生物化學課件完整版極其詳細

生物化學課件完整版極其詳細）第二章蛋白質(zhì)第一節(jié)蛋白質(zhì)的概念及其生物學意義一、什么是蛋白質(zhì)？α—AA借肽鍵相連形成的高分子化合物（短桿菌肽含D-苯丙氨酸）O［肽鍵：—C—NH—也叫酰胺鍵］二、蛋白質(zhì)的生物學作用（或稱功能分類）物質(zhì)吸收與運輸、運動，調(diào)節(jié)代謝、儲存養(yǎng)分、催化各種生化反應、分子間的識別（支架蛋白）、信息傳遞（受體復制酶）、記憶、疾病防御—抗體。應用：固體酶的工業(yè)應用（聯(lián)于水不溶性樹脂上）、脫（紡織品）漿（淀粉酶）、生化制藥，蛋白酶用于皮革的脫毛及軟化等，都是利用蛋白質(zhì)的催化作用，蛋白質(zhì)生物芯片（貯存信息量大，將多種蛋白質(zhì)抗體固定、排列到玻璃板上，能檢測各種疾病蛋白及其他基因表達蛋白），進行病原體與疾病診斷等。第二節(jié)蛋白質(zhì)的組成一、蛋白質(zhì)的元素組成：C（50-55％）、H（6-8）、O（20-30%）、N（15-18）、S（半胱aa）（0-4%）有的還含有P（酪蛋白）、Fe、Zn、Mo（鉬Fe蛋白）、Cu、I，特別是含N量都很接近，平均為16%。所以，測出含N量×6.25（100/16蛋白質(zhì)系數(shù)）即可推測出蛋白質(zhì)的含量——凱氏定氮。二、蛋白質(zhì)的aa組成通常只有20種，除Pro外均為α—aa，除甘氨酸外，都有D、L兩種異構(gòu)體（α—碳原子為不對稱碳原子）所以有旋光性。投影式如下：COOHCOOHH2N—C—HH—C—NH2RRL—αD—αaa的分類方法：（一）氨基酸的種類分類一根據(jù)側(cè)鏈基團R的化學結(jié)構(gòu)分為四類：第一類脂肪族aa：側(cè)鏈是脂肪烴鏈①一氨基一羧基（中性）：一氨基一羧基aa中共九種：H—CH—COOHCH2—CH—COO－CH2—CH—COO－NH2OHNH+3SHNH+3(Gly:G)(Ser:S)(Cys:C)CH3—CH—COO－CH3—CH—CH—COO－CH3—CH—CH—COO－NH+3OHNH+3CH3NH+3(Ala:A)(Thr:T)(Val:V支鏈aa)—COO—(Leu:L支鏈aa)CH3—S—CH2—CH2—CH—O－CH3—CH—CH2—CH—?－NH+3CH3NH+3CH3—CH2—CH—CH—COO－CH3NH+3(Ile:I支鏈aa)②一氨基二羧基aa(酸性)及其酰胺—OOC—CH2—CH—COO——OOC—CH2—CH2—CH—COO—NH+3NH+3(Asp:D)(Glu:E)OOH2N—C—CH2—CH—COO—H2N—C—CH2—CH2—CH—COO—NH+3NH+3(Asn:N)(Gln:Q)③二氨基一羧基aa（堿性：—NH2＞-COOH）H3N+—CH2（CH2）3—CH—COO—H2N—C—NH—（CH2）3—CH—COO—NH3+NH2+NH3+（Lys:K）(Arg:R)第二類芳香族aa（含有苯環(huán)的化合物叫做芳香族化合物，有的包括Trp）：—CH2—CH—COO—HO——CH2—CH—COO—(Phe:F)（丙aa取代）(Tyr:Y)第三類雜環(huán)aa：HCC—CH2—CH—COO—………—CH2—CH—COO—…HN+NHNH+3NNH+3CH（His:H咪唑基）(Trp:W吲哚基苯并吡咯)第四類脯氨酸，也稱雜環(huán)亞氨基酸：由Glu還原、環(huán)化、再還原形成四氫吡咯-2-羧酸NH2+NH+3NH+3(Met:M)(Pro:P)分類二按側(cè)鏈R基團的極性（及在pH7左右時的解離狀態(tài)）分為：非極性：甘、丙、纈、亮、異亮、苯丙、蛋、脯、色氨酸。不帶電荷：帶OH、SH、酰胺基極性帶負電荷（酸性aa）帶正電荷：Lys、Arg、His(堿性aa).His等電點為7.59此外在蛋白質(zhì)代謝中還有鳥aa、瓜aa（尿素循環(huán)中）、胱aa、羥脯aa、羥賴aa（膠原蛋白的組分）。