細胞培養(yǎng)的知識

細胞培養(yǎng)的知識細胞培養(yǎng)的知識細胞培養(yǎng)的知識xxx公司細胞培養(yǎng)的知識文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設(shè)計，管理制度細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境、常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒(2008-08-2311:00:58)標簽：細胞培養(yǎng)

無菌環(huán)境

常用

培養(yǎng)器皿

清洗

消毒

雜談

細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

一、無菌室

無菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。

無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態(tài)，經(jīng)常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2h），每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2h）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。實際工作中，要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。

此外，還應(yīng)注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括：送入無菌室的風(fēng)沒有被過濾除菌；進出無菌室時，能使外界空氣直接對流進無菌室的操作間；等。

二、超凈工作臺

工作原理：鼓風(fēng)機驅(qū)動空氣通過高效過濾器得以凈化，凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細菌甚至病毒顆粒帶走，使工作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺的流動方向不同，可將超凈工作臺分為側(cè)流式、直流式和外流式三種類型。

超凈臺的使用與保養(yǎng)：超凈臺的平均風(fēng)速保持在為宜，過大、過小均不利于保持凈化度；使用前最好開啟超凈臺內(nèi)紫外燈照射10－30min，然后讓超凈臺預(yù)工作10－15min，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài)；使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。

常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒

細胞培養(yǎng)需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此掌握清洗、消毒知識，學(xué)會清洗、消毒方法是從事細胞培養(yǎng)工作必須的。

一、清洗

離體條件下，有害物質(zhì)直接同細胞接觸，細胞對任何有害物質(zhì)十分敏感，極少殘留物都可以對細胞產(chǎn)生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必須認真清洗，達到不含任何殘留物的要求。

（一）玻璃器皿的清洗一般經(jīng)過浸泡、刷洗、浸酸、和清洗4個步驟。

1.浸泡:新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前得先用自來水簡單刷洗，然后用5％鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質(zhì)和油脂，干涸后不易刷洗掉，故用后應(yīng)立即浸入清水中備刷洗。

2.刷洗:將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復(fù)刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿表面的光潔度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。

3.浸酸:浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強氧化作用清除器皿表面的可能殘留物質(zhì)。浸酸不應(yīng)少于6h，一般過夜或更長。放取器皿要小心。

4.沖洗:刷洗和浸酸后的器皿都必須用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響到細胞培養(yǎng)的成敗。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水－倒空”15次以上，最后用重蒸水浸洗2－3次，晾干或烘干后包裝備用。

（二）橡膠制品清洗

新的橡膠制品洗滌方法：LNaOH煮沸15min，流水沖洗，LHCl煮沸15min，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20min，50℃烤干備用。

（三）塑料制品的清洗

塑料制品特點：質(zhì)軟、易出現(xiàn)劃痕；耐腐蝕能力強、但不耐熱。

清洗程序：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（15－20遍）,蒸餾水浸洗3次，雙蒸水泡24h，晾干備用。

（四）包裝:對細胞培養(yǎng)用品進行消毒前，要進行嚴密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培養(yǎng)皿等，近幾年用鋁箔包裝，非常方便，適用。培養(yǎng)皿、注射器、金屬器械等用牛皮紙包裝后再裝入飯盒內(nèi)，較大的器皿可以進行局部包扎。

二、消毒和滅菌微生物污染是造成細胞培養(yǎng)失敗的主要原因

（一）物理消毒法

1.紫外線消毒:紫外線是一種低能量的電磁輻射，可殺死多種微生物。革蘭陰性菌最為敏感，其次是陽性菌，再次為芽孢，真菌孢子的抵抗力最強。紫外線的直接作用是通過破壞微生物的核酸及蛋白質(zhì)等而使其滅活，間接作用是通過紫外線照射產(chǎn)生的臭氧殺死微生物。直接照射培養(yǎng)室消毒，用法簡單，效果好。

紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照射劑量呈正相關(guān)，輻射強度隨燈距離增加而降低，照射劑量和照射時間呈正比。因此紫外燈同被照射物的距離和照射時間要適合。離地面2m的30W燈可照射9平方米房間，每天照射2－3h，期間可間隔30min。燈管離地面2米以外要延長照射時間，照射效果較差。紫外燈照射工作臺的距離不應(yīng)超過，照射時間30min為宜。

紫外燈不僅對皮膚、眼睛傷害，且對培養(yǎng)細胞與試劑等也產(chǎn)生不良影響，因此，不要開著紫外等操作。

2.高溫濕熱滅菌:壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法。對生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培養(yǎng)液都可以用這方法滅菌。

不同壓力蒸汽所達到的溫度不同，不同消毒物品所需的有效消毒壓力和時間不同。從壓力蒸汽消毒器中取出消毒好的物品（不包括液體），應(yīng)立即放到60-70℃烤箱內(nèi)烘干，再貯存?zhèn)溆茫駝t，潮濕的包裝物品表面容易為微生物污染。煮沸消毒也是常用的濕熱消毒方法，它具有條件簡單、使用方便等特點。

3.高溫干熱消毒:干熱滅菌主要是將電熱烤箱內(nèi)物品加熱到160℃以上，并保持90－120min，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿（如體積較大的燒杯、培養(yǎng)瓶）、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品（如粉劑、油劑）。

干熱滅菌后要關(guān)掉開關(guān)并使物品逐漸冷卻后在打開，切忌立即打開，以免溫度驟變而使箱內(nèi)的玻璃器皿破裂。干烤箱內(nèi)物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。

