酶工程重點復(fù)習(xí)資料

《酶工程》復(fù)習(xí)題1/28《酶工程》復(fù)習(xí)題08生物技術(shù)林陽and曾洋名詞解釋：酶工程：又稱為酶技術(shù)，是指酶的生產(chǎn)與應(yīng)用的技術(shù)過程。酶的生產(chǎn)：通過各種方法獲得人們所需的酶的技術(shù)過程。酶的改性：是通過各種方法改進(jìn)酶的催化特性的技術(shù)過程。酶的應(yīng)用：是在特定的條件下通過酶的催化作用，獲得人們所需的產(chǎn)物、除去不良物質(zhì)或獲得所需信息的技術(shù)過程。酶工程的主要任務(wù)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作，獲得人們所需的酶，并通過各種方法使酶充分發(fā)揮其催化功能。酶活力：指在一定條件下，酶所催化的反應(yīng)初速度。酶活力單位：在特定條件下（溫度可采用25℃，pH等條件均采用最適條件），每1min催化1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個酶活力單位?；蛟谔囟l件下，每秒催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1卡特（Kat）。1Kat=6×107IU酶的比活力：是酶純度的一個指標(biāo)，是指在特定條件下，單位重量（mg）蛋白質(zhì)或RNA所具有的酶活力單位數(shù)。酶的轉(zhuǎn)換數(shù)：Kp，又稱為摩爾催化活性，是指每個酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的分子數(shù)。即是每摩爾酶每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的摩爾數(shù)。酶的催化周期:轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)稱為酶的催化周期。催化周期是指酶進(jìn)行一次催化所需的時間。固定化酶:固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。酶的結(jié)合效率：又稱為酶的固定化率，是指酶與載體結(jié)合的百分率。酶活力回收率：是指固定化酶的總活力與用于固定化的總游離酶活力的百分率。相對酶活力：具有相同酶蛋白（或酶RNA）量的固定化酶活力與游離酶活力的比值稱為相對酶活力。酶的定向進(jìn)化技術(shù)：模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變和自然選擇）在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。酶的提取分離法生產(chǎn)：是采用各種技術(shù)從動物、植物、微生物細(xì)胞或者其它含酶原料中將酶提取出來，再與所含雜質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)過程。酶的提?。菏侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^程。也稱為酶的抽提。酶的分離純化：是采用各種生化分離技術(shù)使酶與各種雜質(zhì)分離的技術(shù)過程。酶的生物合成法生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作，利用微生物、植物及動物細(xì)胞的生命活動，獲得所需的酶的技術(shù)過程。酶的發(fā)酵法生產(chǎn)：經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作，利用微生物細(xì)胞的生命活動合成所需酶的生產(chǎn)方法。酶的化學(xué)合成法生產(chǎn)：是按照酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)中氨基酸或者核苷酸的排列順序，通過化學(xué)反應(yīng)將一個一個的單體連接起來而獲得所需酶的技術(shù)過程。組成酶：細(xì)胞內(nèi)有的酶量比較恒定，環(huán)境因素對這些酶的合成速率影響不大，這類酶稱為組成酶。適應(yīng)酶：細(xì)胞內(nèi)有的酶量變化很大，其合成速率明顯受環(huán)境因素的影響，這類酶稱為適應(yīng)酶或調(diào)節(jié)酶結(jié)構(gòu)基因：結(jié)構(gòu)基因與多肽鏈有各自的對應(yīng)關(guān)系。結(jié)構(gòu)基因上的遺傳信息可以轉(zhuǎn)錄成為mRNA上的遺傳密碼，再經(jīng)翻譯成為酶蛋白的多肽鏈，每一個結(jié)構(gòu)基因?qū)?yīng)一條多肽鏈。啟動基因：由兩個位點組成，一個是RNA聚合酶的結(jié)合位點，另一個是環(huán)腺苷酸（cyclicAMP）與CAP組成的復(fù)合物(cAMP-CAP)的結(jié)合位點。操縱基因：與調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白中的一種結(jié)構(gòu)結(jié)合（阻遏蛋白是一種變構(gòu)蛋白），在空間上排擠RNA聚合酶與啟動基因結(jié)合，從而操縱酶生物合成的時機(jī)和合成速度。調(diào)節(jié)基因：能夠產(chǎn)生一種阻遏蛋白。阻遏蛋白是一種由多個亞基組成的變構(gòu)蛋白，它可以通過與某些小分子效應(yīng)物（誘導(dǎo)物或阻遏物）的特異結(jié)合而改變其結(jié)構(gòu)，從而改變它與操縱基因的結(jié)合力。操縱子：是基因表達(dá)和控制的一個完整單元，其中包括結(jié)構(gòu)基因、操縱基因和啟動基因。是一組功能上相關(guān)，受同一調(diào)節(jié)基因控制的基因組成的一個遺傳單位。分解代謝物阻遏作用：是指某些物質(zhì)（主要是指葡萄糖和其它容易利用的碳源等）經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象。（也稱為葡萄糖效應(yīng)）誘導(dǎo)作用：某些代謝物可以誘導(dǎo)某些酶的合成，是通過促進(jìn)為該酶編碼的基因的表達(dá)而進(jìn)行的。反饋阻遏作用：又稱產(chǎn)物阻遏作用。是指酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的終產(chǎn)物使酶的生物合成受到阻遏的現(xiàn)象。酶的生物合成：酶在細(xì)胞內(nèi)合成的過程。細(xì)胞活化：保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須接種于新鮮的固體培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞的生命活性得以恢復(fù)的過程。固定化細(xì)胞：又稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞，是指采用各種方法固定在載體上，在一定的空間范圍進(jìn)行生長、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。固定化原生質(zhì)體：是指固定在載體上,在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動的原生質(zhì)體。沉淀分離（5種）：包括鹽析沉淀法、等電點沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、復(fù)合沉淀法、選擇性變性沉淀法。鹽析沉淀法：簡稱鹽析法，是利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離的過程。等電點沉淀法：利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法。有機(jī)溶劑沉淀法：利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為有機(jī)溶劑沉淀法。復(fù)合沉淀法：在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法稱為復(fù)合沉淀法選擇性變性沉淀法：選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，這種分離方法稱為選擇性變性沉淀法。離心分離（3種）包括差速離心、密度梯度離心、等密梯度離心差速離心：是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。（主要用于分離大小和密度相差較大的顆粒）密度梯度離心：是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)分離的一種區(qū)帶離心方法。等密梯度離心：當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两?，或向上飄浮，只要時間足夠長，就可以一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點），停止運動形成區(qū)帶。這種方法稱為等密梯度離心，或稱為平衡密度梯度離心。膜過濾：借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。過濾：是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。層析分離（6種）：包括吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析、層析聚焦。吸附層析：利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的層析方法。分配層析：利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的層析方法。離子交換層析：利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的層析方法。凝膠層析：以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的層析方法親和層析：利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化的層析方法。層析聚焦：將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性，與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離的層析方法。電泳分離（5種）包括紙電泳、薄層電泳、薄膜電泳、凝膠電泳、等電聚焦電泳。紙電泳：是以濾紙為支持體的電泳技術(shù)。薄層電泳：是將支持體與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層而進(jìn)行電泳的技術(shù)。薄膜電泳：是以醋酸纖維等高分子物質(zhì)制成的薄膜為支持體的電泳技術(shù)。凝膠電泳：是以各種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠作為支持體的電泳技術(shù)。等電聚焦電泳：是利用各組分等電點的不同而進(jìn)行分離的電泳技術(shù)。萃取分離（4種）包括有機(jī)溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃取、反膠束萃取。有機(jī)溶劑萃取：是利用溶質(zhì)在水和有機(jī)溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離的萃取技術(shù)。雙水相萃?。菏抢萌苜|(zhì)在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離的萃取技術(shù)。超臨界萃?。河址Q為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)。反膠束萃?。菏抢梅茨z束將酶或其他蛋白質(zhì)從混合液中萃取出來的一種分離純化技術(shù)。