《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》課件

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)一、雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

實(shí)驗(yàn)二、紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)三、血清γ-球蛋白的分離與純化實(shí)驗(yàn)四、堿性磷酸酶Km值測(cè)定實(shí)驗(yàn)五、胰島素和腎上腺素對(duì)血糖含量的影響實(shí)驗(yàn)六、

血漿脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析實(shí)驗(yàn)七、SGPT活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)八、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清LDH同工酶實(shí)驗(yàn)九

、RNA的分離與鑒定實(shí)

驗(yàn)十、DEAE纖維素離子交換層析法分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)十一、質(zhì)粒的提取與鑒定實(shí)驗(yàn)一

雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

【目的要求】掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理?！緦?shí)驗(yàn)器材】中試管3支，1毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度計(jì)【方法步驟】取中試管3支，按下表操作。試劑（ml）標(biāo)準(zhǔn)管樣品管空白管蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)待測(cè)液蒸餾水雙縮脲試劑0.1————5.0

——0.1——5.0

————0.15.0各管混勻、放置37℃水浴中保溫20分鐘。用540nm比色，以空白管調(diào)零點(diǎn)，讀取各管光密度值?！咀⒁馐马?xiàng)】1．正確使用微量加樣器。2．取液要準(zhǔn)確。3.做好標(biāo)記，不要將試管號(hào)弄混?！舅伎碱}】1．分光光度計(jì)的使用及計(jì)算原理。實(shí)驗(yàn)二紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量【目的要求】①了解分光光度法的基本原理；②能較熟練使用紫外分光光度計(jì)?！緦?shí)驗(yàn)器材】1．紫外分光光度計(jì)。2．微量加樣器。3．蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）?！痉椒ú襟E】1．標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：任選一種蛋白質(zhì)溶液，經(jīng)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量后，用生理鹽水稀釋成濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液。2．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取試管6只，按下表操作管號(hào)123456蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（ml）

生理鹽水（ml）

0.53.51.03.01.52.52.02.02.51.54.0混勻，以第六管調(diào)零點(diǎn)，280nm波長(zhǎng)處比色。用光徑為1cm的石英杯測(cè)定各管吸光度，以各管的吸光度值為縱坐標(biāo)，計(jì)算各管內(nèi)蛋白質(zhì)的濃度，以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3．標(biāo)本測(cè)定：用生理鹽水將待測(cè)蛋白質(zhì)樣品稀釋成大約1mg/ml溶液。取1.0ml樣加生理鹽水3.0ml混勻，按上述方法測(cè)其吸光度?！窘Y(jié)果與分析】1．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白質(zhì)濃度。2．也可利用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算蛋白質(zhì)含量；適當(dāng)稀釋蛋白質(zhì)溶液測(cè)其A280nm和A260nm處吸光度，再用經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。如Lowry-Kalckar公式：蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）＝1.45A280－0.74A260?！咀⒁馐马?xiàng)】1．加量要準(zhǔn)確。2．比色皿的正確應(yīng)用。3．結(jié)果重復(fù)3次，取平均值?！舅伎碱}】1．為何要同時(shí)測(cè)定蛋白280nm和260nm處的光吸收值？

（一）血清γ-球蛋白的分離與純化實(shí)驗(yàn)三1．

掌握蛋白質(zhì)分離純化的主要方法和原理；

2．熟悉鹽析和層析的基本操作；

3．掌握離心機(jī)的正確使用方法?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緝x器試劑】試管、刻度吸管、吸耳球、膠頭滴管、層析柱、反應(yīng)板；血清、PBS液、葡聚糖凝膠G-25、納氏試劑、飽和硫酸銨溶液。

【實(shí)驗(yàn)原理

】1.鹽析

：是使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀的一種方法。（1）蛋白質(zhì)作為膠體在水中的穩(wěn)定存在的因素①電荷(同種電荷相斥）②水化膜（隔離）Pr++++++Pr++++++中性鹽破壞了這兩個(gè)穩(wěn)定性因素，使蛋白質(zhì)沉淀。中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。沉淀蛋白質(zhì)的方法還有哪些？（2）鹽析的影響因素蛋白質(zhì)的濃度、鹽濃度、pH值、溫度等。本實(shí)驗(yàn)球蛋白在半飽和硫酸銨溶液中沉淀而清蛋白溶解，γ-球蛋白在33%濃度的硫酸銨溶液中沉淀。