燒灼也是滅菌方法之一，常利用臺面上的酒精燈的火焰對金屬器皿及玻璃器皿口緣進行燒灼消毒。

4.過濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而達到除菌目的。在體外培養(yǎng)時，過濾除菌大多用于遇熱容易變性而失效的試劑或培養(yǎng)液。目前，大多實驗室采用微孔濾膜濾器除菌。關(guān)鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。

（二）化學(xué)消毒：新潔而滅，其％水溶液可對器械、皮膚、操作表面進行擦拭和浸泡消毒。

（三）抗生素消毒：抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預(yù)防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應(yīng)根據(jù)需要選擇。

可用于細胞培養(yǎng)的消毒滅菌方法很多，但每種方法都有一定的適應(yīng)范圍。如常用的過濾除菌系統(tǒng)、紫外照射、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒實驗室空氣；多用新潔而滅消毒實驗室地面；常用干熱、濕熱消毒劑浸泡、紫外照射等方法消毒培養(yǎng)用器皿；采用高壓蒸汽滅菌或過濾除菌方法消毒培養(yǎng)液。

細胞培養(yǎng)時的無菌操作及工作常規(guī)

一、無菌操作

1、實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30～60分鐘滅菌，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實驗操作。

每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。

2、無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。

實驗人員用%過氧乙酸水泡手，擦干。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。

3、點燃酒精燈，小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。水平式風(fēng)機的超凈臺，容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，應(yīng)盡量避免瓶口敞開直立。使用的吸管，滴管，試管，培養(yǎng)瓶等均事先滅菌。打開各類瓶蓋前先過火，以固定灰塵；打開的瓶口、試管口過火焰，鑷子使用前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼。

同一根吸管或滴管不應(yīng)連續(xù)用于幾個不同的細胞系；吸取培養(yǎng)基的吸管應(yīng)離開培養(yǎng)瓶或試管口，避免伸入培養(yǎng)瓶口或試管口；以防止細胞系的互相混雜污染。漏在培養(yǎng)瓶上或臺上的液體，立即用酒精棉球擦凈。

4、工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣、手套和帽子后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少ClassII)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5、定期檢測下列項目：①CO2鋼瓶之CO2壓力；②CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)；③無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時/HEPA)。

6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定期更換水槽的水。

二、實驗用品

1、種類：①細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteurpipet外，其它均為塑料無菌制品。②TC級培養(yǎng)盤表面均有coating高分子物質(zhì)以讓細胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask，plates，dishes，rollerbottle等，依實驗需要使用。③plasticsterilepipet:1ml，2ml，5ml，10ml，25ml。④塑料離心管:15ml，50ml，均有2種不同材質(zhì)，其中polypropylene(PP)為不透明材質(zhì)，polystyrene(PS)為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。⑤glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。⑥玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml，250ml，500ml，1000ml。

三、清洗

1、玻璃器皿的清洗

一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟。清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。

（1）浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新購玻璃瓶使用前應(yīng)先用自來水簡單刷洗，然后用稀鹽酸液（～HCl）浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿，用后要立即完全浸入水中，不能留有氣泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗后的玻璃器皿要用鼓風(fēng)干燥箱干燥。

（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱為浸酸。清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應(yīng)少于6小時。清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強度，常用的下列三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）（A）強清潔液63∶1000∶200000（B）次強清洗液120∶200∶1000（C）弱清潔液100∶100∶100。清潔液配制時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。

（4）沖洗：浸酸后必須用水充分沖洗。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每次水須灌滿及倒干凈（流水過夜），然后用蒸餾水清洗3-5次，晾干備用（用鼓風(fēng)干燥箱干燥）。

2、膠塞的清洗

細胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH煮沸10～20分鐘。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10～20分鐘，晾干備用。

3、金屬用品的清洗

先用自來水反復(fù)刷洗或沖洗，然后用蒸餾水浸泡。

四、滅菌

1、實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃，15lb，20分鐘，置于oven中烘干。

2、實驗用玻璃pasteurpipet以干熱滅菌170℃，4小時。

3、液體或是固體廢棄物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高壓滅菌121℃，15lb，20分鐘處理。體外細胞培養(yǎng)一般過程(2008-08-2309:24:57)標簽：細胞培養(yǎng)

細胞分化

體內(nèi)外細胞

差異

培養(yǎng)方法

雜談

體外培養(yǎng)的概念

體外培養(yǎng)（invitroculture），就是將活體結(jié)構(gòu)成分或活的個體從體內(nèi)或其寄生體內(nèi)取出，放在類似于體內(nèi)生存環(huán)境的體外環(huán)境中，讓其生長和發(fā)育的方法。

●組織培養(yǎng)：是指從生物體內(nèi)取出活的組織（多指組織塊）在體外進行培養(yǎng)的方法。

●細胞培養(yǎng)：是指將活細胞（尤其是分散的細胞）在體外進行培養(yǎng)的方法。

●器官培養(yǎng)：是指從生物體內(nèi)取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在體外進行培養(yǎng)的方法。

體內(nèi)、外細胞的差異和分化

1.差異：細胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。因此，培養(yǎng)中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。

2.分化：體外培養(yǎng)的細胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的改變，細胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細胞是否表現(xiàn)分化,關(guān)鍵在于是否存在使細胞分化的條件，如Friend細胞（小鼠紅白血病細胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內(nèi)皮細胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結(jié)構(gòu)，雜交瘤細胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體，這些均屬于細胞分化行為。