結(jié)晶（4種）：鹽析結(jié)晶法、有機(jī)溶劑結(jié)晶、透析平衡結(jié)晶、等電點結(jié)晶。鹽析結(jié)晶：是指在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H值等條件下，于接近飽和的酶液中緩慢增加某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度慢慢降低，達(dá)到稍微過飽和狀態(tài)，而析出酶晶體的過程。有機(jī)溶劑結(jié)晶：是在接近飽和的酶液中慢慢加入某種有機(jī)溶劑，使酶的溶解度降低，而析出酶晶體的過程。透析平衡結(jié)晶：是將酶液裝進(jìn)透析袋，對一定濃度的鹽溶液進(jìn)行透析，使酶液逐步達(dá)到過飽和狀態(tài)而析出結(jié)晶的過程。等電點結(jié)晶：是通過緩慢改變濃酶液的pH值，使之逐漸達(dá)到酶的等電點，而使酶析出結(jié)晶的過程。干燥：是將固體、半固體或濃縮液中的水分或其它溶劑除去一部分，以獲得含水分較少的固體物質(zhì)的過程。酶分子修飾：通過各種方法直接使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改進(jìn)酶的催化特性的技術(shù)過程。濃縮：是從低濃度酶液中除去部分水或其它溶劑而成為高濃度酶液的過程。酶固定化：采用各種方法將酶與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化酶，而使酶的催化特性發(fā)生某些改變的技術(shù)過程。酶的非水相催化：酶在非水介質(zhì)中進(jìn)行的催化作用稱為酶的非水相催化。酶的活性中心：酶分子中直接與底物結(jié)合并具有催化活性的特殊部位。酶分子的主鏈修飾：利用酶分子主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的特性和功能的方法。側(cè)鏈基團(tuán)修飾：采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的催化特性的修飾方法。分子內(nèi)交聯(lián)修飾：通過含有雙功能基團(tuán)的化合物（又稱雙功能試劑），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，在酶蛋白分子中相距較近的兩個側(cè)鏈基團(tuán)之間形成共價交聯(lián)，從而提高酶的穩(wěn)定性的修飾方法。大分子結(jié)合修飾：采用水溶性大分子與酶蛋白的測鏈基團(tuán)共價結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的特性與功能的方法。親和修飾：指修飾試劑只專一地與酶分子某一位點上的某一基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，而與此位點外的同一種或不同種基團(tuán)都不發(fā)生作用的修飾方法。定點突變：是指DNA序列中的某一特定位點上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。組成單位置換修飾：將肽鏈上的某一個氨基酸（核苷酸）換成另一個氨基酸（核苷酸），引起酶蛋白（酶RNA）空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。金屬離子置換修飾：把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。物理修飾：通過各種物理方法使酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。易錯PCR技術(shù)：從酶的單一基因出發(fā)，通過改變PCR反應(yīng)條件，在基因擴(kuò)增過程中使堿基配對出現(xiàn)錯誤而引起基因突變。基因重排技術(shù)：稱為DNA改組技術(shù)，是從2種以上同源正突變基因出發(fā)，用酶（DNaseI）切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程?；蚣易逯嘏偶夹g(shù)：又稱為基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶（DNaseI）切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。基因重組：是在體外通過DNA連接酶的作用，將基因與載體DNA連接在一起形成重組DNA的技術(shù)過程。突變基因文庫的組裝：是將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成有感染活性的重組噬菌體的過程。酶突變基因的定向選擇：是在人工控制條件的特殊環(huán)境下，按照人們所設(shè)定的進(jìn)化方向?qū)ν蛔兓蜻M(jìn)行選擇，以獲得具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。吸附法：通過載體表面和酶分子表面之間的氫鍵、疏水鍵和電子親和力等物理作用力，將酶固定于不溶性載體的方法，稱為物理吸附法，簡稱吸附法。包埋法：將酶或含酶細(xì)胞包埋于各種多孔載體中，使酶固定化的方法，稱為包埋法。結(jié)合法：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵，與酶結(jié)合在一起的固定化方法，稱為結(jié)合法。交聯(lián)法：利用雙功能試劑或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以共價鍵制備固定化酶的方法。熱處理法：將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在細(xì)胞內(nèi)，而制備得到固定化細(xì)胞。固定化細(xì)胞：固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動的細(xì)胞。細(xì)胞固定化：通過各種方法，將細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化細(xì)胞的過程。分子記憶：酶通過配體誘導(dǎo)、相互作用改變酶的構(gòu)象，從而獲得與配體類似物結(jié)合的能力，這種由配體誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶的記憶稱為分子記憶。pH記憶：在有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)中，酶所處的pH環(huán)境與酶在凍干或吸附到載體上之前所使用的緩沖液pH值相同的現(xiàn)象。必需水：酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構(gòu)象。維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量稱為必需水，屬于結(jié)合水。水活度：是指體系中水的逸度與純水逸度之比。通常可以用體系中水的蒸汽壓與相同條件下純水的蒸汽壓之比表示。即：Aw=YwP/P0。酶反應(yīng)動力學(xué)：是研究各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響因素的學(xué)科，是酶學(xué)研究的重要內(nèi)容，也是酶應(yīng)用的重要理論根據(jù)。酶反應(yīng)器：用于各種酶進(jìn)行催化反應(yīng)的容器及其附屬設(shè)備。攪拌罐反應(yīng)器STR：是帶有攪拌裝置的一類罐式反應(yīng)器，由反應(yīng)罐、攪拌器和保溫裝置組成。填充床反應(yīng)器PCR：是將固定化酶堆疊在反應(yīng)容器中進(jìn)行催化反應(yīng)的一種反應(yīng)器，適用于固定化酶進(jìn)行催化反應(yīng)。流化床反應(yīng)器FBR：是通過流體使固定化酶顆粒在懸浮翻動狀態(tài)下進(jìn)行催化反應(yīng)的一種反應(yīng)器，適用于固定化酶進(jìn)行連續(xù)催化反應(yīng)。鼓泡反應(yīng)器BCR：是利用從反應(yīng)器底部通入的氣體產(chǎn)生的大量氣泡，在上升過程中起到提供反應(yīng)底物和混合兩種作用的一類反應(yīng)器。也是一種無攪拌裝置的反應(yīng)器。膜反應(yīng)器MR：是將酶催化反應(yīng)與半透膜的分離作用組合在一起而成的反應(yīng)器。噴射反應(yīng)器PR：是利用高壓蒸汽的噴射作用，實現(xiàn)酶與底物的混合，進(jìn)行高溫短時催化反應(yīng)的一種反應(yīng)器。問答題：試述酶工程的發(fā)展概況與前景。（小題）答：1894年，日本的高峰讓吉首先從米曲霉中制備得到高峰淀粉酶，用作消化劑，開創(chuàng)了近代酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的先例；1908年，德國的羅姆制得胰酶，用于皮革的軟化。1908年，法國的波伊登(Boidin)制備了細(xì)菌淀粉酶,應(yīng)用于紡織品的退漿。1911年，美國的華勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶，用于除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁。此后，酶的生產(chǎn)和應(yīng)用逐步發(fā)展。然而在50年代以前停留在從微生物、動物或植物中提取酶，加以利用階段。由于當(dāng)時生產(chǎn)力落后，生產(chǎn)工藝較繁雜，難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。1949年，采用微生物液體深層培養(yǎng)方法進(jìn)行細(xì)菌α-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)，揭開了現(xiàn)代酶制劑工業(yè)的序幕。50年代以后,隨著生化工程的發(fā)展,大多數(shù)酶制劑的生產(chǎn)已轉(zhuǎn)向微生物流體深層發(fā)酵的方法。酶的應(yīng)用越來越廣泛。50年代：開始了酶固定化研究。1953年德國科學(xué)家首先將聚氨基苯乙烯樹脂與淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等結(jié)合,制成了固定化酶。1960年，法國的雅各（Jacob）和莫諾德（Monod）提出操縱子學(xué)說，闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，使酶的生物合成可以按照人們的意愿加以調(diào)節(jié)控制。60年代，是固定化酶技術(shù)迅速發(fā)展的時期。1969年,日本的千煙一郎首次在工業(yè)上應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸生產(chǎn)L-氨基酸。出現(xiàn)了“酶工程”這個名詞來代表有效利用酶的科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。60年代，用小分子化合物修飾酶分子側(cè)鏈基團(tuán),使酶性質(zhì)發(fā)生改變。70年代,修飾劑的選用、修飾方法上又有了新的發(fā)展。1971年第一屆國際酶工程學(xué)術(shù)會議在美國召開,當(dāng)時的主題即是固定化酶，進(jìn)一步開展了對微生物細(xì)胞固定化的研究。1973年,千煙一郎首次利用固定化的大腸桿菌細(xì)胞生產(chǎn)L-天冬氨酸。1978年,日本的鈴木等固定化細(xì)胞生產(chǎn)α-淀粉酶研究成功.所以說,70年代是固定化細(xì)胞技術(shù)取得進(jìn)展的時期。80年代，固定化細(xì)胞已能用于生產(chǎn)胞外酶,因此,80年代又發(fā)展了固定化原生質(zhì)體技術(shù),排除了細(xì)胞壁這一障礙。在酶的固定化技術(shù)發(fā)展的同時,酶分子修飾技術(shù)也取得了進(jìn)展。