2.層析：

待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過(guò)一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。3.檢測(cè)分離效果（1）納氏試劑：鹽存在時(shí)，NH4+與其反應(yīng)呈現(xiàn)黃色或橙色。（2）雙縮尿試劑檢測(cè)：蛋白質(zhì)與其呈現(xiàn)紅色或紫紅色。1．鹽析⑴血清2ml放入離心管中，加入PBS2ml混勻逐滴加入飽和硫酸銨溶液4ml，邊加邊搖勻。靜置10分鐘后，離心3000rpm10分鐘，傾上清液（上清中主要含清蛋白）。

【實(shí)驗(yàn)操作】⑵將離心管中的沉淀用1mlPBS攪拌溶解，再逐滴加入飽和硫酸銨溶液0.5ml，邊加邊搖勻。靜置10分鐘后，離心3000rpm10分鐘（注意離心機(jī)使用時(shí)需要配平并且離心時(shí)將蓋子蓋好）。傾上清液（上清中主要含α、β球蛋白），沉淀即為初步純化的γ-球蛋白。

⑴裝柱：將制好的葡聚糖凝膠混勻，傾入層析柱內(nèi)，靜止后分層，凝膠高度要在柱高的1/3~3/4之間。當(dāng)液面接近凝膠上表面時(shí)將出口膠管夾緊待用。2.脫鹽：注意：裝柱要均勻，不要有氣泡和分層，凝膠面要平整

（2）加樣：向裝有γ-球蛋白的離心管內(nèi)加入PBS10滴，用玻璃棒攪拌使之溶解。再用乳頭吸管吸出γ-球蛋白液，加到層析柱內(nèi)凝膠表面。待γ-球蛋白液全部進(jìn)入凝膠柱內(nèi)時(shí)，再用乳頭吸管小心加入PBS約1cm高，待大部分液體進(jìn)入凝膠柱后，再繼續(xù)加PBS直至洗脫完畢（加液時(shí)注意不要沖擊凝膠表面）。在整個(gè)洗脫過(guò)程中不能讓液面降至凝膠面以下。（3）收集：加樣同時(shí)可進(jìn)行收集，每管收集1ml。收集12管后加緊螺旋夾。回收凝膠和尼龍布等。⑷檢測(cè)：準(zhǔn)備反應(yīng)板兩塊。將12管收集液各取1滴分別放入反應(yīng)板的12個(gè)凹孔。一塊板的各孔內(nèi)加納氏試劑1滴，有NH4+者呈黃色至橙色?？捎茫?、－號(hào)表示有無(wú)呈色或顏色深淺。再向另一塊板的各孔內(nèi)加雙縮脲試劑1滴，有蛋白者呈藍(lán)紫色?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】可用＋、－號(hào)表示有無(wú)呈色或顏色深淺。將雙色脲反應(yīng)呈色最深的一管收集液保留供下次實(shí)驗(yàn)使用。利用醋酸纖維素薄膜電泳檢測(cè)本次實(shí)驗(yàn)所提γ-球蛋白的純度。1．

使用離心機(jī)前注意配平；2．

裝柱要均勻，不要有氣泡和分層，凝膠面要平整；3．凝膠高度要在柱高的1/3~3/4之間；4．脫鹽時(shí)不能沖擊凝膠面，PBS液面不能降到凝膠面以下；5．實(shí)驗(yàn)后將凝膠中鹽洗脫干凈后回收再利用?！緦?shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】【思考題】1.裝柱不均勻，凝膠面不平整對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有什么影響？2.鹽析與變性的異同？3．凝膠層析的原理？（二）血清γ-蛋白的鑒定——醋酸纖維素薄膜電泳1.掌握電泳的基本原理；

2.熟悉醋酸纖維素薄膜電泳的方法和

應(yīng)用。

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹俊緝x器試劑】電泳儀、點(diǎn)樣器、鑷子、醋酸纖維素薄膜；巴比妥緩沖液、染色液、漂洗掖。

【實(shí)驗(yàn)原理

】1.蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在同一個(gè)PH環(huán)境下，混合蛋白質(zhì)中各種成分帶電量不同、分子大小不同，在同一電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度不同，導(dǎo)致相同的時(shí)間遷移的距離不同而把它們分開(kāi)。（1）分子越小，泳動(dòng)速度越快（2）帶電量越多，泳動(dòng)速度越快反之，越慢。2.本實(shí)驗(yàn)分離全血清中各種蛋白質(zhì)成分，同時(shí)鑒定上次實(shí)驗(yàn)提純結(jié)果。