細胞培養(yǎng)的一般過程

一、準備工作

準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實驗失敗或無法進行。準備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試。

二、取材

在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗?zāi)康亩ǎ?，?jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。

理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應(yīng)嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。

三、培養(yǎng)

將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進行細胞計數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細胞進入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細胞盡早進入生長狀態(tài)。

正在培養(yǎng)中的細胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。

原代培養(yǎng)一般有一段潛伏期（數(shù)小時到數(shù)十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。

四、凍存及復(fù)蘇

為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。

凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。

五、常用儀器設(shè)備

無菌室,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)器具，CO2培養(yǎng)箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機,無菌過濾器,洗刷裝置,細胞計數(shù)板和電子細胞技術(shù)儀等等。細胞、組織培養(yǎng)大中一、組織培養(yǎng)的基本概念

Tissueculture:從體內(nèi)取出組織摹擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度、和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。

體外培養(yǎng)

細胞培養(yǎng)目的與用途

1、科學(xué)研究：藥物研究開發(fā)與基礎(chǔ)研究

(1)新藥篩選：(2)疫苗研究與開發(fā)：(3)基因工程藥物研究與開發(fā)：(4)細胞工程藥物研究與開發(fā)：(5)單克隆抗體制備：藥物作用機理基因功能(7)疾病發(fā)生機理

2、生物制藥

(1)疫苗生產(chǎn)：(2)基因工程藥物生產(chǎn)：(3)診斷用和藥用單克隆抗體生產(chǎn)

(4)細胞工程藥物生產(chǎn)：

對組織培養(yǎng)的評價

優(yōu)點：1、直接觀察活細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動。2、便于用各種不同技術(shù)方法研究細胞。3、培養(yǎng)細胞攜帶有與體內(nèi)細胞同等的基因組，廣泛用于分子生物學(xué)和基因工程研究。4、同時提供大量的生物學(xué)性狀相似的實驗對象。

不足：利用培養(yǎng)細胞做實驗對象時，不應(yīng)視為與體內(nèi)細胞一樣。

組織培養(yǎng)的發(fā)展簡史

1、早期組織培養(yǎng):Roux（1885）用溫NS培養(yǎng)雞胚。Jolly(1903)用蓋片懸滴法培養(yǎng)蠑螈白細胞。BeebeandEwing(1906)培養(yǎng)狗淋巴細胞。

2、現(xiàn)代組織培養(yǎng)：Harrison(1907)andCarrel(1912)開始，Harrison培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織。Carrel培養(yǎng)了雞胚心肌組織。

3從50年代起，組織培養(yǎng)技術(shù)快速發(fā)展。試管培養(yǎng)

組織培養(yǎng)細胞生物學(xué)

一、體內(nèi)外細胞的差異

“反祖”（Atavism)現(xiàn)象：細胞失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)、分化減弱或不顯；表現(xiàn)為細胞趨于單一化，或獲得永生性，或變成具有惡性性狀的細胞群。

二、培養(yǎng)細胞的分化

1、不適應(yīng)（deadaption)細胞在原體內(nèi)時所擁有的分化特征減弱或不顯。（培養(yǎng)的肝細胞酪氨酸轉(zhuǎn)移酶特性喪失）

2、脫分化或去分化（Dedifferentiation):細胞失掉發(fā)生分化的能力（培養(yǎng)的肝細胞失掉儲存肝糖原能力）

培養(yǎng)細胞在體外生存時間與其分化能力呈反向關(guān)系。

細胞分化的關(guān)鍵在于是否存在有誘導(dǎo)細胞發(fā)生分化的因子。

培養(yǎng)細胞的形態(tài)分類

分為貼附型和懸浮型兩大類

（一）貼附型

1、成纖維型細胞：心肌細胞、平滑肌、血管內(nèi)皮細胞等

2、上皮型細胞

3、游走型細胞

4、多形型細胞

培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程

（一）組織培養(yǎng)細胞生命期：原代培養(yǎng)期

傳代期衰退期

原代培養(yǎng)（primaryCulture)從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段。細胞群是異質(zhì)的，細胞相互依賴性強。細胞獨立生存性差。

傳代培養(yǎng)：當(dāng)細胞增殖達到一定密度后，需要分離出一部分細胞和更新培養(yǎng)液，繼續(xù)接種進行培養(yǎng)。這一過程稱為傳代。否則將影響細胞的繼續(xù)生存。

細胞系（cellline)：初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后，稱做細胞系。

無限細胞系：細胞獲永久性增殖能力。核型大多變成異倍體。

克隆形成率（CloningEfficiency)：細胞被稀釋分散成單個細胞進行培養(yǎng)時，形成細胞小群（克?。┑陌俜謹?shù)。

克隆細胞株:從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法,由單細胞增殖形成的細胞群.

（二）組織培養(yǎng)細胞一代生存期

1、潛伏期（Latentphase):細胞從懸浮狀態(tài)貼附于底物表面上。原代培養(yǎng)細胞貼附慢（10-24h）。連續(xù)細胞系貼附快（10-30min)。

細胞貼附受多種因素影響

（1）支持物：底物表面要清潔，底物表面有陽性電荷有利于細胞貼壁。

（2）一些特殊物質(zhì)的存在：血清

2指數(shù)增生期：細胞增殖最旺盛，細胞分裂相增多。是細胞一代中活力最好的時期，是進行各種實驗最好和最主要的階段。持續(xù)3-5天。

細胞分裂指數(shù)（MitoticIndex,MI)：細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù).