甘aa的H介于極性與非極性之間，有時歸入極性不帶電荷類中。人和動物的必需aa：不能自身合成必須由食物獲得。Thr、Val、Met、Leu、Ile、Phe、Lys、Trp、His*、Arg*(*半必需aa，兒童合成不足)（二）aa的性質(zhì)1.物理性質(zhì)：無色結(jié)晶，易容于水，不容于有機溶劑，熔點高（Gly：232℃,乙酸：16.6℃，分子間靠氫鍵締合），這些特性說明是離子化合物。2.兩性解離及等電點：（難點*）COO—加堿解離出H+帶負電，加H+結(jié)合H+帶正電，向陰極移動，在某一pH下帶正、負電荷量相等。H3N+—C—H（由很酸向堿變化NH+3—CH—COOHNH+3—CH—COO—）RRR在電場中不移動，此時的pH稱為aa的等電點（pI）。此時aa的溶解度最?。ㄒ驗殪o電作用），pI與—COOH和—NH2的解離常數(shù)有關(guān)。K1：—COOH解離為—COO—+H+的解離常數(shù)；K2：H3N+解離為—NH2+H+的解離常數(shù)。其pI可從pK計算或測定(用酸堿滴定法測定)。aa等電點的計算：只有一個解離基團的物質(zhì)AH，其解離常數(shù)與pH的關(guān)系為pH=pK+lg([A-]/[AH]).證明：AHA—+H+K=[A-]*[H+]/[AH][H+]=K*[AH]/[A-]=K/（[A-]/[AH]）-lg[H+]=-lgk--lg（[A-]/[AH]）即：pH=pK+lg（[A-]/[AH]）Henderson-方程。當有一半解離時，即[A-]=[AH]時，pH=pK，即溶液的pH可由其溶質(zhì)的解離常數(shù)與解離量計算而得，溶質(zhì)的解離常數(shù)可查得。pK：解離常數(shù)K的負對數(shù)。aa可看作二元弱酸（酸性條件）有兩個可解離的H+其分步離解如下：K（+OH－）1在充分酸的條件下R—CH—COOHR—CH—COO—+H+NH+3NH+3（R+）（R0）K2R—CH—COO—R—CH—COO—+H+NH+3NH2（R0）（R—）［R+］=∵K1=K1R0=R+時K1=［H+］K2[R0]K2=R—=[R0][H+]用NaOH滴定到R0=R—時K2=[H+]等電點時：aa處于兩性離子狀態(tài)，可有少量解離成陽離子和陰離子，但解離成陽離子和陰離子的數(shù)目和趨勢相等。即：[R—]=[R+]即[R0][H+]/K1=K2[R0]/[H+][H+]2=K1*K2[H+]2=K1?K2—lg[H+]=pH；—lgK1=pK1；—lgK2=pK2兩邊取負對數(shù)得2×—lg[H+]＝—lgK1＋—lgK2即：pH=[pK1+pK2]/2=pI分子的存在狀態(tài)是多種多樣的，但在一定條件下以某一狀態(tài)為主。即aa的等電點pI就是兩性離子(R0)兩側(cè)的pK值的平均值?；鶊F的pK值可查得，故pI值可由二pK值計算得之。對于有三個解離基團的aa，如Asp、Lys只要取其兼(兩)性離子兩側(cè)的pK值的平均值即得pI值。COOHCOO—COO—CH—NH+3K1CH—NH+3K2CH—NH+3K3Asp=CH2CH2CH2COOHCOOHCOO—Asp+(R+)Asp0(R0)Asp—（R—）等電點時Asp主要以兼性離子R0存在，(R+)與（R—）很小且相等（等電狀態(tài)為理想狀態(tài)，pI為理論值）。pI=（pK1+pK2）/2同上賴COOHCOO—COO—COO—CH—NH+3K1CH—NH+3K2CH—NH2K3CH—NH2（CH2）4（CH2）4（CH2）4（CH2）4NH+3NH+3NH+3NH2（R2+）（R+）（R0）（R—）pI=（Pk2+pK3）/2因R2+可忽略不計（pI時可認為它是不存在的，否則就不是等電狀態(tài)了）。