?點(diǎn)樣γ

βα2α1清蛋白

?Γ球蛋白1.準(zhǔn)備與點(diǎn)樣：用巴比妥緩沖液將醋酸纖維素薄膜充分浸透，在毛面距一端1.5厘米處點(diǎn)樣，即上述實(shí)驗(yàn)得到的γ-蛋白，另取薄膜一點(diǎn)全血清。2.電泳：點(diǎn)樣面朝下，點(diǎn)樣端靠近負(fù)極，電壓110V，通電40-45min；3．染色：2-5min；4.脫色：直至背景漂凈為止?！緦?shí)驗(yàn)操作】【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】根據(jù)電泳區(qū)帶出現(xiàn)的位置和條數(shù)判斷是何種血清蛋白，如果只是一條γ-蛋白說(shuō)明上個(gè)實(shí)驗(yàn)分離純化的較好。1．不要用手觸摸纖維素膜；2．注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面；3．點(diǎn)樣位置要在1.5厘米以內(nèi)，不要距邊緣太近，不要重復(fù)點(diǎn)樣；4．膜放進(jìn)電泳槽時(shí)，將點(diǎn)樣面向下，點(diǎn)樣端靠近陰極；【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】【思考題】如果電泳結(jié)果證實(shí)γ球蛋白的分離效果不理想，應(yīng)從哪些方面分析？實(shí)驗(yàn)四

堿性磷酸酶Km值測(cè)定【目的要求】①了解酶促反應(yīng)的影響因素；②掌握Km的意義和測(cè)定方法；③了解底物濃度與酶活性的關(guān)系?！緦?shí)驗(yàn)器材】1．可見(jiàn)分光光度計(jì)。2．微量加樣器。3．0.025U/ml的酶液。【方法步驟】1．取干凈試管8支，按下表正確操作：試劑123456780.02M基質(zhì)液蒸餾水碳酸鹽緩沖液

0.11.31.50.21.21.50.31.11.50.41.01.50.60.81.50.80.61.51.41.51.41.5混勻置37℃水浴保溫5分鐘酚標(biāo)準(zhǔn)液

酶液0.10.10.10.10.10.10.10.1充分混勻置37℃水浴準(zhǔn)確保溫15分鐘0.5％鐵氰化鉀

2.02.02.02.02.02.02.02.0充分混勻后置室溫10min，510nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，以第8管做空白，測(cè)定各管的光密度?！窘Y(jié)果與分析】1．計(jì)算各管酶活性單位。D測(cè)/D標(biāo)×0.012．計(jì)算各管[S]。[S]＝加入[S]量/3.0×0.023．進(jìn)一步計(jì)算出各管1/V和1/[S]。4．將上述數(shù)據(jù)填入下表數(shù)值1號(hào)2號(hào)3號(hào)4號(hào)5號(hào)6號(hào)光密度值V1/V[S]1/[S]以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，畫出各管的坐標(biāo)點(diǎn)，并將其連成直線，此直線與橫軸的相交點(diǎn)為-1/Km，由此可計(jì)算出該酶的Km?！咀⒁馐马?xiàng)】1．本實(shí)驗(yàn)所用各種玻璃儀器必須洗凈烤干后備用。2．各種試劑的加入量要準(zhǔn)確。3．嚴(yán)格掌握加入酶液后的保溫時(shí)間，否則會(huì)影響其產(chǎn)物量的準(zhǔn)確度【思考題】1．為何可以酶活性單位代表酶促反應(yīng)速度？2．酶促反應(yīng)的影響因素有哪些？3．何為Km值？如何測(cè)定一個(gè)酶的Km值？—Folin-Wu法實(shí)驗(yàn)五

胰島素和腎上腺素對(duì)血糖

含量的影響

1.掌握影響血糖含量的因素；

2.熟悉測(cè)定血糖的原理和方法及臨床意義；

3.熟悉動(dòng)物取血的基本操作?！緦?shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

【儀器試劑】

722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)、血糖管、奧氏吸管、錐形瓶、注射器等；鎢酸鈉、濃硫酸、磷鉬酸、堿性銅等。用于吸抗凝血,中間為膨大的球體,減少血液和吸管壁的接觸面積,盡量避免融血.