3、停滯期：細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞停止增殖。

培養(yǎng)細胞生存環(huán)境、條件和代謝

一、無污染環(huán)境

二、溫度：

三、氣體環(huán)境和pH

四、培養(yǎng)細胞生存所需基本物質(zhì)

1、糖2、氨基酸3、各種維生素

4、促生長因子*：血清*

5、其他物質(zhì)

五、滲透壓

培養(yǎng)基*

合成培養(yǎng)基（SyntheticMedium)

天然培養(yǎng)基（NaturalMedium)

血清，以牛血清和馬血清為最常用。血清內(nèi)含有多種促細胞生長因子，促貼壁因子及其它活性物質(zhì)等。

一般需加10%-20%。

附著底物：

1、玻璃

2、一次性聚氯乙烯材料

3、飼細胞（Feedercell)

用成纖維細胞或其他細胞長成單層后，再用大劑量射線照射，使細胞失去增殖能力但尚存活和有代謝功能。將特殊難培養(yǎng)的細胞接種于其上。

體外培養(yǎng)細胞成功率分析

成功的關(guān)鍵:培養(yǎng)物必須貼附在底物上

細胞生長和增殖

一、組織和細胞的供體年齡

二、培養(yǎng)條件

三、貼附底物

四、培養(yǎng)方法：酶消化分離

組織培養(yǎng)設(shè)施和基本條件

實驗室設(shè)計

細胞培養(yǎng)是一種無菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養(yǎng)室和設(shè)計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細胞培養(yǎng)室的設(shè)計原則一般是無菌。操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。

常用設(shè)施及設(shè)備

（1）超凈工作臺：。

（2）無菌操作間：一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作

臺及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及

消毒好的無菌物品等。

（3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物

（4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。

（5）分析間：顯微鏡、計算機及打印機等。

培養(yǎng)器皿

常用的器皿有下面幾種。

（1）液體儲存瓶：用于儲存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常用規(guī)格有500ml、250ml、100ml。

（2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，規(guī)格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等幾種

（3）培養(yǎng)皿：用于開放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm

（4）培養(yǎng)板

培養(yǎng)用液

平衡鹽溶液（BalancedSaltSolution,BSS)

天然培養(yǎng)基(NaturalMedium)

合成培養(yǎng)基(SyntheticMedium)

Hanks’平衡鹽溶液（Hanks’BalancedSaltSolutions，HBSS）

成分含量（g/L）

CaCl2(無水氯化鈣)

KCl

KH2PO4

MgCl2·6H2O

MgSO4·7H2O

NaCl

NaCO3

Na2HPO4

D-Glucose

PhenolRed

鈣鎂有促使細胞凝聚作用,配制離散細胞用的消化液和細胞洗滌液時,宜采用D-Hanks

天然培養(yǎng)基

血清細胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清

熱滅活是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會影響血清的質(zhì)量

合成培養(yǎng)基

一、種類

RPMI1640：適用于很多細胞的生長，特別是血液細胞。

DMEM（Dulbecco’minimumessentialmedium)(高糖和低糖）低糖對腫瘤細胞有力。

HamF12和Mc-Coy5A多用于難培養(yǎng)的細胞。

合成培養(yǎng)基的成分：

1、氨基酸2、碳水化合物3、維生素

4、無機離子

5其它成分：在雜交瘤技術(shù)中，常在DMEM培養(yǎng)基中加入2-巰基乙醇（2-Me).2-Me對細胞的生長有非常重要的作用，能誘導(dǎo)細胞增殖。常配成儲存液，用時每升培養(yǎng)液加.

培養(yǎng)液的配制

1、玻璃三蒸餾水

2、把干粉加入溫（15-30度）水中，攪拌使其溶解；

3、加NaHCO3;

4、加水至終量

5、用mm微孔濾膜濾過消毒。

其它常用液

消化液：分離組織和分散細胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液?？梢詥为毷褂茫部梢曰旌鲜褂?。

1）胰蛋白酶溶液

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是一種黃白色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗干燥處保存

胰酶的主要作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解，使細胞相互離散。胰酶對細胞的分離作用與細胞的種類和細胞的特性有密切關(guān)系。一般來講，胰酶濃度大、作用溫度高、作用時間長，對細胞分離能力也大，但超過一定的限度會損傷細胞。胰酶溶液在，溫度為37℃時，作用能力最強。注意：鈣離子、鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks’平衡鹽溶液配制成%溶液。

胰蛋白酶溶液配制：

（1）稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許D-Hanks平衡鹽溶液（左右）調(diào)成糊狀，然后再補足D-Hanks平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰箱過夜，并不斷攪拌振蕩；

（2）次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存?zhèn)溆?，常用濃度?或%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調(diào)用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH至左右。