ε—NH2比α—NH2堿性強，結(jié)合H+能力大，結(jié)合后不易放出[R0][H+][R+][R0][H+][R-][H+]H+（因受COOH影響?。?.氨基酸的化學性質(zhì)：⑴與強酸、強堿都可生成鹽（銨鹽與羧酸鹽）如谷氨酸鈉⑵與水合茚三酮的反應80-100℃的條件下，首先使aa氧化脫羧脫氨形成醛，而本身被還原成還原型茚三酮，然后還原型茚三酮、氨和另一分子的水合茚三酮縮合形成藍紫色的二酮茚—二酮茚胺，這是α—aa定性定量測定的基礎，反應如下（二酮茚-二酮茚胺紫蘭色吸收峰570nm）Pro、羥—Pro生成黃色物質(zhì)(因為無氨基)用于比色、測定、層析、電泳的顯色劑。因為產(chǎn)生CO2，也可用CO2氣體分析法測定aa（只限于α-氨基酸），肽和蛋白也有此反應，肽越大靈敏度越差。⑶與亞硝酸的反應（aa的NH2基被氧化成—OH），+NH3—N被氧化成N2，HNO2—N被還原為N2，等量進行。所以N2一半來自HNO2（其他伯氨基均可）。生成N2的反應叫vanslyke（范斯萊克）反應?？蓽yN2量（體積）計算氨基的含量。用于測定蛋白質(zhì)的水解程度。⑷與甲醛的反應：酸堿滴定沒有適宜的指示劑（因為等當點過高或過低）。其氨基可與甲醛反應（加成），生成N—羥甲基或N，N—二羥甲基aa。使NH+3變?yōu)镹H2釋放出H+。使溶液酸性增強，可用NaOH滴定之。與NH2的含量相當，即aa含量。這就是aa的甲醛滴定法，（滴定到放出的H+被中和時的pH為終點）。R－CH－COO－R－CH－COO－+H++NH3NH2+HCHOR－CH－COO－NHCH2OH+HCHOR－CH－COO－ONHOOOHOHOOHOOOONHOHOOO—3H2O+NH3+N(CH2OH)2⑸與2，4—二硝基氟苯的反應（胺與鹵代烷的反應）NH3的烷基化，生成黃色DNP—aa，不被酸水解。也可用之測肽和蛋白質(zhì)的N—端aa，反應后酸解得N端的DNP—aa，有機溶劑提取分離，層析與標準氨基酸對比即可鑒定之。DNFB丹磺酰氯Sanger試劑（5—二甲氨基萘磺酰氯）RHR+H2N—CH—COOH—CH—COOH因為丹磺酰aa有強烈的熒光，所以可用熒光光度計測定。（均在試劑與—NH2之間脫去鹵化氫）均稱Sangar反應。DNFB亦可與非α－氨基反應,如可生成：δ－DNP-鳥氨酸。⑹與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應，稱艾德曼反應（Edman）反應：弱堿性條件下，形成苯氨基硫甲酰aa(PTCaa)，在無水酸（硝基甲苯中與酸作用）環(huán)化為苯乙內(nèi)酰硫脲氨基酸（簡稱PTH或PTH-氨基酸）。PTH在無水酸中極穩(wěn)定。PTC基的引入使緊接著的肽鍵減弱，所以在無水酸中只切下之（環(huán)化斷裂同時發(fā)生）PTH—aa在紫外區(qū)有強吸收。Vmax=268nm.PTH—aa可用各種層析技術(shù)分離，紫外分析測定與標準PTH—aa對比即可知為何種aa（N—末端），多肽、蛋白的N—末端aa也可與PITC反應，不斷重復可得蛋白質(zhì)aa順序，多肽的aa順序自動分析儀，即以此原理設計而成。一次可測60多個aa。7.成肽反應：肽即氨基酸脫水縮合而成的化合物R—CH—COOH+H2N—CH—COOHR—CH—CO—NH—CH—COOHNH2RNH2R二肽、三肽……含一個自由的α—氨基與羧基，還可縮合為多肽蛋白質(zhì)O2NFNO2NCH3O=S=OH3CClCONCNHCHSRN=C=S+aaNH－C－NH－CH－COOHSRO2NFNO2O2NNNO2似嗎啡有鎮(zhèn)痛作用但不上癮CysTyrPheGlnAsnCysSSProArgGly—C—NH2H3N+O升壓素活性肽：谷胱甘肽GSH*Glu的r羧基——Cys的α—氨基縮合成r肽鍵：SHCOOHOCH2OHCH—（CH2）2—C—NH—CH—C—NH—C—COOHNH22HHGSSG（氧化還原酶的輔酶—SH）催產(chǎn)素與加壓素（激素類）：前者使子宮與乳腺平滑肌收縮二者只有兩個aa不同：3Ile3Phe8Leu8Arg所以有催產(chǎn)和促排乳作用，后者則使血管平滑肌收縮使血壓升高（也使腎小球血管收縮形成尿減少）（也是血壓升高的原因之一）。