T-HBIQA 0008-2024 人體血液中卡瑞利珠藥物含量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質譜法

ICS01.040.11CCSC10/29T/HBIQADeterminationofcamrelizumabinhumanbloodbyHPLC-MS/MS2024-08-15發(fā)布河北省檢驗檢疫學會發(fā)布T/HBIQA0008—2024本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由河北省檢驗檢疫學會提出并歸口。本文件起草單位：河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院、河北大學。本文件主要起草人：李揮、宋莉、李怡霖、梁艷、劉亞楠。1T/HBIQA0008—2024人體血液中卡瑞利珠藥物含量的測定高效液相色譜-串聯(lián)質譜法本文件規(guī)定了人體血液中卡瑞利珠藥物含量的高效液相色譜-串聯(lián)質譜檢測方法。本文件適用于人體血液中卡瑞利珠藥物含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理樣品經甲醇沉淀后用100mM的碳酸氫銨溶液復溶，加入100mMDTT和200mMIAM后酶解過夜，進行液相色譜-串聯(lián)質譜法測定，外標法定量。5試劑和材料5.1試劑和材料除另有規(guī)定外，試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1.2乙腈：色譜純。5.1.3甲酸：色譜純。5.1.4100mM碳酸氫銨溶液：取158.1mg碳酸氫銨（精確到0.01mg）溶于20mL量瓶中，用水定容至刻度。2T/HBIQA0008—20245.1.5100mMDTT溶液：取DTT（MW154.3）154mg（精確到0.01mg）于10mL量瓶中，用100mM的碳酸氫銨溶液（5.1.4）定容至刻度。5.1.6200mMIAM溶液：取IAM（MW185.0）370mg（精確到0.01mg）于10mL量瓶中，用100mM的碳酸氫銨溶液（5.1.4）定容至刻度。5.1.71mg/mL胰酶溶液。5.1.8標準品：卡瑞利珠的純度大于等于98%（CAS號：1798286-48-2）。5.1.9標準儲備溶液的配制：取卡瑞利珠1mg（精確到0.01mg）于1.5mL離心管中，加入500μL100mM碳酸氫銨溶液（5.1.4），配制成卡瑞利珠的儲備溶液，于-20℃保存至分析。5.1.100.1%（體積分數）甲酸水溶液：準確移取甲酸1.0mL置于1L量瓶中，用水定容至刻度，混6儀器設備6.1液相色譜-串聯(lián)質譜儀：配備電噴霧離子源（ESI）。6.2恒溫水浴鍋。6.3渦旋振蕩器。6.4電子分析天平（精度0.01mg）。6.5高速冷凍離心機（最高轉速22000rpm）。7試樣制備全部血液樣本充分混勻后，在4℃、3000r/min條件下離心10min，取管內上清液分裝，-80℃儲存待測。8試驗步驟8.1試樣預處理取100μL血液試樣（7）于1.5mL離心管中，準確加入100μL甲醇沉淀血液中在17000r/min，4℃的條件下冷凍離心20min，棄去上清液后加入200μL100mM碳酸氫銨溶液（5.1.4）復溶；加100mMDTT溶液（5.1.5）適量，使終濃度為5mM，在56℃下孵育30min；室溫冷卻后加200mMIAM溶液（5.1.6）適量，使終濃度為10mM，避光靜置15min。最后加入4μL胰酶溶液，在37℃3T/HBIQA0008—2024下孵育過夜12h后加入1μL甲酸終止酶解反應，經17000r/min，4℃冷凍離心20min，將100μL上清轉移至潔凈干燥的液相小瓶，進機分析。8.2標準曲線取相應的空白樣品，按照7步驟進行處理，用得到的空白樣品提取液，將標準儲備溶液逐級稀釋以制備一系列濃度為4、10、15、20、40、80、100和160μg/mL的卡瑞利珠藥物。得到的系列標準工作溶液，濃度由低到高進行檢測，以定量離子峰面積對質量濃度作圖，做出標準曲線回歸方程。8.3儀器參考條件8.3.1液相色譜參考條件a.色譜柱：AgilentPoroshell120EC-C18（2.1×100mm，1.9μm），或相當者。b.流動相：A相為0.1%甲酸水溶液；B相為乙腈。c.柱溫：40℃。d.進樣體積：5μL。e.流速：0.3mL/min。梯度洗脫程序見表1：表1梯度程序洗脫表時間/min流動相A/%流動相B/%1955755459257590909559558.3.2質譜參考條件a.電離方式：電噴霧電離，正離子掃描模式。b.電噴霧電壓：5500V。c.離子源溫度：500℃。d.霧化氣：60psi。e.輔助氣：60psi。4T/HBIQA0008—2024f.氣簾氣：30psi。其他質譜條件見附錄A。8.4測定8.4.1測定步驟將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質譜儀中，得到卡瑞利珠的質譜響應值，根據標準曲線得到待測液中卡瑞利珠藥物的濃度。樣品溶液中各組分的響應值應在標準曲線的線性范圍內，超過線性范圍則應稀釋后再進樣測定。8.4.2定性判定在相同條件測定樣品溶液和標準溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時間與標準溶液中的某種組分峰的保留時間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對子離子的質荷比一致，樣品溶液中定性離子相對豐度與濃度相當標準工作溶液中定性離子的相對豐度進行比較時，相對偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在該組分?？ㄈ鹄闃藴饰镔|的色譜圖參見附錄B。表2定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度>50%>20%~50%>10%~20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%8.4.3數據計算血液樣本中藥物濃度含量為：式中:Xi——試樣中待測組分含量，單位為微克每升(μg/mL)；ρi——由標準曲線得出的測試液中某種組分的質量濃度，單位為微克每升(μg/L)；V定容——定容體積，單位為毫升(mL)；K——稀釋倍數；V試樣——試樣體積，單位為毫升(mL)。5T/HBIQA0008—2024計算結果保留三位有效數字。8.5空白試驗取空白血樣，均按8.1-8.4測定步驟進行。8.6定量限和重復性本方法卡瑞利珠的定量限為4μg/mL。8.6.2重復性在重復性實驗條件下獲得兩次獨立實驗結果的絕對差值不得超過算數平均值的15%。6T/HBIQA0008—2024（資料性附錄