保存條件：-20℃冰箱中，以免分解失效。

EDTA·4Na溶液

EDTA是一種化學(xué)螯合劑，對細胞有一定的離觧作用，而且毒性小。

常用工作液濃度為%。通常與%的胰蛋白酶溶液按1：1混合使用（混合液）。

注意：使用EDTA處理細胞后，一定要用Hanks液沖洗干凈，因殘留的EDTA會影響

細胞生長。

EDTA溶液配制：用無鈣、鎂的D-HBSS平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，

室溫或4℃冰箱保存。

胰蛋白酶–EDTA·4Na溶液

（%胰蛋白酶,EDTA·4Na）

胰蛋白酶＋·4Na＋1LD-HBSS。-20℃冰箱中保存。

pH調(diào)整液

（1）NaHCO3溶液

常用濃度為%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌，分裝，4℃冰箱或室溫保存。

當(dāng)pH值超過后，可用高壓滅菌的10％醋酸溶液或通入CO2氣體方法調(diào)節(jié)。

（2）HEPES（分子量）溶液

HEPES使用終濃度一般為10-50mM,但通常配成1M儲存液：用200ml雙蒸水溶解

克HEPES，用1NNaOH調(diào)節(jié)pH至然后過濾除菌，分裝小瓶，室溫或4℃保存。

抗生素溶液：

青霉素100單位/ml培養(yǎng)液

鏈霉素100mg/ml培養(yǎng)液

玻璃器皿的清洗

玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個步驟

（1）浸泡：需先用清水浸泡。然后用稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。

（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的

雜質(zhì)。刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度。

（3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過程稱

為浸酸。清潔液去污能力很強。是清洗過程中關(guān)鍵的一環(huán)。浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器露出清潔液面。浸泡時間一般為過夜，不應(yīng)少于6小時。

清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強度，常用的下列三種：重鉻酸鉀（g）濃硫酸（ml）蒸餾水（ml）

（A）強清潔液63∶1000∶200000

（B）次強清洗液120∶200∶1000

（C）弱清潔液100∶100∶100。

配制過程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)。

清潔液配制時應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護好面部及身體裸露部分。

（4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸后都必須用水充分沖洗。

膠塞的清洗

細胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。自來水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20分鐘，晾干備用。

塑料制品的清洗

必要時用2%NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，

最后用自來水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。

消毒

消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線、濕熱、干烤、過濾等），化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消毒劑）和抗生素。

（1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺表面和不能使用其它法進行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線

直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時間照射后，可以消滅空氣中大部分細菌，培養(yǎng)室紫外

線燈應(yīng)距地面不超過米，且消毒物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。

（2）溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀荆瑴責(zé)嵯緯r，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬危險，保證其內(nèi)氣體的流通。

在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣

閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼后開始升壓，當(dāng)達到所需壓力時，開始記算消毒時間。

常用物品消毒壓力及時間：

培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃,15磅,20分鐘；

布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先121℃,15磅,20分鐘，然后在烘箱中烘干；

。

（3）干熱消毒：玻璃瓶，干熱滅菌170℃,4小時

（4）濾過消毒：

（4）化學(xué)消毒法：最常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺表面及無菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。

基本培養(yǎng)技術(shù)

一、培養(yǎng)操作基本要領(lǐng)和要求

1、無菌操作

2、培養(yǎng)前準備

（1）操作野消毒

（2）洗手和著裝

（3）火焰消毒

3、培養(yǎng)操作

基本培養(yǎng)操作技術(shù)

（一）取材

（二）組織的分離

1、離心分離法：培養(yǎng)物為血液、腹水、羊水等可采用離心分離法

在分離淋巴細胞進行培養(yǎng)時可采用分層液進行分離。

2、機械分離法

（1）切割分離法

（2）機械分散法

*3消化分離法

（1）胰蛋白酶消化法

濃度常用%,C消化.37

(2)膠原酶消化法

適用于消化纖維組織、上皮組織以及癌組織等，不受鈣鎂離子的影響，終濃度常為

(3)EDTA消化法

(三)細胞計數(shù)法

(四)細胞的凍存

冷凍保存要點：（1）冷凍過程要緩慢。需要冷凍保存的細胞先在4℃冰箱中放置30－60分

鐘；然后轉(zhuǎn)入-20℃，放置30分鐘；然后再轉(zhuǎn)入-80℃放置16－18小時（或過夜）；最后放

入液氮中長期保存。有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1到-3℃速度降溫，一直

到-80℃以下，然后直接放入液氮中長期保存。

（2）凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。

（3）細胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。

（4）使用高濃度血清或蛋白保護劑。一般情況下，用于冷凍保存完全細胞生長培養(yǎng)液中血

清濃度大于20％。

（5）使用合適的細胞冷凍保護劑，以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前，最常用

的冷凍保護劑是DMSO(二甲基亞砜)，使用終濃度為5－10％。但是，有些細胞系不能用DMSO作為冷凍保護劑，如人白血病細胞系HL-60。因為，DMSO能誘導(dǎo)HL-60細胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護劑，如甘油（glycele）,羥乙基淀粉等。

特別注意：（1）細胞在冷凍過程中在-20℃冰箱內(nèi)放置時間不可超過1小時，以防止冰晶過大而破壞細胞。也可跳過-20℃這一步驟直接放入-80℃冰箱中，但這樣做細胞存活率要低一些。

（2）DMSO稀釋時會釋放大量熱量。因此，DMSO不能直接加到細胞液中，必須事先配制。

（3）DMSO必須是細胞培養(yǎng)級別的。新買的DMSO本身處于無菌狀態(tài)，第一次開瓶后應(yīng)

立即少量分裝于無菌試管或瓶中，4℃保存。避免反復(fù)凍融造成DMSO裂解產(chǎn)生有害物質(zhì)。并可減少污染機會。如要過濾DMSO，必須選用耐DMSO的尼龍濾膜。

細胞冷凍保存液主要成分：冷凍劑，基礎(chǔ)培養(yǎng)液，血清或蛋白。

常用細胞冷凍保存液：（1）10％DMSO＋完全細胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

（2）10％甘油＋完全細胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

操作程序

(1)細胞:選對數(shù)生長期的細胞

(2)計數(shù):細胞密度5106/ml

(3)凍存液培養(yǎng)液9份+DMSO1份加入細胞內(nèi)

(4)分裝:每安瓶.