所以也叫抗利尿激素，也與學習的記憶過程有關(guān)。均由下丘腦合成，神經(jīng)垂體分泌入血腦啡肽：許多有鎮(zhèn)痛作用：C端Leu（Leu腦啡肽已人工合成）（5肽）Tyr—Gly—Gly—Phe—Met促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH39肽，腦垂體分泌）、膽囊收縮素（33肽，十二指腸分泌）括約肌收縮，膽汁分泌減少引起厭食(減肥)胰高血糖素(29肽，胰島α-細胞分泌)使糖原降解，血糖升高，與胰島素相反。8與熒光胺反應（α—氨基）：產(chǎn)物具有熒光熒光胺熒光產(chǎn)物（被390nm光激發(fā)，發(fā)射475nm的熒光）ng級9.與5，5/—雙硫基—雙（2—硝基苯甲酸）反應測半胱aa（Cys）等的游離—SH含量，生成含—SH的硝基苯甲酸產(chǎn)物OD412nm有一吸收峰可測之Cys的含量。CH2—CH—COO－SHNH+3+Cys5，5/—雙硫基—雙（2—硝基苯甲酸）硫代硝基苯甲酸Cys與抗性有關(guān)(吸收峰412nm)C端MetHOOOOOO+aaRN—CH—COOH+CO2SHOOCNO2SNO2COOHSNO2COOHH67899肽（三）aa制備與分析（可略）制備：蛋白水解：毛發(fā)水解（H+）胱aa、半胱氨酸發(fā)酵：Glu菌發(fā)酵Glu鈉化學合成：α—酮酸+NH3aa分離：層析與電泳第三節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)多肽鏈可分為四級結(jié)構(gòu)。一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)：其aa種類、連接方式及排列順序，包括二硫鍵(共價鍵)。H2N—CH—CO—NH—CH—CO—NH—CH—CO……—NH—CH—COOHR1R2R3Rn—NH—CH—CO—（稱為aa殘基）R書寫：N端(氨基末端)：有α氨基的一端寫在左邊用H表示C端(羧基末端)：有α羧基的一端寫在右邊用OH表示連接方式：—CO—NH—。—S—S—與穩(wěn)定肽鏈的空間結(jié)構(gòu)和生物活性有關(guān)如胰島素：51aa（分子質(zhì)量5734）21A+30B研究方法：測定蛋白質(zhì)的aa序列。Edman法一次只能測定60-70個aa殘基的肽段單條肽鏈測定如下：1.測定aa組成。酸解、堿解，可避免多肽鏈的aa丟失。（測分子量確定aa個數(shù)氨基酸殘基的平均分子量為120）2.測N、C末端aa。DNFB法等，確定肽鏈的數(shù)目，（羧肽酶A釋放除Pro、Arg和Lys的所有C末端殘基，羧肽酶B只水解Arg和Lys為C末端殘基的肽鍵，二者合用）3.用兩種以上的方法將蛋白質(zhì)斷裂為不同的肽段。如用不同的酶水解。4.分離各肽段，并測出它們的序列。Edman法5.根據(jù)各肽段的重疊部分推出蛋白質(zhì)的全部aa排序。也可DNA測序后反推。關(guān)鍵是小肽段aa順序的測定：Edman反應（降解法）與外肽酶酶解法。如：某十肽，用胰凝乳蛋白酶酶解得4個小肽：A1:Ala－Phe；A2:Gly－Lys－Asn－Tyr；A3:Arg－Tyr；A4:His－Val胰蛋白酶酶解得3個小肽：B1:Ala－Phe－Gly－Lys；B2:Asn－Tyr－ArgB3:Tyr－His－Val.