80年代開始了酶的非水相催化的研究，擴(kuò)大了酶的應(yīng)用和生產(chǎn)領(lǐng)域。20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來的動、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，繼微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶之后，已成為酶生產(chǎn)的又一種途徑。此外,分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于酶學(xué)領(lǐng)域開展了酶的定向進(jìn)化技術(shù),使酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展,顯示出廣闊而誘人的前景。酶的定向進(jìn)化技術(shù)：模擬自然進(jìn)化過程，在體外進(jìn)行基因隨機(jī)突變，建立突變基因文庫，通過人工控制條件的特殊環(huán)境，定向選擇得到具有優(yōu)良特性的酶的突變體的技術(shù)過程。（DNA重排、高通量篩選、易錯PCR)20世紀(jì)90年代，隨著基因工程的廣泛介入，一些原來只能由動物或植物生產(chǎn)的酶，經(jīng)過酶基因重組，可以在微生物上表達(dá)。由于在發(fā)酵過程中很容易對微生物進(jìn)行控制，因此“基因工程＋發(fā)酵工藝＋先進(jìn)的發(fā)酵設(shè)備”可以算是酶工業(yè)的第三次飛躍。此外，對抗體酶、人工酶、模擬酶、酶電極（酶傳感器）等方面以及酶的應(yīng)用技術(shù)研究，在近20年均取得了較大進(jìn)展，使酶工程不斷向廣度和深度發(fā)展，顯示出廣闊而誘人的前景。蛋白類酶和核酸類酶的分類及命名原則。（小題）答：蛋白酶（P酶）的分類與命名：第1大類，氧化還原酶；第2大類，轉(zhuǎn)移酶；第3大類，水解酶；第4大類，裂合酶；第5大類，異構(gòu)酶；第6大類，合成酶（或稱連接酶）。酶的命名有兩種方法：系統(tǒng)名、推薦名。系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱、酶的作用基團(tuán)和反應(yīng)類型。根據(jù)系統(tǒng)命名法每一個具體的酶還有一個系統(tǒng)編號，通常為四碼編號，四碼分別表明該酶的類型、酶促反應(yīng)的供體、受體以及該酶的特定序號，之間用圓點隔開，前面加上EC表示國際酶學(xué)會。推薦名：只取一個較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。核酸類酶（R酶）的分類與命名：根據(jù)酶催化的底物是其本身RNA分子還是其它分子，可以將R酶分為分子內(nèi)催化（in-cis，也稱為自我催化）和分子間催化（in-trans）兩類。根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型，可以將R酶分為剪切酶，剪接酶，和多功能酶等三類。根據(jù)R酶的結(jié)構(gòu)特點不同，可分為錘頭型R酶，發(fā)夾型R酶，含I型IVS的R酶，含II型IVS的R酶等。蛋白類酶的推薦名和系統(tǒng)名稱的異同。（小題）答：推薦名和系統(tǒng)名的相同點是均指出了該酶的底物名稱或反應(yīng)類型。不同之處在于推薦名只取一個較重要的底物名稱和反應(yīng)類型，此命名法簡單，應(yīng)用歷史長，但缺乏系統(tǒng)性，有時出現(xiàn)曰酶數(shù)名或一名數(shù)酶的現(xiàn)象。而系統(tǒng)名包括所有底物的名稱、酶的作用基團(tuán)和反應(yīng)類型，使一種酶只有一種名稱。根據(jù)系統(tǒng)命名法每一個具體的酶還有一個系統(tǒng)編號，通常為四碼編號，四碼分別表明該酶的類型、酶促反應(yīng)的供體、受體以及該酶的特定序號，之間用圓點隔開，前面加上EC表示國際酶學(xué)會。酶活力單位的測定。（小題）答：酶活力的高低，是以酶活力的單位數(shù)來表示的。酶活力單位的定義：在特定條件下（溫度可采用25℃，pH等條件均采用最適條件），每1min催化1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個酶活力單位。或在特定條件下，每秒催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1卡特（Kat）。1Kat=6×107IU酶活力測定的方法：化學(xué)測定法、光學(xué)測定法、氣體測定法等。酶活力測定的步驟：(1)根據(jù)酶催化的專一性，選擇適宜的底物，并配制成一定濃度的底物溶液。(2)根據(jù)酶的動力學(xué)性質(zhì)，確定酶催化反應(yīng)的溫度、pH值、底物濃度、激活劑濃度等反應(yīng)條件。①溫度：室溫（25℃）、體溫（37℃）、酶反應(yīng)最適溫度或其它選用的溫度；②pH值：是酶催化反應(yīng)的最適pH值；③底物濃度：應(yīng)該大于5Km等。(3)在一定的條件下，將一定量的酶液和底物溶液混合均勻，適時記下反應(yīng)開始的時間。(4)反應(yīng)到一定的時間，取出適量的反應(yīng)液，運用各種生化檢測技術(shù)，測定產(chǎn)物的生成量或底物的減少量。注意：若不能即時測出結(jié)果的，則要及時終止反應(yīng)，然后再測定。酶的主要生產(chǎn)有哪些方法？答：酶的生產(chǎn)方法可以分為提取分離法、生物合成法和化學(xué)合成法等3種。酶的提取分離法生產(chǎn)是采用各種技術(shù)從動物、植物、微生物細(xì)胞或者其它含酶原料中將酶提取出來，再與所含雜質(zhì)進(jìn)行分離的技術(shù)過程。酶的生物合成法生產(chǎn)是經(jīng)過預(yù)先設(shè)計，通過人工操作，利用微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞的生命活動而獲得所需酶的技術(shù)過程。酶的化學(xué)合成法生產(chǎn)是按照酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)中氨基酸或者核苷酸的排列順序，通過化學(xué)反應(yīng)將一個一個的單體（氨基酸或者核苷酸）連接起來而獲得所需酶的技術(shù)過程。酶的主要提取方法和分離方法有哪些？答：酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇ɑ蛉芤海┨幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑（或溶液）中的過程，主要方法有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機(jī)溶劑提取等。酶的分離純化是采用各種生化分離技術(shù)使酶各種雜質(zhì)分離的技術(shù)過程，主要的分離方法有離心分離、過濾與膜分離、萃取分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離等。選擇分離方法時必須考慮的問題。答：在選用分離方法的時候要認(rèn)真考慮：①目標(biāo)酶分子特性及其它物理、化學(xué)性質(zhì)；②酶分子和雜質(zhì)的主要性質(zhì)差異；③酶的使用目的和要求；④技術(shù)實施的難以程度；⑤分離成本的高低；⑥是否會造成環(huán)境污染等。采用生物合成法可分為哪幾類？用該方法進(jìn)行酶的生產(chǎn)時的一般步驟。答：根據(jù)所使用的細(xì)胞種類不同，生物合成法可以分為微生物發(fā)酵產(chǎn)酶、植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶和動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶，其中又以微生物發(fā)酵產(chǎn)酶應(yīng)用最廣。采用生物合成法進(jìn)行酶的生產(chǎn)，首先要經(jīng)過篩選、誘變、細(xì)胞融合、基因重組等方法獲得優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞，然后在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，通過細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的新陳代謝作用，生成所需的酶和各種代謝產(chǎn)物，再經(jīng)過分離純化得到人們所需的酶。酶的發(fā)酵法生產(chǎn)可分為哪幾類？哪一種方法應(yīng)用最廣泛？答：根據(jù)微生物細(xì)胞培養(yǎng)方式的不同，發(fā)酵法可以分為液體深層培養(yǎng)發(fā)酵、固體培養(yǎng)發(fā)酵、固定化細(xì)胞發(fā)酵、固定化原生質(zhì)體發(fā)酵等。其中液體深層培養(yǎng)發(fā)酵為主要方式。酶生物合成的調(diào)節(jié)主要包括那幾個水平？哪一個水平是最重要的？答：酶生物合成的調(diào)節(jié)主要包括：①轉(zhuǎn)錄前的調(diào)節(jié)；②轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)；③轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)；④翻譯水平的調(diào)節(jié)；⑤翻譯產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)和酶降解的調(diào)節(jié)等。其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)（基因調(diào)節(jié)）對酶的生物合成是最重要的調(diào)節(jié)什么是分解代謝物阻遏作用？其作用機(jī)理是什么？答：分解代謝物阻遏作用：是指某些物質(zhì)（主要是指葡萄糖和其它容易利用的碳源等）經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象。（也稱為葡萄糖效應(yīng)）分解代謝物阻遏作用之所以產(chǎn)生，是由于某些物質(zhì)（如葡萄糖等）經(jīng)過分解代謝放出能量，有一部分能量儲存在ATP中。ATP是由AMP和ADP通過磷酸化作用生成的。這樣細(xì)胞內(nèi)ATP濃度增加，就使AMP的濃度降低，存在于細(xì)胞內(nèi)的cAMP就通過磷酸二酯酶的作用水解生成AMP。同時，腺苷酸環(huán)化酶的活化受到抑制而使cAMP的生成受阻，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度降低，這就必然使cAMP-CAP的復(fù)合物的濃度隨之降低。結(jié)果啟動子的相應(yīng)位點上沒有足夠的cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合，RNA聚合酶也就無法結(jié)合到其在啟動子的相應(yīng)位點上，轉(zhuǎn)錄無法進(jìn)行，酶的生物合成受到阻遏。乳糖操縱子的調(diào)節(jié)原理。答：乳糖操縱子具有正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)兩種調(diào)節(jié)機(jī)制，兩者同時獨立調(diào)控乳糖操縱子，只有當(dāng)CAP-cAMP結(jié)合到lacP上和阻遏蛋白脫離lacO時，才開始結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。分解代謝物阻遏作用：當(dāng)葡萄糖存在時，因為分解葡萄糖的酶類屬于組成酶，能迅速地將葡萄糖降解成某種中間產(chǎn)物（X），并產(chǎn)生大量的能量貯存于ATP中，所以會大量消耗ADP和AMP。X既會促進(jìn)cAMP分解成AMP進(jìn)行補充，同時又會阻止ATP釋放能量并環(huán)化形成cAMP，從而降低了cAMP的濃度，繼而阻遏了RNA聚合酶與啟動基因的結(jié)合，相關(guān)酶的合成受到抑制。反之可推。