(5)封口

凍存

細胞解凍與復(fù)蘇

冷凍保存細胞的解凍與復(fù)蘇要點：（1）快速解凍。凍存細胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入

37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3分鐘）。

（2）解凍操作過程動作要輕。由于冷凍保存過的細胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，

而且動作要輕。

。一般情況下，解凍后的細胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)（1ml凍存細胞液加入到25－30ml新鮮完全培養(yǎng)液中），24小時后再用新鮮完全培養(yǎng)替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。如果細胞對冷凍保護劑特別敏感，那么，解凍后的細胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。

特別注意：（1）解凍時務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。，要帶手套，用鑷子將細胞冷凍管

從液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免凍傷。

（2）冷凍管在水浴中解凍時，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染。

解凍冷凍保存細胞的離心方法:

(1)從液氮中取出凍存的細胞，立即放入37℃水浴中快速解凍。

（2）將1－2ml凍存細胞液加入到25ml新鮮完全細胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻。

（3）用1000轉(zhuǎn)離心2－3分鐘，棄上清液。

（4）用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細胞團，并計數(shù)細胞。

（5）接種細胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3×105/ml。

常規(guī)的培養(yǎng)法

原代培養(yǎng)法

儀器、材料及試劑儀器：培養(yǎng)箱（調(diào)整至37℃），培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術(shù)器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃）

材料：胎鼠或新生鼠試劑：DMEM培養(yǎng)基（含20%小牛血清），%胰酶，Hank’s液，碘酒

操作步驟（一）胰酶消化法1、將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。2、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hank’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、視組織塊量加入5—6倍的%胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離

5、加入3—5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。

6、靜置5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。7、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。8、加入Hank’s液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。9、加入培養(yǎng)液l—2ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。10、將細胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至25ml細胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。

注意事項

1、自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。2、在超凈臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。3、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。五、無菌操作的幾個注意事項1、操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。3、操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。

無菌操作的幾個注意事項

1、操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。2、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。3、操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。

傳代培養(yǎng)法

細胞生長增殖形成單層后進行傳代

1、吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液

2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液，以能覆蓋平底為限。

3、顯微鏡下觀察，當(dāng)發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大，立即終止消化

4吸出消化液，加入Hanks液吹打

5計數(shù)細胞

傳代時注意事項

1、把握好傳代時機，在80%-90%匯合階段最好

2、消化時間要適度

3、消化液濃度要適宜

細胞培養(yǎng)的污染、檢測和排除

污染途徑

1、空氣

2、清洗消毒

3、操作

4、血清

5、組織

污染對細胞的影響

一、真菌污染

二、細菌污染

三、支原體污染

微生物污染的排除

一、抗生素除菌法

二、加溫除菌法（除支原體）

三、動物體內(nèi)接種除菌法

四、巨噬細胞吞噬法

正常細胞和組織的培養(yǎng)

一、上皮細胞培養(yǎng)上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細胞培養(yǎng)中?；祀s有成纖維細胞，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同時上皮細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關(guān)鍵。

體內(nèi)上皮細胞生長在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長，另外人或小鼠表皮細胞培養(yǎng)在以3T3細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有利于表皮細胞生長。

表皮細胞培養(yǎng)

1、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成－1平方厘米小塊。2、置%EDTA中，室溫，5分鐘。3、換入%胰蛋白酶中，4℃過夜。4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。5、取出表皮，剪成更小的塊后，置%胰酶中，37℃，30—60分鐘。6、反復(fù)吹打，制成懸液。7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。

二、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)

1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取10—15厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時內(nèi)保存于4℃。2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3—10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

4、吸出含有內(nèi)皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）。5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細胞長成單層。

神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)

神經(jīng)細胞（神經(jīng)元〕不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細胞因子時，可出現(xiàn)一定程度的分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長的膠質(zhì)細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說來，膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，

獲取腦組織后，仔細剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于30—50倍體積的Hanks液中，此時腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即制成細胞懸液。3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后，細胞或細胞團快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復(fù)二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細胞成分。4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)過濾，計數(shù)并調(diào)整細胞密度。5、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。該細胞適應(yīng)環(huán)境過程較長，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也可能不見細胞分裂現(xiàn)象，然而一旦生長后即能迅速進入旺盛的增殖狀態(tài)。細胞傳代可以%胰酶消化處理。

肌組織培養(yǎng)

（－）骨骼肌細胞培養(yǎng)

1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。2、無菌取大腿肌組織，切成一小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的%胰蛋白酶消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。3、計數(shù)調(diào)整細胞密度。4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進分化。接種在膠原或膠原的底物上能促進細胞分化，細胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)50－52小時后出現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。

巨噬細胞培養(yǎng)

巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P331、、等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣方法和各種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實用，

1、實驗前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)！），以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細胞。2、引頸處死小鼠。3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10mlEagle液注入腹腔中，同時用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動。6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10mlDMEM培養(yǎng)基。9、計數(shù)細胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。10、以3×105個貼附細胞/平方厘米接種。11、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細胞，純化培養(yǎng)細胞，用DMEM液沖洗1一2次，再加新DMEM培養(yǎng)液置CO2溫箱中。無菌操作基本技術(shù)