根據(jù)重疊結(jié)構(gòu)拼接為：Ala－Phe－Gly－Lys－Asn－Tyr－Arg－Tyr－His－Val(可直接Edman法)成環(huán)則無67711192021OHHHOH+—如果含兩條以上的肽鏈先拆分成單鏈，若含二硫鍵需先拆開：過甲酸氧化形成二個半胱氨磺酸(或用β-巰基乙醇還原后用碘乙酸保護-形成羧甲基衍生物)：-CH2-S-S-CH2--CH2-SO3H+-CH2-SO3H含—SO3H，分析時即知—S—S—的位置（可先水解成只含一個或少量—S—S—的小肽段，以便確定—S—S—的準確連接位置）。二硫鍵位置的確定（另取一份樣品）+-熏蒸一般用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白質(zhì)，從部分水解產(chǎn)物中分離出含二硫鍵的肽段，再拆開二硫鍵，將兩個肽段分別測序，再與整個多肽鏈比較，即可確定二硫鍵的位置。常用胃蛋白酶，因其專一性低，生成的肽段小，容易分離和鑒定，而且可在酸性條件下作用（pH2），此時二硫鍵穩(wěn)定。肽段的分離可用對角線電泳，將混合物點到濾紙的中央，在pH6.5進行第一次電泳，然后用過甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一對含半胱氨磺酸的肽段。將濾紙旋轉(zhuǎn)90度后在相同條件下進行第二次電泳，多數(shù)肽段遷移率不變，處于對角線上，而含半胱氨磺酸的肽段因負電荷增加而偏離對角線。用茚三酮顯色，分離，測序，與多肽鏈比較，即可確定二硫鍵位置。提取DNA測序后反推蛋白：蛋白質(zhì)抗體蛋白mRNA反轉(zhuǎn)錄cDNA測序反推（見后一章）。第三節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)多肽鏈可分為四級結(jié)構(gòu)。一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)：其aa種類、(共價)連接方式及排列順序，應包括二硫鍵。二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)多肽鏈按一定方式盤繞折疊，形成立體（空間）結(jié)構(gòu)（各基團的作用力之故）。也稱蛋白質(zhì)的構(gòu)象（或高級結(jié)構(gòu)）：指蛋白質(zhì)分子中所有原子在空間的排列及肽鏈的走向，以一級結(jié)構(gòu)為基礎。HCOOOH肽鍵及肽鍵平面，雙鍵性質(zhì)（不能自由旋轉(zhuǎn)且比一般C-N鍵短，比C=N鍵長）OOO—CαCα—C—N—Cα—C—N—CαC=NO與H成反式HHCαH亞氨基肽鍵中的4個原子—CO—NH—（—羧基與另一aa的氨基構(gòu)成）和與之相連的兩個Cα原子都處于同一平面上。這個平面叫肽鍵平面，Ｃ＝Ｏ有部分單鍵的性質(zhì)，只有Ｎ—Cα，Ｃ—Cα鍵可以旋轉(zhuǎn)。多肽的主鏈由許多肽鍵平面構(gòu)成，平面可以Cα為頂點繞N—Cα和C—Cα鍵旋轉(zhuǎn)，但受側(cè)鏈基團的影響，只有少數(shù)的特定結(jié)構(gòu)。所以肽鏈折疊有一定的限制，分為二、過渡、三、四級結(jié)構(gòu)。1.Pr的二級結(jié)構(gòu)：指多肽鏈本身的折疊與盤繞方式，驅(qū)使蛋白質(zhì)折疊的主要動力來自各側(cè)鏈基團及其與介質(zhì)的相互作用（H鍵維持系統(tǒng)的能量平衡）。主要有α—螺旋結(jié)構(gòu)、β—折疊、β—轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲四種。1）α—螺旋結(jié)構(gòu)：毛、發(fā)、羽毛中的α—角蛋白中的主要形式，多肽鏈盤繞成右手或左手螺旋（是由肽鍵平面繞Cα相繼旋轉(zhuǎn)一定的角度形成的）。