海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程

海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍本文件確立了海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)程序，規(guī)定了監(jiān)測(cè)方案設(shè)計(jì)、樣品采集、保存與運(yùn)輸、樣品檢測(cè)、質(zhì)量控制、監(jiān)測(cè)報(bào)告等技術(shù)要求，描述了數(shù)據(jù)分析方法。本文件適用于海洋動(dòng)物資源的遺傳多樣性監(jiān)測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T12763.6海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢驗(yàn)第2部分：抽樣方法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。

遺傳多樣性geneticdiversity種內(nèi)不同群體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異總和。監(jiān)測(cè)程序海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)程序包括監(jiān)測(cè)方案設(shè)計(jì)、樣品采集、保存與運(yùn)輸、樣品檢測(cè)、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析、監(jiān)測(cè)報(bào)告，程序見圖1。監(jiān)測(cè)程序圖監(jiān)測(cè)方案設(shè)計(jì)明確監(jiān)測(cè)海域、監(jiān)測(cè)周期、監(jiān)測(cè)時(shí)間、樣品采集、保存和運(yùn)輸、樣品檢測(cè)方法、監(jiān)測(cè)指標(biāo)、質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)分析、監(jiān)測(cè)報(bào)告等。其中，對(duì)調(diào)查海域某種野生海洋動(dòng)物資源的遺傳多樣性監(jiān)測(cè)，宜每5年～10年開展1次；對(duì)人工增殖物種宜每年開展1次。樣品采集、保存與運(yùn)輸采樣地點(diǎn)采樣地點(diǎn)可根據(jù)調(diào)查需求選擇：現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采樣：按GB/T12763.6規(guī)定執(zhí)行。對(duì)海洋底棲動(dòng)物、潮間帶動(dòng)物進(jìn)行定點(diǎn)采樣，對(duì)移動(dòng)迅速的底棲動(dòng)物可設(shè)地籠誘捕。對(duì)游泳能力強(qiáng)的魚類、甲殼類等進(jìn)行拖網(wǎng)采樣；非現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采樣：從調(diào)查海域捕撈作業(yè)船、漁港或市場(chǎng)直接采集來自目標(biāo)海域的新鮮漁獲物，采樣方法按GB/T18654.2規(guī)定執(zhí)行。采樣數(shù)量及方法按形態(tài)學(xué)分類后，每個(gè)調(diào)查海域應(yīng)采集同一物種30個(gè)以上獨(dú)立個(gè)體作為一批樣品；保護(hù)動(dòng)物和珍稀瀕危動(dòng)物難以達(dá)到該數(shù)量的，可積累該海域一定時(shí)期內(nèi)多次調(diào)查采集的不同個(gè)體，以實(shí)際采集到的個(gè)體數(shù)為準(zhǔn)。根據(jù)監(jiān)測(cè)對(duì)象不同，可分別選擇以下采樣方法：通常采取海洋動(dòng)物整體；對(duì)大型海洋動(dòng)物實(shí)行部分采樣，取肌肉組織約0.5?g；對(duì)海洋保護(hù)動(dòng)物、珍稀瀕危生物實(shí)行非致死性采樣：視監(jiān)測(cè)生物的具體情況，無菌操作剪取部分魚類鰭條組織約0.1?g，或用無菌注射器于尾靜脈處抽取血液約0.5?mL；貝類無菌取小部分外套膜組織；蟹類用無菌注射器從第3步足基節(jié)關(guān)節(jié)膜處刺入抽取血淋巴0.1?mL。采樣記錄采集的每批樣品分別填寫樣品采集記錄，格式參見附錄A。樣品保存與運(yùn)輸整體采樣的個(gè)體應(yīng)保持完整；部分采樣的組織應(yīng)每個(gè)個(gè)體獨(dú)立包裝。采樣后宜立即冷凍保存，不具備冷凍條件的4?℃～10?℃冷藏，冷藏時(shí)間不宜超過24?h。樣品運(yùn)輸過程中應(yīng)保證溫度在10?℃以下。