【實(shí)驗(yàn)原理

】主要調(diào)節(jié)激素降低血糖：胰島素升高血糖：胰高血糖素(glucagon)、糖皮質(zhì)激素、腎上腺素1.體內(nèi)血糖水平主要依靠激素的調(diào)節(jié)胰島素(insulin)：體內(nèi)唯一降低血糖水平的激素

腎上腺素：主要在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。2.無(wú)蛋白血濾液的制備原理本實(shí)驗(yàn)采用吳憲氏法測(cè)定血糖，要求將血液制成無(wú)蛋白血濾液：???2RCOOHNH2+H2WO4RCOOHNH2WO42此方法是生物堿沉淀蛋白質(zhì)沉淀蛋白質(zhì)的方法還有哪些？3.利用吳憲氏法測(cè)定血糖的原理G+Cu2+△OH-Cu2O+糖氧化物3Cu2O+3H3PO4.2MO3.12H2O6CuO+3H3PO4.2MO2O3.12H2O鉬藍(lán)通過(guò)測(cè)定鉬藍(lán)顏色的深淺計(jì)算葡萄糖的含量！1．動(dòng)物準(zhǔn)備取正常家兔兩只，實(shí)驗(yàn)前預(yù)先饑餓，稱體重（一般為2～3kg）。2．取血以耳緣靜脈取血，先去毛，用二甲苯擦拭兔耳，使其血管充血，再用干棉球擦干，用粗針頭刺破靜脈放血，將血液收入抗凝管中（按10：1的比例將防凝劑放入試管，邊收集（量約3ml）邊搖勻，以防凝固。用干棉球壓迫血管止血?！緦?shí)驗(yàn)操作】3．注射激素后取血(1)取餓兔血后，其中一只兔腹部皮下注射胰島素，劑量按0.75u/kg體重計(jì)算，并記錄注射時(shí)間。一小時(shí)后再取血。取血后立即腹腔或皮下注射25%葡萄糖液10ml，以免家兔發(fā)生胰島素性休克而死亡。(2)另一只兔腹部皮下注射腎上腺素，劑量按0.4mg/kg體重計(jì)算，并記錄注射時(shí)間。半小時(shí)后再取血。

用干燥的奧氏吸管吸防凝血1ml，擦去管尖外面的血液后，慢慢地放于干燥的錐形瓶中,然后吸硫酸8ml,慢慢地加入，隨加隨搖（不能有氣泡產(chǎn)生），此時(shí)溶液逐漸變?yōu)樯钭厣傺劐F形瓶壁加入鎢酸鈉1ml，隨加隨搖以充分沉淀蛋白質(zhì)，混勻后，放置5分鐘，然后以2500rpm離心5分鐘，倒出上清夜待血糖測(cè)定用，此液即無(wú)蛋白血濾液。4.無(wú)蛋白血濾液的制備：5.血糖值的測(cè)定

取中試管五支，分別標(biāo)記，按下表操作

試劑空白管標(biāo)準(zhǔn)管胰前胰后腎前腎后

無(wú)蛋白血濾液0.50.50.50.5G標(biāo)準(zhǔn)液0.5蒸餾水0.5堿性銅0.50.50.50.50.50.5混勻，置沸水浴中煮8分鐘，取出，放入冷水浴中冷卻。切勿搖動(dòng)血糖管。各加入磷鉬酸試劑0.5ml，混勻，放置10分鐘，各加蒸餾水5ml，用420nm波長(zhǎng)比色，以空白調(diào)零，讀取各管光密度.【實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算】葡萄糖（mmol/L）=OD測(cè)定/OD標(biāo)準(zhǔn)×0.5×10正常值：3.9～6.1mmol/L（人）

兔比人略低。C標(biāo)準(zhǔn)稀釋的倍數(shù)1.制備無(wú)蛋白血濾液過(guò)程中，用奧氏吸管吸取全血，將吸管外壁的血液擦除干凈后插入蒸餾水底層，緩緩放出血液，再用上層液將內(nèi)壁的血液沖洗干凈。2.加硫酸、鎢酸鈉時(shí)，要邊加邊搖勻。3.沸水浴和冷水浴過(guò)程中，切勿搖動(dòng)。

【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】【思考題】1.為什么測(cè)定血糖時(shí)必須預(yù)先出去蛋白質(zhì)？2.為什么選用奧氏吸管吸取血液？3.為什么用操作中不要搖動(dòng)血糖管？胰島素①促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝外細(xì)胞；②加速糖原合成，抑制糖原分解；③加快糖的有氧氧化；④抑制肝內(nèi)糖異生；⑤減少脂肪動(dòng)員。——體內(nèi)唯一降低血糖水平的激素胰島素的作用機(jī)制:實(shí)驗(yàn)六

