T-GXTC 0011-2024 基于酶聯(lián)免疫法（ELISA）甘蔗宿根性早期評價

ICS65.020.20CCSB05GXTC（完成時間：2024年7月3日星期三）T/GXTC0011—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所提出并宣貫。本文件由廣西熱帶作物學(xué)會歸口。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所、廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、廣西高豐農(nóng)業(yè)有限公司。本文件主要起草人：程琴、李茹、周全光、農(nóng)澤梅、呂平、盧業(yè)飛、歐克緯、王麗萍、李慧敏、曾1T/GXTC0011—2024基于酶聯(lián)免疫法（ELISA）甘蔗宿根性早期評價本文件規(guī)范了基于酶聯(lián)免疫法（ELISA）甘蔗宿根性早期評價的術(shù)語和定義、原理、材料和試劑、儀器設(shè)備、檢測步驟和數(shù)據(jù)處理。本文件適用于甘蔗組培苗、種苗、種莖及大田植株的宿根蔗宿根性的早期評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1甘蔗宿根性Sugarcaneperennial甘蔗宿根性是指甘蔗在收斬后留下的地下蔗莖和根系繼續(xù)存活并再次發(fā)株的能力，其強弱表現(xiàn)在宿根發(fā)株的快慢強弱和數(shù)量，最終成莖率、有效莖數(shù)和產(chǎn)蔗量高低等。3.2酶聯(lián)免疫法Enzymelinkedimmunosorbentassay酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是一種將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體結(jié)合的專一性進行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法。3.3縮略語Acronym下列縮略語適用于本文件。ABA:脫落酸(Abscisicacid)IAA:生長素(Indoleaceticacid)GA3:赤霉素(Gibberellin)CAT:過氧化氫酶(Catalase)SOD:超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)PAL:苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonia-lyase)SS:蔗糖合成酶(Sucrosesynthase)4原理在甘蔗宿根性的研究中，植物激素如生長素（IAA）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）等，可能影響蔗芽的萌發(fā)、根系的發(fā)育和植株的整體生長。過氧化氫酶（CAT）、植物苯丙氨酸解氨酶（PAL）與宿根性正相關(guān)，而植物蛋白酶（Prot）、植物蔗糖合成酶（SS）指示植物對逆境的響應(yīng)能力，它與宿根性負(fù)相關(guān)。通過測量與這些過程相關(guān)的激素和酶含量，可以間接反映甘蔗的宿根性。樣品經(jīng)處理后，采用ELISA試劑盒進行酶聯(lián)免疫吸附分析，用酶標(biāo)儀在相應(yīng)波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中植物激素和酶的濃度。2T/GXTC0011—2024將得到內(nèi)源激素和酶的濃度值，采用改進的極點排序法進行評分，得到各指標(biāo)的的權(quán)重系數(shù)，根據(jù)鑒評矩陣得到各品系各指標(biāo)的對應(yīng)得分，得分與各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)相乘即為最后綜合評價值，綜合評價值越高，說明該品系的宿根性越好。5材料和試劑5.1材料種植在同一地塊、同種栽培管理方式、同一宿根年限、不同甘蔗品種的宿根蔗，采取甘蔗萌發(fā)初期的幼根為檢測材料。5.2試驗設(shè)計及田間管理試驗采用隨機區(qū)組田間設(shè)計，5行區(qū)，行長7m，行距1.2m，每個品種種植3個小區(qū)。新植蔗當(dāng)年3月種植，采用雙芽種莖以雙行品字形排列種植，下種密度為12.8芽/m。新植蔗成熟后于次年1月收獲，保留宿根，宿根蔗次年1月收獲。新植蔗和宿根蔗的田間管理均與當(dāng)?shù)馗收岣弋a(chǎn)栽培管理相同。5.3ELISA試劑盒IAA檢測試劑盒、ABA檢測試劑盒、GA3檢測試劑盒、CAT檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、Prot檢測試劑盒、PAL檢測試劑盒、SS檢測試劑盒。除另有說明外，所用試劑均為分析純，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中三級水的要求。見附錄A。6儀器設(shè)備6.1分光光度計波長范圍（325nm～800nm），波長準(zhǔn)確度(±2nm）。6.2酶標(biāo)儀波長范圍（200nm～1000nm）,精度：SD<0.001Abs或CV<0.5%，@450nm(0Abs～3Abs)。6.3培養(yǎng)箱控溫范圍：RT+5～RT+65，輸入功率：450W，定時范圍：1min～9999min。6.4移液器10μL～100μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。6.5離心機轉(zhuǎn)速100rpm～14800rpm，步長100rpm，容量1.5mL/2.0mL×24，溫控-20℃~40℃。7檢測步驟7.1試樣的采集與準(zhǔn)備在宿根蔗萌發(fā)出芽，二葉期開始取樣，挖取蔗蔸，剪取嫩根進行內(nèi)源激素、酶含量測定，每個樣品取2g，每個樣品3個重復(fù)，取樣時先用清水洗干凈根部，再用錫箔紙包好，寫上標(biāo)簽，裝在預(yù)冷的凍存管，迅速放入液氮保存?zhèn)溆谩?.2樣品溶液的準(zhǔn)備取回的嫩根（步驟7.1）加入2mL生理鹽水冰浴研磨搗碎，4℃,9550rpm離心10分鐘，取上清液，待測。7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制3T/GXTC0011—2024以水為參比液，在波長450nm處，用1cm比色皿在分光光度計上測定標(biāo)準(zhǔn)比色液的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程式。7.4試樣的測定在酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加稀釋液50μL，待測樣品孔中先加稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL。按照酶聯(lián)免疫試劑盒所述操作步驟對待測試樣（液）進行定量檢測，重復(fù)三次。8數(shù)據(jù)處理8.1待測液濃度計算按照試劑盒說明書提供的計算方法以及計算機軟件，將待測液吸光度代入7.3所獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測液濃度。8.2宿根性強弱評價方法采用WPS軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖。將參與評價指標(biāo)相對數(shù)據(jù)劃分為5級。對每一品種所測指標(biāo)相對值進行分級，使每一指標(biāo)都得到相應(yīng)級別值。公式為：D=(Hmax-Hmin)/5（1）E=[(H-Hmin)/D]+1（2）式中，Hmax為各指標(biāo)相對數(shù)據(jù)最大值；Hmin為各指標(biāo)相對數(shù)據(jù)最小值；H為各指標(biāo)相對數(shù)據(jù)任意值；D為得分級差（每得1分之差）；E為各材料每個指標(biāo)的級別值。通過計算可以得到鑒評矩陣。權(quán)重系數(shù)為每一指標(biāo)在綜合評價中的權(quán)重，計算公式為：任意指標(biāo)權(quán)重系數(shù)B=任意指標(biāo)變異系數(shù)/各指標(biāo)變異系數(shù)之和（3）綜合評價值其計算公式為：Vi=ΣEij×Bj（i=1，2…8；j=1，2…4）,（4）式中，Vi為每一份材料綜合評價值；Eij為各相對數(shù)據(jù)的級別值；Bj為對應(yīng)指標(biāo)權(quán)重系數(shù)。8.3宿根性強弱判定標(biāo)準(zhǔn)甘蔗宿根性強弱根據(jù)綜合評價值Vi確定，Vi