臨床常見真菌檢驗（微生物學(xué)檢驗技術(shù)課件）

第十五章

真菌及檢驗

真菌形態(tài)檢驗技術(shù)一、標(biāo)本采集常見標(biāo)本類別

◆淺部感染：毛發(fā)、皮屑、指甲等◆深部感染：膿、痰、血液、腦脊液、宮頸分泌物等注意事項◆標(biāo)本來源適宜

◆用藥前采集標(biāo)本

◆嚴(yán)格無菌操作◆標(biāo)本量充足◆立即送檢

一、標(biāo)本采集檢驗程序一、標(biāo)本采集二、直接鏡檢鏡檢的意義：①有診斷意義，如淺部真菌病等；②通過真菌的形態(tài)，可確定某些致病性真菌的屬或種,如假絲酵母菌的厚膜孢子等。鏡檢的局限性：①陰性結(jié)果不能排除真菌感染；②有假陽性結(jié)果。因此，對直接鏡檢可疑結(jié)果應(yīng)作復(fù)查或用其他檢驗方法鑒定。直接采取標(biāo)本制片、顯微鏡下直接觀察，若發(fā)現(xiàn)真菌菌絲或孢子存在時，即可初步判定為真菌感染。標(biāo)本KOH溶液加熱鏡檢常用方法：二、直接鏡檢菌絲孢子革蘭染色法

乳酸酚棉蘭染色法熒光染色法墨汁染色法糖原染色三、染色鏡檢

真菌培養(yǎng)技術(shù)一、基本條件2.培養(yǎng)基沙保弱培養(yǎng)基常用；無選擇性選擇性培養(yǎng)基放線菌酮-氯霉素瓊脂鑒別培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂等1.常用工具一、基本條件培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基用途沙氏培養(yǎng)基真菌的常規(guī)培養(yǎng)放線菌酮-氯霉素瓊脂真菌的常規(guī)培養(yǎng)玉米粉吐溫-80瓊脂觀察白假絲酵母菌的厚膜孢子馬鈴薯葡萄糖瓊脂

觀察真菌菌落色素，用于鑒別尿素瓊脂生化反應(yīng)鑒別培養(yǎng)（紅色癬菌和石膏樣癬菌）心腦浸液葡萄糖血瓊脂深部真菌培養(yǎng)二、培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)；觀察菌落

保存菌種

觀察結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育過程平皿培養(yǎng)法斜面培養(yǎng)法小培養(yǎng)法二、培養(yǎng)方法分離培養(yǎng)小培養(yǎng)法：三、檢查方法分離培養(yǎng)三、生長現(xiàn)象（1）生長速度：菌落在7～10天內(nèi)出現(xiàn)者，為快速生長；3周只有少許生長者為慢速。

（2）菌落大小

（3）表面形態(tài)（4）菌落性質(zhì)：酵母型、酵母樣型和絲狀菌落。（5）菌落顏色：絲狀菌落表面和底層顏色不同。（6）菌落邊緣

（7）菌落底部菌落觀察：

真菌鑒定方法鑒定1.生化反應(yīng)鑒定糖(醇)類發(fā)酵試驗同化碳源試驗同化氮源試驗明膠液化試驗?zāi)蛩胤纸庠囼?.免疫學(xué)檢查鑒定3.其他鑒定試驗芽管形成試驗:

待檢菌→動物血清→37℃、2~4h

→鏡檢觀察芽管厚膜孢子形成試驗：待檢菌→吐溫-80玉米粉瓊脂

→37℃→觀察厚膜孢子鑒定3.其他鑒定試驗動物接種病理組織檢查核酸檢測真菌毒素檢測常見病原性真菌第三節(jié)一、淺部感染真菌淺部感染真菌——是指寄生或腐生于角蛋白組織（表皮角質(zhì)層、毛發(fā)和甲板等）的真菌。主要有：表皮癬菌、毛癬菌、小孢子癬菌。生物學(xué)性狀一、淺部感染真菌生物學(xué)性狀一、淺部感染真菌臨床意義傳播方式：接觸致病特點：侵犯表皮表面角質(zhì)層，機械刺激和增殖致病理改變。一、淺部感染真菌微生物檢驗標(biāo)本：病變部位標(biāo)本。檢驗方法：

直接鏡檢分離培養(yǎng)熒光檢查二、深部感染真菌——深部感染真菌是指可引起機體深部組織和內(nèi)臟疾病的一群真菌。深部感染真菌致病性真菌條件致病真菌組織胞漿菌、球孢子菌等白假絲酵母菌、新隱球菌等二、深部感染真菌白假絲酵母菌G+、橢圓形，出芽繁殖，可形成假菌絲；酵母樣菌落，在玉米培養(yǎng)基上可形成厚膜孢子；1.生物學(xué)性狀二、深部感染真菌白假絲酵母菌2.臨床意義條件致病菌，機體抵抗力下降或菌群失調(diào)是其侵入機體的主要原因。皮膚：腋窩等部位