體積小于1?cm3的樣品或組織，可量取加入10倍以上體積的乙醇（95%以上）或商品化的樣品保存溶液浸泡，常溫保存與運(yùn)輸。樣品檢測(cè)方法原理利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）技術(shù)、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)，對(duì)海洋動(dòng)物線粒體DNA中進(jìn)化速度最快的部分序列，通常采用線粒體控制區(qū)（D-loop）序列，不適用D-loop序列的物種可采用細(xì)胞色素b（cytochromeb，Cytb）、細(xì)胞色素氧化酶I（CytochromeoxidaseI，COI）基因或其他線粒體基因序列，進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析，獲得群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)。DNA提取取海洋動(dòng)物肌肉或鰭條組織約0.1g，液氮冷凍研磨、組織勻漿或剪碎后，用酚-氯仿法或動(dòng)物組織DNA提取試劑盒提取總DNA；血液樣品用血液DNA提取試劑盒提取總DNA。樣品檢測(cè)所用設(shè)備和試劑參見附錄B。酚-氯仿法提取DNA的步驟參見附錄C；用商品化試劑盒提取DNA，操作步驟按說明書進(jìn)行。DNA質(zhì)量檢測(cè)提取的DNA用洗脫液或滅菌雙蒸水溶解，取5?μL經(jīng)1%X脂糖凝膠電泳，檢查DNA質(zhì)量，電泳方法參見附錄D，或取適量DNA溶液用核酸定量分析儀測(cè)定，A260/A280比值為1.8～2.0，DNA濃度不低于50?ng/μL。經(jīng)檢測(cè)DNA質(zhì)量良好后，-20?℃以下冷凍備用。引物選擇引物設(shè)計(jì)與合成引物宜引用已公開發(fā)表學(xué)術(shù)論文或研究報(bào)告，或在基因數(shù)據(jù)庫中搜索目標(biāo)物種的線粒體DNA序列自行設(shè)計(jì)2對(duì)～3對(duì)，引物宜符合Tm值50?℃～60?℃、長(zhǎng)度18?bp～24?bp、G+C含量在40%～60%、PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度400?bp～600?bp。引物序列通過DNA序列比對(duì)工具與目的序列比對(duì)驗(yàn)證，檢查校正無誤后合成。引物篩選用合成的引物對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。按每對(duì)引物的Tm值設(shè)定退火溫度，按進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的X脂糖凝膠電泳后，選擇PCR產(chǎn)物條帶單一、清晰、且長(zhǎng)度與預(yù)期一致的引物，作為該物種的遺傳多樣性監(jiān)測(cè)引物。DNA擴(kuò)增PCR反應(yīng)液配方參見附錄E。PCR反應(yīng)程序：94?℃變性5?min；94?℃變性30?s，X?℃退火30?s（其中X視不同引物的具體Tm值確定），72?℃延伸30?s～60?s，35個(gè)循環(huán)；72?℃延伸10?min，4?℃保溫。PCR產(chǎn)物回收、純化與序列測(cè)定對(duì)所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的X脂糖凝膠電泳，選擇單一、清晰、且長(zhǎng)度與預(yù)期一致的條帶，回收純化目的片段后測(cè)序，或PCR產(chǎn)物直接雙向測(cè)序。質(zhì)量控制每批PCR應(yīng)同時(shí)做空白、陰性、陽性對(duì)照，模板依次為無菌超純水、近源種總DNA溶液、目標(biāo)物種總DNA溶液。X脂糖凝膠電泳時(shí)，每排樣品中至少要同時(shí)加一個(gè)合適的DNA分子量梯度標(biāo)準(zhǔn)品。數(shù)據(jù)分析對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)、剪切和聚類分析，用最大合成似然法（MaximumCompositeLikelihood，MCL）計(jì)算群體間或群體內(nèi)個(gè)體間遺傳距離，計(jì)算單倍體多樣性（樣本中隨機(jī)抽取到兩個(gè)不同單倍型的頻率）、平均核苷酸變異數(shù)（所有個(gè)體的核苷酸變異數(shù)之和與個(gè)體數(shù)的比值）、核苷酸多樣性（平均核苷酸差異數(shù)與序列長(zhǎng)度的比值）等遺傳多樣性數(shù)據(jù)。分析結(jié)果格式參見附錄F。監(jiān)測(cè)報(bào)告監(jiān)測(cè)報(bào)告的內(nèi)容應(yīng)包括前言、項(xiàng)目概況、每種生物的監(jiān)測(cè)結(jié)果、與歷史記錄比較變化情況、遺傳多樣性保護(hù)存在的問題及保護(hù)建議等。