誘導(dǎo)作用：在無誘導(dǎo)物時，RNA聚合酶的結(jié)合位點與阻遏蛋白相結(jié)合，在空間上排擠RNA聚合酶，使之脫離啟動子（P）部位，使結(jié)構(gòu)基因（S）無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，酶的生物合成受阻。當(dāng)培養(yǎng)基中以乳糖為唯一碳源時，細(xì)胞吸收乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖。別乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使它與操縱基因的結(jié)合力減弱，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，就使RNA聚合酶可以與啟動子結(jié)合，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄而合成結(jié)構(gòu)基因所對應(yīng)的酶。色氨酸操縱子的調(diào)節(jié)原理。答：其調(diào)控機(jī)制包括：可阻遏的負(fù)調(diào)控作用機(jī)制和衰減作用①可阻遏的負(fù)調(diào)控：以trp編碼阻遏蛋白，色氨酸作為輔阻遏物，激活阻遏蛋白，只有激活的阻遏蛋白才能結(jié)合到trpO上從而阻止RNA聚合酶與trpP的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄被抑制。②衰減作用：前導(dǎo)區(qū)trpL有4個以1、2、3、4表示的片段，它們以兩種不同的方式進(jìn)行堿基配對形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，有時以1-2與3-4配對，有時只以2-3互補配對，在前導(dǎo)序列第10位與第11位上有相鄰的兩個色氨酸密碼子。當(dāng)細(xì)胞中trp含量高時，相應(yīng)的trp-tRNA也高，使德前導(dǎo)肽順利翻譯，由于原核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄與翻譯偶聯(lián)，前導(dǎo)肽翻譯快，在4區(qū)轉(zhuǎn)錄完，核糖體到2區(qū)；前導(dǎo)區(qū)只能3-4配對形成終止子樣的莖環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄停止。當(dāng)環(huán)境中缺乏trp時，trp-tRNA減少，前導(dǎo)肽翻譯速度慢，4區(qū)轉(zhuǎn)錄完成時，核糖體僅在1區(qū)，前導(dǎo)區(qū)2-3配對，4區(qū)保持單鏈，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)。細(xì)菌通過阻遏與衰減作用兩種機(jī)制的協(xié)調(diào)配合實現(xiàn)對trp操縱子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的最高水平。用于酶的生產(chǎn)的細(xì)胞所必需具備的條件。答：①酶的產(chǎn)量高；②產(chǎn)酶穩(wěn)定性好；③容易培養(yǎng)和管理；④利于酶的分離純化；⑤安全可靠、無毒性等。培養(yǎng)基的基本組分。（小題）答：培養(yǎng)基的組分一般包括碳源、氮源、水、無機(jī)鹽和生長因子等幾方面。植物細(xì)胞培養(yǎng)基的特點。（小題）答：植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基的主要特點有：植物細(xì)胞的生長和代謝需要大量的無機(jī)鹽，除了P、S、N、K、Na、Ca、Mg等大量元素以外，還需要Mn、Zn、Co、Mo、Cu、B、I等微量元素。植物細(xì)胞需要多種維生素和植物生長激素。植物細(xì)胞要求的氮源一般為無機(jī)氮源。植物細(xì)胞一般以蔗糖為碳源。動物細(xì)胞培養(yǎng)基的特點。（小題）答：動物細(xì)胞培養(yǎng)基的組成較為復(fù)雜，包括氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、葡萄糖、激素、生長因子等。在動物細(xì)胞培養(yǎng)基中，必須加進(jìn)各種必需氨基酸，多數(shù)動物細(xì)胞利用谷氨酰胺作為碳源和能源。動物細(xì)胞培養(yǎng)基中一般要加入血清以提供所需的各種維生素。動物細(xì)胞培養(yǎng)基中必須添加含有大量元素的無機(jī)鹽，用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓。大多數(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)基中使用葡萄糖作為碳源和能源，但含量不能太高否則分解產(chǎn)生乳糖改變pH。動物細(xì)胞生長需要激素和生長因子，一般由血清提供。酶生產(chǎn)的工藝流程及工藝條件的控制。答：酶生產(chǎn)的工藝流程：保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須接種于新鮮的固體培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞的生命活性得以恢復(fù)，這個過程稱為細(xì)胞活化?；罨说募?xì)胞需在種子培養(yǎng)基中經(jīng)過一級乃至數(shù)級的擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞。后擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞通過三條途徑產(chǎn)酶：①將擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞制備成原生質(zhì)體，然后固定化，接入發(fā)酵罐中后加入培養(yǎng)基產(chǎn)酶；②將擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞制備成固定化細(xì)胞，然后進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，接入發(fā)酵罐中后通入無菌空氣產(chǎn)酶；eq\o\ac(○,3)直接生產(chǎn)產(chǎn)品酶。最后將生產(chǎn)的產(chǎn)品分離純化，得到所需的酶。pH值的控制：培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi)，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。為了維持培養(yǎng)基pH的相對恒定，通常在培養(yǎng)基中加入pH緩沖劑，或在進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵時補加酸、堿。溫度的控制：細(xì)胞的生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶需要一定的溫度條件。在一定的溫度范圍內(nèi)，細(xì)胞才能正常生長、繁殖和維持正常的新陳代謝。溫度的調(diào)節(jié)一般采用熱水升溫、冷水降溫的方法。溶解氧的控制：可以通過調(diào)節(jié)通氣量、氧的分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積和改變培養(yǎng)液的性質(zhì)來調(diào)節(jié)溶解氧。調(diào)節(jié)溶解氧的方法有哪些？答：①調(diào)節(jié)通氣量；②調(diào)節(jié)氧的分壓；③調(diào)節(jié)氣液接觸時間（流速）；④調(diào)節(jié)氣液接觸面積（攪拌）；⑤改變培養(yǎng)液的性質(zhì)（黏度、氣泡以及溫度）。提高酶產(chǎn)量的措施。答：提高酶產(chǎn)量的措施有以下幾點：添加誘導(dǎo)物：對于誘導(dǎo)酶的發(fā)酵生產(chǎn)，在發(fā)酵過程中的某個適宜的時機(jī)，添加適宜的誘導(dǎo)物，可以顯著提高酶的產(chǎn)量?？刂谱瓒粑锏臐舛龋嚎刂谱瓒粑锏臐舛仁墙獬瓒簟⑻岣呙府a(chǎn)量的有效措施。添加表面活性劑：表面活性劑可以與細(xì)胞膜相互作用，增加細(xì)胞的透過性，有利于胞外酶的分泌，從而提高酶的產(chǎn)量。添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑：是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但是作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。酶的生物合成有哪幾種模式？哪一種模式最理想？如何將其它模式轉(zhuǎn)換為最佳模式？答：酶生物合成模式分為4種類型，即同步合成型，延續(xù)合成型，中期合成型和滯后合成型。最理想的合成模式應(yīng)是延續(xù)合成型。對于同步合成型的酶，要盡量提高其對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，為此適當(dāng)降低發(fā)酵溫度是可取的措施；對于滯后合成型的酶，要設(shè)法降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度，盡量減少甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝物阻遏作用，使酶的生物合成提早開始；而對于中期合成型的酶，則要在提高mRNA的穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面下功夫，使其生物合成的開始時間提前，并盡量延遲其生物合成停止的時間。稀釋率與細(xì)胞生長速度之間有什么關(guān)系？答：稀釋率是指單位時間內(nèi),流加的培養(yǎng)液與發(fā)酵容器中發(fā)酵液體積之比，一般以h-1為單位。（稀釋率可以在0與μm之間變動，μm為最大比生長速率，是指限制性機(jī)制濃度過量時的比生長速率。）dXdt當(dāng)D=0的時候，為分批發(fā)酵；當(dāng)D<μ時，dX/dt為正值，表明發(fā)酵液中細(xì)胞濃度不斷增加，隨著細(xì)胞濃度增加，限制性基質(zhì)的濃度相對降低，使比生長速率減小，在比生長速率降低到與稀釋速率相等的時候，重新達(dá)到穩(wěn)態(tài)；當(dāng)D=μ時，dX/dt為0,發(fā)酵液中細(xì)胞濃度保持恒定不變；當(dāng)D>μ時,dX/dt為負(fù)值,發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度不斷降低，隨著細(xì)胞濃度降低，限制性基質(zhì)的濃度相對升高，使比生長速率增大，在比生長速率提升到與稀釋率相同時，建立新的平衡，重新達(dá)到穩(wěn)態(tài)。當(dāng)D>μm時，細(xì)胞濃度趨向于零，無法達(dá)到新的穩(wěn)態(tài)。什么是產(chǎn)酶動力學(xué)？細(xì)胞產(chǎn)酶模式與產(chǎn)酶動力學(xué)公式之間有什么關(guān)系？（小題）答：產(chǎn)酶動力學(xué)主要研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。dEdtX為細(xì)胞濃度，以每升發(fā)酵液所含的干細(xì)胞重量表示（gDC/L）μ為細(xì)胞比生長速率(1/h)α為生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)，以每克干細(xì)胞產(chǎn)酶的單位數(shù)表示（U/gDC）β為非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率，以每小時每克干細(xì)胞產(chǎn)酶的單位數(shù)表示(U/h·gDC)E為酶濃度，以每升發(fā)酵液中所含的酶單位數(shù)表示(U/L)t為時間(h)同步合成型的酶，其產(chǎn)酶與細(xì)胞生長偶聯(lián)。