1.實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%

ethanol擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實驗操作。每

次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間

污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間

隔應(yīng)讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

2.無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可

以暫時放置，其它實驗用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦

拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操

作。

3.小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打

開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，

盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4.工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒

感染之細胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少ClassII)。操作過程

中，應(yīng)避免引起aerosol之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳

針頭之傷害等。

5.定期檢測下列項目：

.CO2鋼瓶之CO2壓力

.CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。

.無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300

小時/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時/HEPA)。

6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定期更換水槽的水。實驗用品

1.種類︰

.細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteurpipet外，其它均為塑料無菌

制品。

.TC級培養(yǎng)盤表面均有coating高分子物質(zhì)以讓細胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask,

plates,dishes,rollerbottle等，依實驗需要使用。

.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml

.塑料離心管:15ml,50ml，均有2種不同材質(zhì)，其中polypropylene(PP)為不透

明材質(zhì)，polystyrene(PS)為透明材質(zhì)，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。

.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。

.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml

2.清洗︰

.新購玻璃血清瓶先以~NHCl浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用。

.用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干

凈，勿加清潔劑清洗。

3.滅菌︰

.實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121oC,15lb,20分鐘，置于

oven中烘干。

.實驗用玻璃pasteurpipet以干熱滅菌170oC,4小時。

.液體或是固體廢棄物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高

壓滅菌121oC,15lb,20分鐘處理。培養(yǎng)基

1.液體培養(yǎng)基貯存于4oC冰箱，避免光照，實驗進行前放在37oC水槽中溫?zé)帷?/p>

2.液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個月，期間glutamine可能會分解，若細胞生長不佳，

可以再添加適量glutamine。

3.粉末培養(yǎng)基配制(以1升為例)：

.細胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900ml，pH為

-。NaHCO3為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成

pH之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合，

然后用CO2氣體調(diào)整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH)，因為氯離子對細胞生

長可能有影響，且貯存時培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。

.材料：

純水(milli-Q水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)

粉末培養(yǎng)基

NaHCO3(SigmaS-4019)

電磁攪拌器

無菌血清瓶

或mm無菌過濾膜

pHmeter

真空幫浦

CO2氣體

.步驟：

取粉末培養(yǎng)基溶于700mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解。

稱取適量之NaHCO3粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一)溶于200ml

milli-Q水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2氣體至飽和，約3-5分鐘。

將溶解且含飽和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌?/p>

溶液之pH應(yīng)為，除非pH值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。

若為太堿，可再通入CO2氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，

pH會升高。

以或mm無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養(yǎng)

基種類、日期、瓶號等，貯存于4oC。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)

配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試。

4.配制培養(yǎng)基之生長測試

.材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

.步驟：

以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCKcell，接種MDCK細胞于6-wellplate(或35

mmTCdish)中，每個well接種1×102活細胞，同時作對照組實驗。

接種5～7天后，在100倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群

落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。

去除培養(yǎng)基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸﹦3:1)，室溫下靜

置10min。

去除固定液，水洗二次。

加入1ml10%Giemsasolution，，室溫下靜置染色2-3min。

去除染液，水洗二次。

以肉眼計數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不

佳，則丟棄之?？股?/p>

1.細胞庫之細胞培養(yǎng)基不加抗生素

.培養(yǎng)自ATCC引進之細胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。

.培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株，制作tokenfreeze前培養(yǎng)基須添加抗生素，待

tokenfreeze通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素。

2.寄送活細胞時，須將培養(yǎng)液充滿整個flask時，則須添加抗生素(penicillin100units/ml+

streptomycin100ug/ml)。

3.若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin會抑制

mycoplasma生長。

4.去除細菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin

250ug/ml,bacitracinunits/ml，注意混合使用后藥物毒性會增強。

5.抗生素使用種類與濃度：

工作濃度.儲存溫度.殺滅細菌

penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteria

streptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

chlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria

gentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasma

amphotericinBug/ml-20℃yeastandmolds

nystatin50ug/ml-20℃yeastandmolds

fungizoneml-20℃yeastandmolds血清

1.血清必須貯存于–20～-70oC，若存放于4oC，請勿超過一個月。如果一次無法用完一

瓶，可將40～45ml分裝于無菌50ml離心管中，由于血清結(jié)凍時體積會增加約10%，

必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。

2.一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加

入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。

3.瓶裝(500ml)血清解凍步驟(逐步解凍法):-20oC或–70oC至4oC冰箱溶解一天，至室

溫下全溶后再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45ml。在溶解過程中須規(guī)則搖

晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。勿直接由–20oC直接

至37oC解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沈淀。

4.heat-inactivation是指56oC,30分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均

勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement)去活化。除非必須，一般不建

議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質(zhì)。補體參與之反應(yīng)有：

cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsand

platelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecell

type。

5.勿將血清置于37oC太久，若在37oC放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較

不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質(zhì)。

6.血清之沈淀物

.凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)變性

及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin)造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本

身之品質(zhì)。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000rpm,5min去除，或離心后上

清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會

阻塞過濾膜。

.顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經(jīng)過熱處理之血清，沈淀物的形成會顯著的增多。

有些沈淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”，常會誤認為血清遭受污染，而將血清

放在37oC中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37oC環(huán)境下，又會使此沈淀物增多，更