典型的右手N①3.6aa殘基為一圈，高0.54nm0.54/3.6=0.15nm，3600/3.6=1000②側(cè)鏈R基伸向螺旋外側(cè)相鄰螺旋圈C=O與亞氨基（NH）氫間形成鏈內(nèi)H鍵，每個殘基的C=O都與它后面的第四個aa殘基（隔三隔aa殘基）形成H鍵，氫鍵平行中心軸。OHOH—C—NH—C—C—N—nS3.613(3×3)+4=133Rs：形成氫鍵封閉（合）環(huán)內(nèi)共價連接的原子數(shù)，幾乎全為右手螺旋（也有極少數(shù)左手螺旋）。但整條肽鏈并非全是，如有Pro存在時，即中斷（無H可形成H鍵）。帶同電荷的aa出現(xiàn)在鄰近位置上就會影響螺旋的形成，甘氨酸也不易形成螺旋。2）β—折疊結(jié)構(gòu)：O=CCNC縱向排列形成片層N-HNNNNCN平行(角蛋白)反平行(絲心蛋白)β—折疊片層也可在同一肽鏈的不同部分之間形成。β凸起：β—折疊的一股彎曲使一個氨基酸殘基突出出來不形成氫鍵。3）β—轉(zhuǎn)角出現(xiàn)在180°回折角處，此處Gly、Pro多（側(cè)鏈小才可形成），也叫發(fā)夾結(jié)構(gòu)、回折、β—彎曲。OHOH—C—NH—C—C—N—nS310(3×2)+4=1024）自由回轉(zhuǎn)（無規(guī)則卷曲）：無規(guī)則的松散結(jié)構(gòu)。一種蛋白質(zhì)中往往含幾種二級結(jié)構(gòu)2.超二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域：相鄰的二級結(jié)構(gòu)的組合體（構(gòu)象單元）在空間上能與其它部分分開，βαβ、αα、ββ（靠近）、β×β（連接鏈連接平行的β片層）、β曲折（β轉(zhuǎn)角連接）、回形拓撲結(jié)構(gòu)ααβ×ββαββ曲折左手超螺旋希臘鑰匙構(gòu)象超二級結(jié)構(gòu)無特定功能（只有一定的組合規(guī)則，在空間上能辨認）。結(jié)構(gòu)域：是球蛋白的折疊單位，超二級結(jié)構(gòu)進一步盤曲折疊成球狀的，在空間上獨立（相對）的、具有部分（一定）功能的結(jié)構(gòu)，較小的蛋白可能只有一個結(jié)構(gòu)域，這時結(jié)構(gòu)域等于三級結(jié)構(gòu)，超二級結(jié)構(gòu)與結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上很難區(qū)別（后者比前者更復雜）。結(jié)構(gòu)域的類型：β—圓桶、螺旋束結(jié)構(gòu)域（后二者）等37862541丙酮酸激酶溶菌酶肌紅蛋白三級結(jié)構(gòu)(單域)由兩個以上結(jié)構(gòu)域組合成三級結(jié)構(gòu)（可以是完整功能的蛋白質(zhì)）。每個結(jié)構(gòu)域都有其功能，三級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈的所有原子在空間的排列與分布，如肌紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)一條多肽鏈，非極性側(cè)鏈埋于分子內(nèi)部，極性基團分布在分子表面與水結(jié)合，所以具水溶性。有幾個結(jié)構(gòu)域常常就有幾個功能區(qū)，結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一。兩條以上肽鏈才有四級結(jié)構(gòu)：分子量大的蛋白多由幾條多肽鏈組成，它們以非共價鍵結(jié)合成一個功能單位，執(zhí)行一個特定功能，其中一條肽鏈就稱為該蛋白的一個亞基（Subunit）如血紅蛋白由2α、2β亞基組成。β1β2β轉(zhuǎn)角以共價鍵連接的肽鏈不能稱為亞基，如胰島素A、B鏈以兩個—S—S—鍵相連。