在平衡期產(chǎn)酶速率為零，即非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率β=0。中期合成型的酶，其合成模式是一種特殊的生長偶聯(lián)型。在培養(yǎng)液中有阻遏物存在時，α=0，β=0，無酶產(chǎn)生。在細(xì)胞生長一段時間后，阻遏物被細(xì)胞利用完，阻遏作用解除，酶才開始合成，β=0，在此階段的產(chǎn)酶動力學(xué)方程與同步合成型相同。滯后合成型的酶為非生長偶聯(lián)型，生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)α=0。延續(xù)合成型的酶，在細(xì)胞生長期和平衡期均可以產(chǎn)酶，產(chǎn)酶速率是生長偶聯(lián)與非生長偶聯(lián)產(chǎn)酶速率之和。固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點。答：固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點提高產(chǎn)酶率（細(xì)胞密度大）可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間（細(xì)胞不易脫落流失）發(fā)酵穩(wěn)定性好（載體的保護(hù)）縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率（預(yù)培養(yǎng)）產(chǎn)品容易分離純化（細(xì)胞不溶于水）適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)（載體的擴(kuò)散抑制）固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件控制。答：固定化細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)：固定化細(xì)胞制備好以后，一般要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以利于固定在載體上的細(xì)胞生長繁殖。溶解氧的供給：固定化細(xì)胞在進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)和發(fā)酵的過程中，由于受到載體的影響,致使氧的供給成為主要的限制性因素。增加溶解氧的方法主要是加大通氣量。溫度的控制：固定化細(xì)胞對溫度的適應(yīng)范圍較寬，在分批和半連續(xù)發(fā)酵過程中不難控制。但是由于稀釋率較大，反應(yīng)器內(nèi)溫度變化較快，所以培養(yǎng)液要預(yù)熱至適宜的溫度。培養(yǎng)基組分的控制：固定化細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基，從營養(yǎng)要求的角度來看，與游離細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)基沒有明顯差別。固定化原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)缺點及工藝控制中應(yīng)注意的問題。答：固定化原生質(zhì)體的特點：①提高酶產(chǎn)率（去除細(xì)胞壁屏障）；②可以反復(fù)使用或連續(xù)使用；③穩(wěn)定性較好（操作、保藏）；④易于分離純化；提高產(chǎn)品品質(zhì)；⑤變胞內(nèi)產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物（適用于胞內(nèi)酶的生產(chǎn)）。在工藝條件控制方面需要注意下列問題：①滲透壓的控制（添加一定量的滲透劑，保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性）；②防止細(xì)胞壁再生（添加青霉素）；③保證原生質(zhì)體的濃度。植物細(xì)胞培養(yǎng)的特點。（小題）答：①產(chǎn)率高；②周期短；③易于管理，減輕勞動強(qiáng)度；④產(chǎn)品質(zhì)量高植物細(xì)胞培養(yǎng)工藝條件的控制。（小題）答：溫度的控制：室溫范圍（25℃）。PH的控制：微酸性范圍（5－6，5.5－5.8最好）。溶解氧的控制：適當(dāng)?shù)耐L(fēng)和攪拌。光照的控制：根據(jù)植物細(xì)胞的特性及目的代謝物的種類進(jìn)行調(diào)節(jié)。前體的添加：添加處于目的代謝物代謝途徑上游的物質(zhì)可以提高次級代謝物的產(chǎn)量。刺激素的應(yīng)用：可以促使物質(zhì)代謝朝某些次級代謝物生成的方向進(jìn)行，從而強(qiáng)化次級代謝物的生物合成，提高某些次級代謝物的產(chǎn)率。動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點。（小題）答：動物細(xì)胞培養(yǎng)具有如下顯著特點：主要用于各種功能蛋白質(zhì)的生產(chǎn)；周期長、生長緩慢；易污染，需要添加抗生素；對環(huán)境敏感，必須嚴(yán)格控制溫度、PH、滲透壓、通風(fēng)攪拌等條件；多數(shù)適宜采用貼壁培養(yǎng)（錨地依賴性），部分可以采用懸浮培養(yǎng)（來自血液、淋巴組織的細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞）。動物細(xì)胞培養(yǎng)工藝條件的控制。（小題）答：動物細(xì)胞培養(yǎng)的種質(zhì)細(xì)胞需要先用胰蛋白酶消化處理。溫度的控制：體溫范圍（36.5℃，波動范圍在0.25℃之內(nèi)），會影響CO2的溶解度進(jìn)而影響PH。PH的控制：微堿性范圍（7.0－7.6，7.4最好），通常采用CO2和NaHCO3溶液，（改變CO2濃度會對溶解氧產(chǎn)生影響）并加入緩沖系統(tǒng)，常用指示劑為酚紅（紅色）。溶解氧的控制：不同的細(xì)胞、不同生長階段、不同細(xì)胞密度要求不同（過低時細(xì)胞生長受抑制，過高時對細(xì)胞產(chǎn)生毒害），通過調(diào)節(jié)混合氣體（空氣、氧氣、氮氣和二氧化碳）的量及其比例進(jìn)行控制，CO2有調(diào)節(jié)供氧和PH的雙重作用。滲透壓的控制：細(xì)胞內(nèi)外滲透壓處于等滲狀態(tài)（700－850kPa）。動物細(xì)胞的培養(yǎng)方式。（小題）答：動物細(xì)胞的培養(yǎng)方式可以分為三大類：懸浮培養(yǎng)：對于非錨地依耐性細(xì)胞，可以自由地懸浮在培養(yǎng)液中生長、繁殖和新陳代謝，與微生物細(xì)胞的液體深層發(fā)酵過程相類似。貼壁培養(yǎng)：大多數(shù)動物細(xì)胞，由于具有錨地依耐性，在培養(yǎng)過程中藥貼附在固體表面生長。固定化細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞與固定化載體結(jié)合，在一定的空間范圍進(jìn)行生長繁殖的培養(yǎng)方式稱為固定化細(xì)胞培養(yǎng)。簡述細(xì)胞破碎的方法及其原理。答：分類細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎原理機(jī)械破碎法搗碎法、研磨法、勻漿法通過機(jī)械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。物理破碎法溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。化學(xué)破碎法添加有機(jī)溶劑、添加表面活性劑通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎。酶促破碎法自溶法、外加酶制劑法通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎。酶的主要提取方法及提取對象。答：提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶影響酶提取的主要因素。答：主要影響因素是酶在所使用的溶劑中的溶解度以及酶向溶劑相中擴(kuò)散的速度。此外，還受到溫度、pH值、提取液體積等提取條件的影響。溫度：提取時的溫度對酶的提取效果有明顯影響。一般說來，適當(dāng)提高溫度，可以提高酶的溶解度，也可以增大酶分子的擴(kuò)散速度。pH值：溶液的pH值對酶的溶解度和穩(wěn)定性有顯著影響。為了提高酶的溶解度，提取時pH值應(yīng)該避開等電點。（分子在其等電點時容易相互吸引，聚合而形成沉淀）提取液的體積：增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。但是過量的提取液，會使酶的濃度降低，對進(jìn)一步的分離純化不利。所以提取液的總量一般為原料體積的3～5倍，最好分幾次提取。沉淀分離的方法及原理。答：沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。沉淀分離方法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離(鹽析）。等電點沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離。選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離。離心機(jī)有哪幾種類型？如何選擇合適的離心方法？答：通常按照離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速的不同可以分為常速離心機(jī)、高速離心機(jī)和超速離心機(jī)。對于常速離心機(jī)和高速離心機(jī)，要求所分離的顆粒大小和密度相差較大，要選擇好離心速度和離心時間，才能達(dá)到分離效果（一般只分離顆粒與溶液）；如果希望從樣品液中分離出2種以上大小和密度不同的顆粒，需要采用差速離心方法。而對于超速離心，則可以根據(jù)需要采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。后兩種方法一次可以分離多種顆粒，且分離效果好，顆?；钚愿撸坏且淮卧试S處理的樣本量少，且成本提高，其中密度梯度離心操作復(fù)雜。試比較密度梯度離心和等密梯度離心的異同。答：離心方法密度梯度離心等密梯度離心梯度形成方式預(yù)配梯度（蔗糖、甘油）離心時自動形成（CsCl）梯度較淺，密度較低梯度陡峭，密度較高適用樣本性質(zhì)密度相近、分子量不同者分子量相近、密度(s)不同者樣本例蛋白質(zhì)核酸、細(xì)胞器官離心情況速度較低，不完全沉降，要在適當(dāng)時間停止離心完全沉降至其樣本密度相同的梯度位置，需高速、長時間介質(zhì)密度最大密度小于所有樣本密度梯度包括所有樣本根據(jù)截留顆粒大小不同，常用的過濾方法有哪幾種？各自截留的主要物質(zhì)是什么？答：類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2~2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?~0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜(選擇性)膜分離的主要技術(shù)有哪幾種？它們各自又包括哪些類型？答：膜分離可以分為加壓膜分離、電場膜分離和擴(kuò)散膜分離3大類。加壓膜分離可分為微濾、超濾和反滲透等3種。電場膜分離可分為電滲析和離子交換膜電滲析2種。擴(kuò)散膜分離，常見的透析就是屬于此類。簡述層析分離的方法及分離依據(jù)。答：層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離。分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離。離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的。凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離。親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化。層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性，與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離。吸附層析的洗脫方法有哪幾種？洗脫液分別是什么類型的溶液？答：洗脫方法主要有3種，分別為溶劑洗脫法、置換洗脫法和前緣洗脫法。溶劑洗脫法：采用單一或者混合的溶劑進(jìn)行洗脫的方法。置換洗脫法：所用的洗脫劑是置換洗脫液，置換洗脫溶液中含有一種吸附力比被所有吸附組分更強(qiáng)的物質(zhì)，即置換劑。前緣洗脫法：又稱為前緣分析法，是連續(xù)向吸附層析柱內(nèi)加入欲分離的混合溶液，即所用的洗脫液為含有各組分的混合溶液本身。如何選擇離子交換劑？答：離子交換劑的選擇應(yīng)考慮以下因素：離子交換劑和組分離子的物化性質(zhì)、組分離子的電荷種類、濃度高低、質(zhì)量大小及與離子交換劑的親和力大小。由于酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。當(dāng)酶的等電點pI大于溶液pH值時，酶分子帶正電荷，則要采用陽離子交換劑進(jìn)行分離；當(dāng)酶的等電點pI小于溶液的pH值時，酶分子帶負(fù)電荷，可用陰離子交換劑進(jìn)行層析分離。哪一種層析方法專一性最好？它又包括哪些類型？答：親和層析是專一性最好的方法，根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性，親和層析可以分為：①共價親和層析（-SH－S-S）；②疏水層析（疏水配基－疏水區(qū)域）；③金屬離子親和層析（金屬離子－特殊的氨基酸殘基）；④免疫親和層析（抗體－抗原）；⑤染料親和層析（輔酶類似物－酶）；⑥凝集素親和層析（凝集素－糖的殘基）⑦分子對親和層析影響泳動速度的主要因素有哪些？（小題）答：顆粒在電場中的移動速度主要決定于其本身所帶的靜電荷量，同時受顆粒形狀和顆粒大小的影響。此外，還受到電場強(qiáng)度、溶液pH值、離子強(qiáng)度及支持體的特性等外界條件的影響。電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度是指每厘米距離的電壓降。又稱為電位梯度或電勢梯度。溶液的pH值：溶液的pH值決定了溶液中顆粒分子的解離程度,也就是決定了顆粒分子所帶靜電荷的多少。溶液的離子強(qiáng)度：溶液的離子強(qiáng)度越高，顆粒的泳動速度越慢。一般電泳溶液的離子強(qiáng)度為0.02～0.2較為適宜。電滲:在電場中，溶液對于固體支持物的相對移動稱為電滲。緩沖液的黏度與溫度也對泳動速率有一定的影響。聚丙烯酰胺凝膠電泳的分類、原理及其適應(yīng)的對象。（小題）答：聚丙烯酰胺凝膠電泳可以分為連續(xù)凝膠電泳、不連續(xù)凝膠電泳、濃度梯度凝膠電泳、SDS凝膠電泳。原理：是以丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）為單體，以N,N’-甲叉（亞甲基）雙丙烯酰胺（CH2=CH-CONH-HNCO-CH=CH2）為交聯(lián)劑，在催化劑的作用下聚合而成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔凝膠。連續(xù)凝膠電泳：只用一層凝膠，采用相同的pH和相同的緩沖液進(jìn)行的電泳。效果差，適于較少組分分離。不連續(xù)凝膠電泳：采用2層或3層性質(zhì)不同的凝膠重疊起來使用，①樣品膠：大孔徑凝膠，含欲分離組分；②濃縮膠：大孔徑凝膠，不同組分根據(jù)遷移率不同在濃縮膠與分離膠界面上壓縮成層；③分離膠：小孔徑凝膠，根據(jù)組分的大小篩分靜電荷相同的組分。適用于濃度較低的樣品分離。濃度梯度凝膠電泳：濃度逐漸增高，孔徑逐漸減小的凝膠進(jìn)行篩分，主要測定球蛋白的分子量。SDS凝膠電泳：只根據(jù)相對分子量的差異來進(jìn)行篩分。SDS帶負(fù)電荷并且可以強(qiáng)烈的與蛋白質(zhì)結(jié)合從而掩蓋蛋白質(zhì)原有電荷，同時還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變使之都變成長橢圓形，從而使泳動速度只與分子量有關(guān)。主要用于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定。等電聚焦電泳的分離依據(jù)及特點。答：其原理是電泳系統(tǒng)中加入兩性電解質(zhì)載體，當(dāng)通過直流電時即形成一個由陽極到陰極連續(xù)增高的pH梯度，不同的蛋白質(zhì)移動到與其等電點相當(dāng)?shù)奈恢脮r停止運動，從而實現(xiàn)對不同等電點的蛋白質(zhì)的分離。優(yōu)點：分辨率高，區(qū)帶窄而清晰，加樣部位自由，重現(xiàn)性好，可同時測定等電點。缺點：不適用于在等電點不溶或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。萃取分離的類型及分離原理。答：萃取類型溶劑原理有機(jī)溶劑萃取乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等有機(jī)溶劑兩相分別為水相和有機(jī)溶劑相，利用溶質(zhì)在水和有機(jī)溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離雙水相萃取高分子聚合物溶液、鹽溶液兩相分別為互不相溶的兩個水，利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離超臨界萃取CO2等超臨界流體利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離反膠束萃取水、有機(jī)溶劑、表面活性劑表面活性劑在有機(jī)溶劑中形成反膠束，親水性溶質(zhì)進(jìn)入反膠束內(nèi)部的水相，疏水性溶質(zhì)在反膠束外部的有機(jī)相而達(dá)到分離為什么超臨界流體是很好的萃取劑，其分離工藝過程有哪些類型？答：超臨界流體密度接近液體，所以溶解能力強(qiáng)；黏度接近氣體，所以擴(kuò)散能力強(qiáng)，因此萃取容量大、速度快，所以效率高。根據(jù)分離方法的不同，分離工藝過程可以分為3種：等壓分離、等溫分離、吸附分離。結(jié)晶時酶液有什么要求？結(jié)晶方法有哪些？其原理又如何？答：結(jié)晶時對酶液有以下要求：酶在結(jié)晶之前，酶液必須經(jīng)過純化達(dá)到一定的純度。如果酶液純度太低，不能進(jìn)行結(jié)晶。通常酶的純度應(yīng)當(dāng)在50%以上，方能進(jìn)行結(jié)晶。酶在結(jié)晶時，酶液應(yīng)達(dá)到一定的濃度。結(jié)晶時酶液濃度應(yīng)當(dāng)控制在介穩(wěn)區(qū)，即酶濃度處于稍微過飽和的狀態(tài)。結(jié)晶過程中還要控制好溫度、pH值、離子強(qiáng)度等結(jié)晶條件。結(jié)晶方法與原理：鹽析結(jié)晶法：在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H值等條件下，于接近飽和的酶液中緩慢增加某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度慢慢降低，達(dá)到稍微過飽和狀態(tài)，而析出酶晶體的過程。有機(jī)溶劑結(jié)晶法：有機(jī)溶劑結(jié)晶是在接近飽和的酶液中慢慢加入某種有機(jī)溶劑，使酶的溶解度降低，而析出酶晶體的過程。透析平衡結(jié)晶法：將酶液裝進(jìn)透析袋，對一定濃度的鹽溶液進(jìn)行透析，使酶液逐步達(dá)到過飽和狀態(tài)而析出結(jié)晶的過程。等電點結(jié)晶法：等電點結(jié)晶是通過緩慢改變濃酶液的pH值，使之逐漸達(dá)到酶的等電點，而使酶析出結(jié)晶的過程。酶活性中心氨基酸殘基的分類及各自的作用。（小題）答：酶活性中心氨基酸殘基分為：接觸殘基、輔助殘基、結(jié)構(gòu)/貢獻(xiàn)殘基、非貢獻(xiàn)殘基。接觸殘基：這類殘基直接與底物接觸、參與底物的化學(xué)轉(zhuǎn)變。通常由結(jié)合部位和催化部位組成，結(jié)合部位決定酶的專一性，催化部位決定催化反應(yīng)類型。輔助殘基：不與底物直接接觸，但會協(xié)助催化作用。接觸殘基和輔助殘基組成酶的活性中心。結(jié)構(gòu)/貢獻(xiàn)殘基：活性中心外的必需基團(tuán)，維持酶活性中心特定的空間構(gòu)象所必需。非貢獻(xiàn)殘基：對酶活性沒有明顯作用，但可能參與酶活性的調(diào)節(jié)、酶的運輸轉(zhuǎn)移、防止酶的降解等作用。酶的一級結(jié)構(gòu)與催化活性的關(guān)系。（小題）答：酶的一級結(jié)構(gòu)決定其空間結(jié)構(gòu)，酶的一級結(jié)構(gòu)的改變將酶的催化特性發(fā)生相應(yīng)的改變酶的一級結(jié)構(gòu)的改變主要是指酶分子主鏈的斷裂。酶分子的主鏈包括肽鏈和核苷酸鏈。根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和特性不同，酶分子主鏈的斷裂可能使酶的活力保持不變、顯示出來或完全喪失。如果酶分子主鏈斷裂的位置遠(yuǎn)離酶的活性中心，切去的部分為非貢獻(xiàn)殘基時，一級結(jié)構(gòu)的改變對酶活性幾乎沒有影響。如果酶分子主鏈斷裂的位置離酶的活性中心較近，切去的部分含有接觸殘基、輔助殘基或貢獻(xiàn)殘基時，將引起酶活力的喪失。對于酶的前體，通過酶的作用，可使酶分子的主鏈在特定的位置斷裂，從而顯示出酶的催化活性。對于酶蛋白而言，一級結(jié)構(gòu)中二硫鍵的斷裂，特別是肽鏈之間的二硫鍵斷裂一般會引起酶活性的喪失。但在某些情況下，二硫鍵的斷開不影響酶的空間構(gòu)象時，酶活性仍可保持。酶的改性包括哪些技術(shù)？答：酶的改性包括酶分子修飾、酶分子定向進(jìn)化、酶固定化、酶非水相催化。酶分子修飾：通過各種方法直接使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改進(jìn)酶的催化特性的技術(shù)過程。酶分子定向進(jìn)化：模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變和自然選擇）在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。酶固定化：采用各種方法將酶與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化酶，而使酶的催化特性發(fā)生某些改變的技術(shù)過程酶非水相催化：酶在非水相介質(zhì)中進(jìn)行的催化作用。酶的二級結(jié)構(gòu)主要有哪些構(gòu)像？與酶的催化活性有什么關(guān)系？（小題）答：酶的二級結(jié)構(gòu)：-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲。二級結(jié)構(gòu)與酶的催化活性的關(guān)系：二級結(jié)構(gòu)的主要穩(wěn)定因素是氫鍵，當(dāng)氫鍵斷裂，酶活性喪失。何謂酶的三級結(jié)構(gòu)？有何特征？與酶的催化活性有什么關(guān)系？（小題）答：酶的三級結(jié)構(gòu)是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。特征：三級結(jié)構(gòu)是具有二級結(jié)構(gòu)的肽鏈盤繞折疊而形成的三維球狀結(jié)構(gòu)分子中的非極性基因集中在分子內(nèi)部，形成酶分子的骨架，稱為疏水核；而極性基團(tuán)相對集中于酶分子表面，形成親水區(qū)。酶分子表面往往有一個內(nèi)陷的凹槽，又稱為裂隙，酶分子的活性中心就在其中。