriphosphate,脫氧胸苷三磷酸)。5.4動物基因組DNA提取純化試劑盒。5.5RNaseA酶：凍干品，不含DNase。5.775%乙醇、異丙醇、三氯甲烷、異戊醇、正己烷等有機(jī)試劑。5.9三羥甲基氨基甲烷(Tris)。5.11十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrithylammoniumbromide,CTAB)。5.12乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA-Na?·2H?O)。5.1310×PCR緩沖液：含200mmol/LTris-HCI(pH8.4),200mmol/L氯化鉀(KC1),15mmol/L氯5.16乙酸鈉溶液，3mol/L:在8到5.2,用水定容到100mL,分裝后高壓滅菌。5.17Tris-HCI,1mol/L,pH8.0:在800mL去離子水中溶解121.1gTris,冷卻至室溫后用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0,加水定容至1L,分裝后高壓滅菌。5.18EDTA,0.5mol/L,pH8.0:稱取186.1gEDTA-Na?·2H?O,加入700mL水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值至8.0,用水定容到1L,分裝后高壓滅菌。5.19CTAB提取緩沖液I:在800mL去離子水中加入46.75g氯化鈉，溶解后加入1mol/LTris-HCI(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0,用水定容至1L,分裝后高壓滅菌。5.20CTAB提取緩沖液Ⅱ:在800mL去離子水中加入46.75g氯化鈉，20gCTAB,完全溶解后加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)50mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL,用水定容至1L,分裝后高壓滅菌。5.23TE緩沖液(pH8.0):在800mL水中，依次加入10mL的1mol/LTris-HCl(pH8.0)和2mL的0.5mol/LEDTA(pH8.0),用水定容到1L,分裝后高壓滅菌。36.1實(shí)時熒光PCR儀。7檢測步驟5μL~25μL蛋白酶K溶液，上下倒轉(zhuǎn)混勻，37℃水浴中保溫1h,中途每隔10min左右倒轉(zhuǎn)混合數(shù)次；和三氯甲烷+異戊醇(24+1)抽提三次，12000r/min離心10min;將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的2mL離心管液(預(yù)先加熱至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存?zhèn)溆?。取油脂飼料適量(液態(tài)油取30mL、磷Tris飽和苯酚+三氯甲烷(1+1),輕緩顛倒混勻溶液；12000r/min離心10min,取上清液，加入與上清液等體積三氯甲烷+異戊醇(24+1),輕緩顛倒混勻，12000r/min離心2min至分層；將上清液轉(zhuǎn)移至于100μLTE緩沖液(預(yù)先加熱至65℃有利于溶解DNA)中，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3試劑盒法4…c——DNA濃度，單位為納克每微升(ng/uL);N——核酸稀釋倍數(shù)。7.4實(shí)時熒光PCR檢驗(yàn)7.4.1實(shí)時熒光PCR反應(yīng)體系10×PCR緩沖液dNTP溶液(10mmol/L)TaqDNA聚合酶(5U/μL)上游引物(10μmol/L)DNA模板(10ng/μL-50ng/μL)反應(yīng)產(chǎn)物可在4℃保存。檢測過程中設(shè)置PCR擴(kuò)增空白對照、陰性對照和陽性對照。用已知含有豬8結(jié)果判斷與表述5——空白對照：無擴(kuò)增曲線，Ct值≥40.0;——陰性對照：無擴(kuò)增曲線，Ct值≥40.0;——陽性對照：出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)≤35.0;否則，視為無效。8.2結(jié)果判定和報(bào)告：——Ct值≥40.0,可判定樣品不含有豬源性成分，可直接報(bào)告未檢出豬源性成分。——Ct值≤35.0,可判定該樣品含有豬源性成分，報(bào)告檢出豬源性成分。