四級結(jié)構(gòu)：就是指亞基之間的連接及空間排列，不包括亞基內(nèi)部得空間結(jié)構(gòu)，亞基單獨存在無活性或活性很低，只有聚合成四級結(jié)構(gòu)，才能有完整的生物活性。如血紅蛋白只有2α、2β（141、146aa）=574個aa一起才能組成完整的功能單位。膠原蛋白：左手螺旋的多肽鏈纏繞成三股右手超螺旋的原膠原蛋白分子。膠原蛋白。三、蛋白質(zhì)分子中的共價鍵與次級鍵（非共價鍵）一級結(jié)構(gòu)由共價鍵維持：肽鍵（酰胺鍵），二硫鍵；空間結(jié)構(gòu)由次級鍵（非共價鍵）維持：氫、鹽鍵（離子鍵）、疏水鍵、范德華引力（包括H鍵）。二級結(jié)構(gòu)主要是H鍵，三級結(jié)構(gòu)主要是疏水力，鹽鍵、范氏力也都起著重要作用（維持特定構(gòu)象）。四、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系㈠一級結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)決定功能，相同的功能有相同或相似的結(jié)構(gòu)1.不同動物的胰島素大同小異（差異在A鏈：8、9、10、30位aa殘基）。變化的aa不起決定（功能）作用；細胞色素C（呼吸鏈的重要組分）在動物間親緣關(guān)系越近，差異越小，人與黑猩猩的差異小于人與雞的差異。細胞色素C的結(jié)構(gòu)中與之功能密切相關(guān)的部位在各種動物中都是不變的（104個aa組成）。2.關(guān)鍵部位結(jié)構(gòu)上的一點變化，就會引起功能的顯著變化。如：鐮刀型貧血病。只是血紅蛋白（2α：141aa，2β：146aa）的β鏈的第六位GluVal代替就使患者紅細胞在缺氧時成鐮刀狀，易脹破、溶血，引起頭暈、胸悶等貧血癥狀，都證明Pr結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一性。㈡構(gòu)象與功能的關(guān)系構(gòu)象：即空間結(jié)構(gòu)。指取代基團，因為單鍵旋轉(zhuǎn)所形成的不同立體結(jié)構(gòu)。別構(gòu)現(xiàn)象：構(gòu)象改變功能也隨之改變的現(xiàn)象。血紅蛋白與O2的親和力是很弱的，但其一個亞基與O2結(jié)合后引起的構(gòu)象改變，亞基間次級鍵破壞，使其它亞基與O2結(jié)合力變大，結(jié)合速度變快。氧結(jié)合曲線成S型β1β2P(o2)P(o2)肌紅蛋白的氧合曲線血紅蛋白的氧合曲線第四節(jié)Pr的性質(zhì)一、分子量大?。阂话銥?萬——100萬主要測定方法：1.超離心：在一定離心力下，分子量大沉降速度快?？捎贸两迪禂?shù)來表示(正相關(guān))。沉降系數(shù)：單位離心力下的沉降速度，cm/s/(cm/s2)單位（S：斯威伯格單位10-13秒）2.凝膠過濾：分子篩作用。分子量越大過濾速度越快，用標準蛋白作標準曲線與之比較即可知未知蛋白分子量。3.SDS凝膠電泳：分子量與遷移率成反比，與標準樣品比較。（因為SDS使各種蛋白的荷/質(zhì)比均相同）。大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS按1:1.4(W/W)的比例結(jié)合SDS：十二烷基硫酸鈉二、Pr的兩性電離與等電點Pr也是兩性電解質(zhì)：解離基團：末端的α—氨基與羧基、aa殘基側(cè)鏈上的氨基、羧基、咪唑基、胍基、SH等。NH2PrCOOHNH+3H+NH+3H+NH2PrPrPrCOOHOH—COO—OH—COO—pH＜pIpI=pHpH＞pI兩性離子氧飽和度氧飽和度pI：使Pr所帶的正電荷與負電荷相等，靜電荷為零的溶液pH值。此時在電場中不移動，溶解度最小。pI：決定與Protein的aa組成，堿性aa多則pI大，否則小。電泳：帶電物質(zhì)在電場中移動的現(xiàn)象叫電泳。