三級結(jié)構(gòu)與酶的催化活性的關(guān)系：三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素是疏水鍵、離子鍵、氫鍵和范德華力，鍵的斷裂將導(dǎo)致酶活性的喪失。恢復(fù)以上化學(xué)鍵，酶的活性可以恢復(fù)。具有四級結(jié)構(gòu)的酶有哪幾類？酶的四級結(jié)構(gòu)與酶的催化特性有何關(guān)系？（小題）答：具有四級結(jié)構(gòu)的酶有：①僅具有催化作用的四級結(jié)構(gòu)的酶，如多催化部位寡聚酶和多酶復(fù)合體；②具有催化部位和調(diào)節(jié)部位的四級結(jié)構(gòu)的酶，具有催化和調(diào)節(jié)兩種作用，主要是別構(gòu)酶。四級結(jié)構(gòu)與酶的催化特性的關(guān)系：多催化部位寡聚酶：由若干相同亞基組成，每個亞基上都有一個催化中心。亞基分離時一般酶活性喪失。多酶復(fù)合體：由幾個功能相關(guān)的酶嵌合而成的復(fù)合體。四級結(jié)構(gòu)破壞時酶活性減弱或者消失。別構(gòu)酶的四級結(jié)構(gòu)破壞時，有些催化亞基仍然可以保持酶的催化活性，但是失去其調(diào)節(jié)功能。酶分子修飾有什么意義？修飾方法包括哪幾大類？答：酶分子修飾的意義：①提高酶的催化效率（活力）；②增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性；③降低或消除酶的抗原性；④改變酶的動力學(xué)特征；⑤產(chǎn)生新的催化能力；⑥研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象（活性中心）的影響。酶分子的修飾方法：①主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）；②側(cè)鏈基團(tuán)修飾；③組成單位（氨基酸、核苷酸）置換修飾；④金屬離子置換修飾；⑤物理修飾。酶分子主鏈修飾包括哪些類型？修飾后可能出現(xiàn)什么情況？答：酶分子主鏈修飾包括①主鏈切斷修飾——酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1、引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2、仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3、有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。②主鏈連接修飾——兩種或兩種以上的酶通過主鏈連接在一起，形成一個分子具有兩種或多種催化活性的修飾方法，形成多酶融合體。對酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾的常用化學(xué)方法有哪些？哪一種專一性最好？為什么？答：對酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾的常用化學(xué)方法有氨基修飾、羧基修飾、巰基修飾、胍基修飾、酚基修飾、咪唑基修飾、吲哚基修飾、分子內(nèi)交聯(lián)修飾、大分子結(jié)合修飾、親和修飾。其中親和修飾的專一性最好，因為修飾劑只專一地與酶分子某一個位點上的某一個基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，與此位點以外的同一種或不同種基團(tuán)都不發(fā)生作用。如何對RNA酶進(jìn)行側(cè)鏈基團(tuán)修飾？答：主要是對其氨基和羥基（酮基）的修飾，如將核酸類酶修飾為脫氧核酸類酶可提高酶的穩(wěn)定性（尿嘧啶替換為胸腺嘧啶；核糖2’-OH脫去）?；?qū)⒑塑账釟埢线B接氨基酸等有機(jī)化合物就可以擴(kuò)展酶的催化功能，提高酶的催化能力。定點突變技術(shù)在酶分子修飾中有何應(yīng)用？簡述其主要的技術(shù)過程。答：定點突變技術(shù)在酶分子修飾中的應(yīng)用：定點突變技術(shù)是指在DNA序列中的某一特定位點上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術(shù)。定點突變技術(shù)，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。酶分子定點突變的過程：①新的酶分子結(jié)構(gòu)的設(shè)計；②突變基因堿基序列的確定；③突變基因的獲得；④新酶的獲得。酶分子組成單位修飾的作用。答:酶分子組成單位修飾的作用：①提高酶的催化效率；②增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性；③改變酶的專一性；④獲得各種核酸類酶。金屬離子置換修飾的主要過程及修飾后酶的催化特性會如何變化？答:金屬離子置換修飾的主要過程：酶的分離純化：首先將欲進(jìn)行修飾的酶經(jīng)過分離純化，除去雜質(zhì)，獲得具有一定純度的酶液。除去原有的金屬離子：在經(jīng)過純化的酶液中加入一定量的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金屬離子與EDTA等形成螯合物。通過透析、超濾、分子篩層析等方法，將EDTA-金屬螯合物從酶液中除去。此時，酶往往成為無活性狀態(tài)。加入置換離子：于去離子的酶液中加入一定量的另一種金屬離子，酶蛋白與新加入的金屬離子結(jié)合，除去多余的置換離子，就可以得到經(jīng)過金屬離子置換后的酶修飾后酶的催化特性的變化：①提高酶的催化效率；②增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性；③改變酶的動力學(xué)特征。酶分子的物理修飾一般在什么樣的條件下進(jìn)行？物理修飾有什么特點？答：物理修飾的條件是一般是在極端條件下，如高溫、高壓、高鹽、極端pH值、有毒環(huán)境等。物理修飾的特點：在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分子中的共價鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排，使酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變。酶基因體外隨機(jī)突變的常用方法及其特點。答:如下表：體外隨機(jī)突變方法特點易錯PCR技術(shù)從單一基因出發(fā)，通過改變PCR反應(yīng)條件，在基因擴(kuò)增過程中使堿基配對出現(xiàn)錯誤而引起基因突變。基因重排技術(shù)從兩條以上的正突變基因出發(fā)，經(jīng)過酶切，不加引物的PCR擴(kuò)增，使堿基序列重新排布而引起基因突變?；蚣易逯嘏偶夹g(shù)從基因家族的若干同源基因出發(fā)，經(jīng)過酶切和不加引物的PCR擴(kuò)增，使堿基序列重新排布而引起基因突變。DNA重排技術(shù)的主要過程有哪些步驟？它與基因家族重排技術(shù)有何異同？答：DNA重排技術(shù)的主要過程：從兩種或多種同源正突變基因通過脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）等酶的作用，隨機(jī)切割成若干DNA片段，然后將這些隨機(jī)片段在不加引物的條件下經(jīng)過多次PCR循環(huán)，使這些DNA隨機(jī)片段互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增、延伸、獲得全長的基因。這些基因全長基因由于是在不加引物的條件下由DNA隨機(jī)片段互為模板和引物擴(kuò)增而成，其堿基序列經(jīng)過重新排布而形成眾多的突變基因。分離全長基因以后，可加入引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，使這些全長突變基因進(jìn)行擴(kuò)增，以便進(jìn)行定向選擇。相同點：兩者原理相同，反應(yīng)過程也相同。不同點：DNA重排從通過易錯PCR等技術(shù)獲得兩個以上正突變基因出發(fā)進(jìn)行重排；基因家族重排從基因家族中若干同源基因出發(fā)進(jìn)行重排。構(gòu)建突變基因文庫的主要過程。答：突變基因文庫的主要過程：選擇合適的載體（質(zhì)粒、噬菌體、黏粒、噬菌粒）；基因重組（DNA連接酶連接突變基因和載體DNA）；組裝突變基因文庫（轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成有感染活性的重組噬菌體）。簡述突變基因定向選擇的過程。答：突變基因定向選擇的過程：突變基因與適宜的載體進(jìn)行重組；組裝形成突變基因文庫（細(xì)胞或噬菌體）；通過高通量篩選技術(shù)獲得目的基因；目的基因表達(dá)獲得所需進(jìn)化酶。固定化酶有什么特點？答：固定化酶特點：不溶于水：反應(yīng)完成后，經(jīng)過濾或離心等簡單分離，就可以回收，以重復(fù)使用，降低酶制劑成本。具有一定的機(jī)械強(qiáng)度：可將其裝成酶柱，當(dāng)?shù)孜锶芤壕従徚鹘?jīng)酶柱時，就能發(fā)生酶促反應(yīng)，流出液中，即含有酶促反應(yīng)產(chǎn)物，其產(chǎn)物不易帶雜質(zhì)，收率高，易精制。穩(wěn)定性提高：酶柱往往可以連續(xù)使用數(shù)十次，而酶活力并無明顯下降。常用的固定化方法有哪些？各自的優(yōu)缺點如何？答：其固定方法有吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法、熱處理法。1、吸附法：通過載體表面和酶分子表面之間的氫鍵、疏水鍵和電子親和力等物理作用力，將酶固定于不溶性載體的方法，稱為物理吸附法，簡稱吸附法。優(yōu)點：條件溫和，操作簡便，酶活力損失少。缺點：結(jié)合力弱，易解吸附。2、包埋法：將酶或含酶細(xì)胞包埋于各種多孔載體中，使酶固定化的方法，稱為包埋法。優(yōu)點：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。3、結(jié)合法：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵，與酶結(jié)合在一起的固定化方法。（1）離子鍵結(jié)合法特點：活力損失小，但由于離子鍵結(jié)合，結(jié)合力弱，酶與載體之間結(jié)合不牢固，在pH、離子強(qiáng)度等條件改變時，酶易脫離。（2）共價鍵結(jié)合法(共價偶聯(lián)法)特點：結(jié)合很牢固，酶不會脫落，可以連續(xù)使用較長時間。但載體活化的操作復(fù)雜，同時由于共價結(jié)合時可能影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。4.交聯(lián)法：利用雙功能試劑或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋白間或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以共價鍵制備固定化酶的方法。優(yōu)點：結(jié)合牢固，可長時間使用缺點：(1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。5.熱處理法：將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在細(xì)胞內(nèi)，而制備得到固定化細(xì)胞。特點：只適用于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，在加熱處理時，要嚴(yán)格控制好加熱溫度和時間，以免引起酶的變性失活。固定化方法吸附法包埋法離子鍵結(jié)合法共價鍵結(jié)合法交聯(lián)法制備難易易較難易難較難結(jié)合程度弱強(qiáng)中等強(qiáng)強(qiáng)活力回收高高高低中等再生可能不能可能不能不能費用低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變包埋法包括哪兩種？