（資料性）

樣品采集記錄海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性監(jiān)測(cè)采樣記錄見表A.1。樣品采集記錄表種名樣品編號(hào)樣品數(shù)量樣品規(guī)格采樣時(shí)間樣品捕撈海域采樣方式現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采樣：定點(diǎn)；地籠；拖網(wǎng)非現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采樣采樣地點(diǎn)經(jīng)度：緯度：碼頭/市場(chǎng)樣品組織整體；肌肉；血液；鰭條；其他：樣品外觀鮮活；新鮮；變質(zhì)保存方式活體；冷凍；冰鮮；常溫；其他：備注采樣人：復(fù)核人：

（資料性）

設(shè)備與試劑儀器設(shè)備與耗材儀器設(shè)備與耗材應(yīng)符合以下要求：高壓蒸汽滅菌器；電子天平：精度大于等于0.001?g；高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于12?000?r/min；移液器：1?000?μL、200?μL、100?μL、10?μL、2.5?μL；PCR儀；水平凝膠電泳系統(tǒng)；凝膠成像系統(tǒng)；核酸定量分析儀；無菌離心管：1.5?mL、0.2?mL；無菌移液器吸頭：1?000?μL、200?μL、10?μL。試劑及其配制除特別說明外，本文使用試劑均為分析純?cè)噭渲圃噭┯盟畱?yīng)為滅菌雙蒸水或去離子水。所需試劑及配制方法如下：蛋白酶K（20?mg/mL）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）裂解液：CTAB20?g溶于1?000?mLTE緩沖液（Tris-HCl1?mol/L，EDTA0.5?mol/L，pH=8.0），高壓滅菌備用；乙醇：75%、95%以上；Taq酶；脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）；PCR緩沖液；X脂糖；核酸染料；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；6×上樣緩沖液；Tris飽和酚（pH=8.0）；三氯甲烷；TBE緩沖液：Tris108?g，EDTA-Na27.44?g，硼酸55?g，加去離子水1?000?mL。

（資料性）

酚-氯仿法提取DNA在1.5?mL塑料離心管中加入研磨或剪碎的樣品組織約100?mg，加入CTAB溶液600?μL、蛋白酶K溶液（20?mg/mL）10?μL，混勻后55?℃水浴3?h或37?℃水浴過夜，期間顛倒混勻幾次，至消化液澄清。加入苯酚-氯仿（1:1）溶液500?μL，顛倒混勻1?min，12?000?rpm離心5?min，吸取上清液500?μL至另一支潔凈離心管內(nèi)。重復(fù)B.2操作一次。加入氯仿500?μL，顛倒混勻30?s，12?000?rpm離心5?min，吸取上清液400?μL至另一支潔凈離心管內(nèi)。加入2倍體積-20?℃預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻，-20?℃冷凍過夜。12?000?rpm離心5?min，倒掉上清液。加75%乙醇500?μL，顛倒清洗，12?000?rpm離心3?min，倒掉上清液。重復(fù)B.7操作一次。12?000?rpm瞬時(shí)離心，用200?μL移液器小心吸出管底殘留溶液，注意不要吸走管底沉淀。離心管開口放于潔凈的環(huán)境中，自然干燥15?min～30?min。加入100?μL滅菌雙蒸水充分溶解，備用。

（資料性）

X脂糖凝膠電泳用1×TBE緩沖液制備1%～1.5%的X脂糖凝膠，以1:10?000（體積比）加入核酸染料。取5?μL需要檢測(cè)的DNA，與1?μL6×上樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣。用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)做參照。0.5×TBE緩沖液中，100?V～120?V恒壓電泳30?min左右。凝膠移入凝膠成像系統(tǒng)，254?nm紫外光透射下拍照記錄并分析。

（資料性）

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系配方見表E.1.PCR體系配方表DNA模板50?ng～100?ng10倍擴(kuò)增緩沖液2.5?μLMgCl2（25?mmol/L）2.0?μLdNTP（10?mmol/L）0.5?μL引物f（50?pmol/μL）0.5?μL引物r（50?pmol/μL）0.5?μLTaq酶（5?U/μL）0.2?μL加無菌超純水配制成25?μL的反應(yīng)體系

（資料性）

檢測(cè)記錄海洋動(dòng)物資源線粒體DNA遺傳多樣性檢測(cè)記錄見表F.1。檢測(cè)記錄表樣品名稱樣品編號(hào)樣品數(shù)量引物序列目的序列長(zhǎng)度（bp）單倍型1DNA序列群體間遺傳距離d’群體間