會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測，又沒有污染。一般而言，此

小黑點應(yīng)不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品質(zhì)，應(yīng)立即停用，更換另一批

號的血清。

7.血清之生長測試

.材料：

MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)

a-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022)

6-wellTCplate(or35mmTCdish)

methanol

glacialaceticacid

10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)

.步驟：

以a-MEMwith10%FBS(已測試過)培養(yǎng)MDCK細胞于T75flask至80

%confluency。

以trypsin-EDTA處理細胞，離心后，加入適量不加血清之a(chǎn)-MEM制成細

胞懸浮液，并測細胞濃度。以不加血清之a(chǎn)-MEM稀釋細胞濃度為1×102活

細胞數(shù)/ml。

將1ml細胞懸浮液接種入6-wellplate中，并另加入1ml含不同濃度的血

清(20%,10%,4%,2%,1%,%)之a(chǎn)-MEM，使血清最終濃度為10

%,5%,2%,1%,%,%。用已測試過之血清同時進行對照組試驗。

37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，期間不需更換培養(yǎng)基，待細胞群落大

到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸即可。

去除培養(yǎng)基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇:冰醋酸﹦3:1)，室溫下靜

置10min。

去除固定液，水洗二次。

加入1ml10%Giemsasolution，，室溫下靜置染色2-3min。

去除染液，水洗二次。

以肉眼計數(shù)群落數(shù)

計算SPE(SerumPlatingEfficiency)：

SPE=(no.ofcolonies/well)/100x100%

計算RPE(RelativePlatingEfficiency)：

SPE=[totalcoloniesofsixwell(test)/Totalcoloniesofsixwell(control)]x100%

.比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE，即可得知待測血清對細胞生長的影響。

.訂購多量同一批號的優(yōu)良血清，置于–70oC保存之冷凍細胞活化

1.冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對細胞造成傷害，導(dǎo)致細胞之死

亡。

2.細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復(fù)正常(例如產(chǎn)生

單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。

3.材料

37oC恒溫水槽

新鮮培養(yǎng)基

無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶

液氮或干冰容器

4.步驟：

操作人員應(yīng)戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。

自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時

蓋子易松掉。

將新鮮培養(yǎng)基置于37°C水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無

菌操作臺內(nèi)。

取出冷凍管，立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全

部融化，以70%ethanol擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

取出ml解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為

1:10～1:15)，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取ml解凍細胞懸浮液作

存活測試。

解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol)，依細胞種類而異，

一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞

懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1,000rpm,5分鐘，移去上清

液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。細胞傳代培養(yǎng)

1.細胞生長至高密度時，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3至1:6，依細胞

種類而異。

2.材料：

.無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’sphosphate-bufferedsaline,Ca++/Mg++free,D-PBS,

GibcoBRL21600-010)

.trypsin-EDTAsolution%EDTA-4Na,GibcoBRL25300-062)：

以10ml分裝于15ml無菌離心管中，保存于–20oC，使用前放在37oC水槽

回溫。

.新鮮培養(yǎng)基

.無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶

3.步驟：

.附著型胞(adherentcell)

吸掉舊培養(yǎng)液。

用D-PBS洗滌細胞一至二次。

加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37oC作用數(shù)分鐘，于倒

立顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA溶

液。(若不移去trypsin-EDTA，則在trypsin-EDTA作用后，加入適量含血清

之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液。)

輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)

次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，以正常

培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

.懸浮型細胞(suspensioncell)

吸出細胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000rpm5分鐘。

吸掉上清液，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后，依稀釋比例轉(zhuǎn)移至新的

培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

.融合瘤(hybridoma)

有些hybridomacell需培養(yǎng)三天以上才會產(chǎn)生抗體，若是更換培養(yǎng)基，則可

能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基，直接添加新鮮培養(yǎng)基

稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖至新培養(yǎng)瓶中。細胞計數(shù)與存活測試

1.原理：

.計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coultercounter粒子計數(shù)器自動計數(shù)。

.血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，

其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為mm。當(dāng)chamber上方

蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2xmm=x10-4ml。使用時，計

數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細胞

數(shù)目。

.存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細

胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypanblue染料，如果細

胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。

2.材料：

.%w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

.Erythosinbluishstain

取gramErythrosinbluish(SigmaE-9259)及grampreservativemethyl

paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline

.血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip)

.計數(shù)器(counter)

.低倍倒立顯微鏡

.粒子計數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)

3.步驟：

.取50ml細胞懸浮液與50mltrypanblue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于

小離心管中。

.取少許混合液(約15ml)自血球計數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于

100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin

bluish)。

.計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue

等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線

上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。

4大格*細胞總數(shù)x2x104/4=細胞數(shù)/ml

*每一大格的體積=xx=10-4ml

.若不用血球計數(shù)盤，可用Coultercounter作自動計數(shù)，惟無法辨別死細胞或活細

胞。

.范例：

T75monolayerculture制成10ml細胞懸浮液，取ml溶液與trypan

blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數(shù)盤，計數(shù)四大方格內(nèi)之

細胞數(shù)目。

活細胞數(shù)/方格：55,62,49,59

死細胞數(shù)/方格：5,3,4,6

細胞總數(shù)=243

平均細胞數(shù)/方格=

稀釋倍數(shù)=2

細胞數(shù)/ml：x104x2=x106

細胞數(shù)/flask：x106x10ml=