粘膜：鵝口瘡、口角糜爛、外陰與陰道炎等內(nèi)臟感染：肺炎、支氣管炎、腦膜炎等二、深部感染真菌白假絲酵母菌3.微生物學(xué)檢驗直接鏡檢：假菌絲可幫助診斷。分離培養(yǎng)：標(biāo)本→沙保弱培養(yǎng)基→培養(yǎng)鑒定：

芽管形成試驗

厚膜孢子形成試驗TTC試驗

糖發(fā)酵、糖同化試驗二、深部感染真菌白假絲酵母菌3.微生物學(xué)檢驗二、深部感染真菌新型隱球菌1.生物學(xué)性狀G+、球形菌體，有寬厚莢膜，無假菌絲；

酵母型菌落。二、深部感染真菌新型隱球菌2.臨床意義外源性感染，肺是主要入侵途徑；多數(shù)癥狀不明顯，自愈；嚴(yán)重者呈暴發(fā)性感染，死亡；經(jīng)血行傳播至中樞神經(jīng)及其它組織，引起慢性腦膜炎；二、深部感染真菌新型隱球菌3.微生物學(xué)檢驗?zāi)X脊液離心沉淀涂片墨汁負染鏡檢鑒定：糖同化試驗

酚氧化酶試驗（新型隱球菌黑色菌落）

脲酶試驗二、深部感染真菌其他真菌曲霉菌二、深部感染真菌其他真菌毛霉菌G試驗GM試驗G試驗又稱1,3-β-D葡聚糖試驗，檢測的是真菌的細胞壁成分1,3-β-D葡聚糖，人體的吞噬細胞吞噬真菌后，能持續(xù)釋放該物質(zhì)，使血液及體液中含量增高。1,3-β-D葡聚糖可特異性激活鱟變形細胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗。G試驗真菌細胞壁成分1,3-β-D葡聚糖G因子，活化G因子凝固酶原，凝固酶顯色，光度法測定G試驗G試驗適用于除隱球菌和毛霉菌外的所有深部真菌感染的早期診斷較好的敏感性和特異性，假陽性率較低只能提示有無真菌侵襲性感染，并不能確定為何種真菌感染，這是此方法的缺陷。G試驗--假陽性（1）使用纖維素膜進行血透，標(biāo)本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料（2）靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；（3）鏈球菌血癥；G試驗--假陽性（4）操作者處理標(biāo)本時存在污染。另外，使用多糖類抗癌藥物、放化療造成的粘膜損傷導(dǎo)致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌經(jīng)胃腸道進入血液等也可能造成假陽性。GM試驗--侵襲性曲霉菌感染的早期診斷檢測的是半乳甘露聚糖（glactomannan,GM），半乳甘露聚糖是廣泛存在于曲霉和青霉細胞壁的一種多糖，菌細胞壁表面菌絲生長時，半乳甘露聚糖從薄弱的菌絲頂端釋放，是最早釋放的抗原，可以通過酶聯(lián)免疫吸附試驗法進行檢測。GM試驗曲霉菌感染部位主要集中在肺部，從而引起肺部侵襲性曲霉，診斷曲霉菌在肺部是定植還是侵襲性生長，關(guān)鍵在于其是否合成GM，GM試驗是診斷侵襲性曲霉感染的微生物檢查證據(jù)之一。GM試驗GM試驗對其他真菌檢測無效，且敏感性和特異性受諸多因素影響，以下情況可出現(xiàn)假陽性：（1）使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他唑巴坦；（2）新生兒和兒童；（3）血液透析；（4）自身免疫性肝炎等；（5）食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米等。以下情況可出現(xiàn)假陰性：（1）釋放入血循環(huán)中的曲霉GM（包括甘露聚糖）并不持續(xù)存在而是會很快清除；（2）以前使用了抗真菌藥物；（3）病情不嚴(yán)重；（4）非粒細胞缺乏的患者。

臨床注意事項

1）G試驗和GM試驗檢測的物質(zhì)不同，代謝規(guī)律存在差異，影響因素也有較大差別，二者不能互相取代。二者聯(lián)合應(yīng)用可以提高對侵襲性真菌病的診斷能力。

2）GM試驗和G試驗均存在假陽性結(jié)果，可以通過多次檢測來降低假陽性率。因此，G試驗和GM試驗陽性的病例仍需結(jié)合臨床表現(xiàn)綜合判斷是否存在真菌感染。

臨床注意事項3）我國的侵襲性真菌病指南