它們有什么異同？答：包埋法主要包括凝膠包埋法、半透膜包埋法。相同點：都是利用膜的性質(zhì)固定，不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。不同點：凝膠包埋法所用的凝膠膜可以根據(jù)酶的大小來控制適宜的孔的大小。而半透膜的孔徑是固定的。結(jié)合法包括哪兩種？它們之間有什么異同？答：包括離子鍵結(jié)合法和共價鍵包埋法。相同點：都是通過穩(wěn)定的化學(xué)鍵將酶或細(xì)胞固定在載體上的方法。不同點：①離子鍵結(jié)合法所用載體一般是某些不溶于水的離子交換劑。而共價鍵結(jié)合法一般多用親水載體，且載體必須先活化；②離子鍵結(jié)合法酶與載體的結(jié)合較弱，而共價鍵結(jié)合法結(jié)合力很強(qiáng)。微生物細(xì)胞、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、原生質(zhì)體最常用的固定化方法分別是什么？答：微生物細(xì)胞固定化方法：吸附法、包埋法、直接固定法；植物細(xì)胞固定化方法：主要為吸附法與包埋法；動物細(xì)胞固定化方法：主要為吸附法與包埋法；原生質(zhì)體固定化方法：主要采用凝膠包埋法。固定化細(xì)胞有什么特點？（大題）固定化微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞和原生質(zhì)體又分別有什么特點？（小題）答：固定化細(xì)胞的特點：①優(yōu)越性——降低成本，省去酶的分離純化工作；既可作為單一酶，也可作為復(fù)合酶系完成部分代謝過程。②局限性——細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會形成不需要的副產(chǎn)物；細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用。1、固定化植物細(xì)胞特點：植物細(xì)胞經(jīng)固定化后，由于有載體的保護(hù)作用，可減輕剪切力和其他外界因素對植物細(xì)胞的影響．提高植物細(xì)胞的存活率和穩(wěn)定性。細(xì)胞經(jīng)固定化后，被束縛在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動，不容易聚集成團(tuán)。固定化植物細(xì)胞發(fā)酵可以簡便地在不同的培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液，即首先在生長培養(yǎng)基中生長增殖，在達(dá)到一定的細(xì)胞密度后，改換成發(fā)酵培養(yǎng)基，以利于生產(chǎn)各種所需的次級代謝物。固定化植物細(xì)胞可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的一段時間，大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率。固定化植物細(xì)胞易于與培養(yǎng)液分離，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。2、固定化動物細(xì)胞特點：提高細(xì)胞存活率：動物細(xì)胞經(jīng)固定化后，由于有載體的保護(hù)作用，可以減輕或免受剪切力的影響，同時動物細(xì)胞可附著在載體表面生長，從而可顯著提高動物細(xì)胞的存活率。提高產(chǎn)率：動物細(xì)胞固定化后，可先在生長培養(yǎng)基中繁殖，使細(xì)胞在載體上形成最佳分布并達(dá)到一定的細(xì)胞密度。然后可簡便地改換成發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵條件，使細(xì)胞從生長期轉(zhuǎn)變到生產(chǎn)期。以利于提高產(chǎn)率。可反復(fù)使用：固定化動物細(xì)胞可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的時間，利于連續(xù)化自動化生產(chǎn)。易于與產(chǎn)物分開：固定化細(xì)胞易于與產(chǎn)物分開，利于產(chǎn)物分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。3、固定化原生質(zhì)體的特點：固定化原生質(zhì)體由于解除了細(xì)胞壁這一擴(kuò)散屏障可增加細(xì)胞膜的通透性。有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和吸收，也有利于胞內(nèi)物質(zhì)的分泌，可顯著提高產(chǎn)率。固定化原生質(zhì)體由于有載體的保護(hù)作用，具有較好的操作穩(wěn)定性和保存穩(wěn)定性，可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的時間，利于連續(xù)化生產(chǎn)。在冰箱保存較長時間后仍能保持其生產(chǎn)能力。固定化原生質(zhì)體易于和發(fā)酵產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。固定化原生質(zhì)體發(fā)酵的培養(yǎng)基中需要添加滲透壓穩(wěn)定劑，以保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。這些滲透壓穩(wěn)定劑在發(fā)酵結(jié)束后，可用層析或膜分離技術(shù)等方法與產(chǎn)物分離。防止細(xì)胞壁的再生，可添加一些抗生素和酶。4、固定化微生物細(xì)胞的特點：固定化微生物細(xì)胞保持了細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)和天然狀態(tài)，穩(wěn)定性好固定化微生物細(xì)胞保持了細(xì)胞內(nèi)原有的酶系、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，可以按照原來的代謝途徑進(jìn)行新城代謝，并進(jìn)行有效的代謝調(diào)節(jié)控制發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以反復(fù)使用或者連續(xù)使用較長的一段時間。固定化微生物細(xì)胞密度提高，可以提高產(chǎn)率提高固定化工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性。固定化原生質(zhì)體的制備過程中有什么注意事項？答：固定化原生質(zhì)體的制備過程的注意事項：加入適當(dāng)?shù)臐B透壓穩(wěn)定劑，防止原生質(zhì)體破裂。應(yīng)選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞制備原生質(zhì)體，以獲得較高的原生質(zhì)體形成率并保證原生質(zhì)體的濃度。加入胞壁溶解酶的種類、濃度、酶作用溫度、pH值及作用時間需經(jīng)過預(yù)試以確定最佳作用條件。添加青霉素和酶以防止細(xì)胞壁再生。常用的非水介質(zhì)體系包括哪幾種？其中有機(jī)溶劑系統(tǒng)又包括哪幾種？答：常用的非水介質(zhì)體系包括：①有機(jī)溶劑系統(tǒng)（包括水不互溶有機(jī)溶劑單相體系、水互溶有機(jī)溶劑單相體系、水-有機(jī)溶劑兩相體系、反相膠束體系）；②超臨界流體體系；③離子液體系；④氣相體系；⑤低共熔混合體系。試述水在非水介質(zhì)體系中的作用。答：酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進(jìn)行催化反應(yīng)。所以酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)時，水是不可缺少的成分之一。水對酶分子空間構(gòu)象的影響酶分子只有在空間構(gòu)象完整的狀態(tài)下，才具有催化功能。在無水的條件下，酶的空間構(gòu)象被破壞，酶將變性失活。酶分子需要一層水化層，以維持其完整的空間構(gòu)象。維持酶分子完整的空間構(gòu)象所必需的最低水量稱為必需水，屬于結(jié)合水。必需水與酶分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有密切關(guān)系。不同的酶，所要求的必需水的量有差別。水對酶催化反應(yīng)速度的影響有機(jī)介質(zhì)中水的含量對酶催化反應(yīng)速度有顯著影響。在催化反應(yīng)速度達(dá)到最大時的水含量稱為最適水含量。最適水含量受有機(jī)溶劑和載體性質(zhì)的影響，在實際應(yīng)用時應(yīng)當(dāng)根據(jù)實際情況，通過實驗確定最適水含量。水對酶活性和選擇性的調(diào)節(jié)——水活度一般用水活度來描述酶活性和水之間的關(guān)系。水活度是指體系中水的逸度與純水逸度之比。通?？梢杂皿w系中水的蒸汽壓與相同條件下純水的蒸汽壓之比表示。即：Aw=YwP/P0（P：在一定條件下體系中的蒸汽壓；P0：在相同條件下純水的蒸汽壓；Yw：氣相中水的摩爾分?jǐn)?shù)）。最佳水活度（0.55）即酶活力最高時的水活度，與體系中水的含量和溶劑的極性大小無關(guān)、，也不受固定化載體的影響。所以采用水活度作為參數(shù)來研究有機(jī)介質(zhì)中水對酶催化作用的影響更為確切。為什么用水活度描述有機(jī)溶劑中酶活性與水含量之間的關(guān)系？答：其原因有以下幾點：水活度可以直接反映出體系中水分情況，與反應(yīng)體系中水含量的和有機(jī)溶劑的極性無關(guān)。微水相是由固相（酶和載體）、液相（溶劑）和氣相（溶劑上的空間）組成的多相系統(tǒng)，平衡狀態(tài)時各相的水活度相同。水活度不受固定化載體的影響。3）水活度容易測定，用反應(yīng)體系平衡后的氣相相對濕度來表示酶在非水介質(zhì)體系中具有最大催化活性時的水活度為什么都在0.55左右？答：因為酶在非水相介質(zhì)中的最大催化活性與體系中水的含量和溶劑的極性大小無關(guān)，也不受固定化載體的影響。所以采用水活度作為參數(shù)來研究有機(jī)介質(zhì)中水對酶催化作用的影響更為確切，且都在0.55左右。試述有機(jī)溶劑在非水介質(zhì)體系中的作用。答：有機(jī)溶劑在非水介質(zhì)體系中的作用有以下幾點：有機(jī)溶劑對酶結(jié)構(gòu)與功能的影響在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以較好地保持其完整的空間結(jié)構(gòu)。在有機(jī)溶劑中，酶分子（經(jīng)過修飾后可溶于有機(jī)溶劑者除外）不能直接溶解，而是懸浮在溶劑中進(jìn)行催化反應(yīng)。根據(jù)酶分子的特性和有機(jī)溶劑的特性的不同，保持其空間結(jié)構(gòu)完整性的情況也有所差別。有些酶在有機(jī)溶劑的作用下，其空間結(jié)構(gòu)會受到某些破壞，從而使酶的催化活性受到影響甚至引起酶的變性失活。有機(jī)溶劑對水的影響有機(jī)介質(zhì)的極性越強(qiáng)，與水分子的相互作用越強(qiáng)，進(jìn)而奪取酶分子表面的必需水，所以水含量必需增大才能維持酶活性。3）有機(jī)溶劑對酶活性中心結(jié)合位點的影響當(dāng)酶懸浮于有機(jī)溶劑中，有一部分溶劑能滲入到酶分子的活性中心，與底物競爭活性中心的結(jié)合位點，降低底物結(jié)合能力，從而影響酶的催化活性。有機(jī)溶劑分子進(jìn)入酶的活性中心，會影響活性中心的極性，可能降低酶與底物的結(jié)合能力。4）有機(jī)溶劑對酶活性的影響極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，如甲醇、乙醇等，會奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而降低酶的催化活性，甚至引起酶的變性失活。因此應(yīng)選擇好所使用的溶劑，控制好介質(zhì)中的含水量，如使用能與酶分子形成氫鍵