方向：取決于所帶電荷的性質(zhì)(正負)（后者又取決于溶液的pH值和蛋白質(zhì)的氨基酸組成）。速度：取決于所帶電荷的多少(正相關(guān))和分子的大小(負相關(guān))（荷質(zhì)比）混合蛋白的分離：電泳自由界面電泳電泳紙上電泳醋酸纖維薄膜電泳區(qū)帶電泳凝膠電泳圓盤電泳平板電泳等電聚焦電泳免疫電泳在pH8.6的電泳緩沖液中（各蛋白最大pI為6.35-7.3）濾紙電泳血清蛋白的電泳圖如下：清蛋白α1—α2—β—γ—球蛋白+—三、Pr的膠體性質(zhì)大小：直徑1—100nm，膠體顆粒：布朗運動、丁多爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象、不能透過半透膜，具吸附能力（分子大表面具電荷和非極性基團），可用玻璃紙、火棉膠等透析純化（去除小分子雜質(zhì)），是生產(chǎn)上和實驗室常用的純化方法。穩(wěn)定蛋白質(zhì)溶液的因素（不聚集成大顆粒而沉淀）：水化膜（層）與電荷pH≠pI四、Pr的沉淀反應1.加高濃度鹽——鹽析：破壞蛋白質(zhì)的水膜又中和其電荷。不同蛋白質(zhì)所帶電荷不同，所以，所需鹽濃度不同，可分段鹽析，（NH4）2SO4半飽和，球蛋白析出；（NH4）2SO4飽和，清蛋白析出（分子量小pI低），（只要pH＞或＜pI可以認為所有的分子均帶同樣的電荷，所以，在一定pH下的鹽析與分子量有關(guān)：越大越易沉淀，pI過低或過高中和其電荷所需鹽濃度高）。2.有機溶劑沉淀：極性有機溶劑與水的作用大于蛋白，破壞水膜，多同時調(diào)節(jié)pH使其接近pI(pI時消除了靜電斥力)。多用乙醇。3.重金屬鹽沉淀(pH高于pI時)：蛋白質(zhì)的重金屬鹽溶解度很小。沉淀4.某些酸如：單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等生成不溶性鹽而沉淀（pH＜pI），并破壞分子內(nèi)氫鍵，使疏水性氨基酸殘基移至分子表面，各分子靠疏水力結(jié)合。5.加熱變性沉淀：破壞分子內(nèi)氫鍵，疏水基團外露，與水親和力減弱，水溶性降低，水化膜破壞。如制豆腐：加熱大豆蛋白的濃溶液，并加入MgCl2（鹽鹵）使蛋白凝固。制取蛋白并保持其生物活性：鹽析、低溫下加有機溶劑沉淀，有機溶劑在高溫或長時間接觸會使蛋白質(zhì)變性。五、蛋白質(zhì)的變性：理化因素影響，使空間（次級）結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)改變(但一級結(jié)構(gòu)并未破壞)的現(xiàn)象。變性蛋白質(zhì)的特點：①卷曲的肽鏈伸展，構(gòu)象破壞；②生物功能喪失：酶的催化能力、血紅蛋白的運O2能力、胰島素調(diào)節(jié)血糖的功能。③溶解度降低、喪失結(jié)晶能力。因肽鏈松散，易被蛋白酶消化。變性因素：化學變性因素：強酸、強堿與尿素、胍鹽、乙醇、重金屬。物理變性因素：超聲波、紫外線、加熱、震蕩與攪拌。變性的本質(zhì)：次級結(jié)構(gòu)破壞，但一級結(jié)構(gòu)沒破壞，所以分子量和組成不變。可逆或不可逆，胃蛋白酶的升溫(80-90℃)與降溫(37℃)可使活性可逆變化。應用：制作豆腐、尿蛋白檢驗(加熱)、急救重金屬中毒病人(給中毒病人吃大量乳品、濃豆?jié){或蛋清，然后催吐)等。制備蛋白與酶應防變性：應用低溫等。六、蛋白質(zhì)的顏色反應（分析測定的依據(jù)）1.雙縮脲反應（要求含兩個以上肽鍵）在堿性條件下能與CuSO4反應生成紅紫色的絡合物，具有雙縮脲結(jié)構(gòu)的物質(zhì)都有此反應（二脲加熱脫氨形成雙縮脲：H2N—C—NH—C—NH2）與Cu++形成絡合離子（兩側(cè)的氨基），540nm有吸收峰?！狢—NH—CH—C—NH：含兩個肽鍵的結(jié)