血漿脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳分析【目的要求】1.掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理及方法。2.掌握血漿脂蛋白的分類?！緦?shí)驗(yàn)器材】1.儀器與材料：玻璃片，5ml刻度吸量管，濾紙片，打槽器，20μl微量加樣器，電泳儀。2．試劑：蘇丹黑B染色液，巴比妥緩沖液，凝膠緩沖液，瓊脂糖凝膠。3．樣品：血清【方法與步驟】1.制板:取玻璃片放到平整的桌面上，用刻度吸量管吸取溶化的瓊脂糖約2.5～2.8ml加到玻璃片上。2.挖槽：5分鐘后，在離凝膠板一端約1.5厘米處打一個(gè)10×1mm的小槽，用壓扁的針頭將槽內(nèi)凝膠清除，然后用濾紙片將槽內(nèi)的水吸干?！痉椒ㄅc步驟】3.加樣:于瓊脂糖凝膠槽內(nèi)加入預(yù)染好的血清20μl。4.電泳:將加好樣品的瓊脂糖凝膠板置于電泳槽支架上，樣品端靠近陰極，再用雙層紗布搭橋，平衡3～5分鐘，然后通電，電壓為80～100v，電泳時(shí)間為40～60分鐘?！窘Y(jié)果與分析】α-脂蛋白位于最前，β-脂蛋白位于最后，中間為前β-脂蛋白，空腹血清無(wú)乳糜微粒，進(jìn)食后血清可出現(xiàn)乳糜微粒位于原點(diǎn)?！咀⒁馐马?xiàng)】1.制板要均勻。2.挖槽要整齊,不能太寬。3.電泳電壓要保持穩(wěn)定?！舅伎碱}】1.瓊脂糖凝膠電泳的原理是什么？實(shí)驗(yàn)七SGPT活性測(cè)定【目的要求】１．掌握SGPT活性測(cè)定的原理。２．熟悉SGPT活性測(cè)定的臨床意義?！緦?shí)驗(yàn)器材】1．儀器與材料:中試管3支，l毫升刻度吸管2支，5升刻度吸管1支，100μl微量加樣器，水浴箱，721型分光光度計(jì)。2．試劑:丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液，SGPT基質(zhì)液，0.1MpH7.4磷酸鹽緩沖液，2、4-二硝基苯肼溶液，0.4mol/LnaOH溶液。3．樣品:血清【方法與步驟】取中試管3支，按下表操作。

標(biāo)準(zhǔn)管樣品管空白管血清（ml）0.10.1丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液（ml）0.1SGPT基質(zhì)液（ml）0.50.5

混勻后，37℃水浴箱30分鐘，【方法與步驟】

標(biāo)準(zhǔn)管樣品管空白管2、4-二硝基苯肼（ml）0.50.50.5SGPT基質(zhì)液（ml）0.5

混勻后，37℃水浴箱30分鐘，0.4mol/LNaOH（ml）5.05.05.0【方法與步驟】將各管混勻后靜置10分鐘，然后用721型分光光度計(jì)500nm波長(zhǎng)比色，以空白管調(diào)零，讀取光密度值，計(jì)算。SGPT=測(cè)定管光密度標(biāo)準(zhǔn)管光密度×20×2.50.1×11【結(jié)果與分析】正常值為2-40單位注：1個(gè)SGPT單位相當(dāng)于1ml血清37℃，30分鐘產(chǎn)生2.5ug丙酮酸?！咀⒁馐马?xiàng)】1．試劑量、保溫時(shí)間要準(zhǔn)確。2．測(cè)定時(shí)間盡量短?！舅伎碱}】1．SGPT測(cè)定有何臨床意義?聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清LDH同工酶

實(shí)驗(yàn)八【目的要求】掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。學(xué)習(xí)盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)，用于分離蛋白質(zhì)。

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑N，N，N

，N

—四甲基乙二胺(N，N，N

，N

—tetramethylethylenediamine，簡(jiǎn)稱TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，簡(jiǎn)稱AP)或核黃素(ribofavin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)?！緦?shí)驗(yàn)原理】聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；(3)對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定；(4)幾乎無(wú)吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g(6)凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過(guò)改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。凝膠濃度(T)的選擇與被分離物質(zhì)分子量密切相關(guān)。表3.4分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系分子量范圍 適用的凝膠濃度/(%)

蛋白質(zhì)

104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10

5×105 2-5 核酸(RNA)

104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。目前常用的多為圓盤電泳(如圖1)和板狀電泳(如圖2)，兩者電泳原理完全相同。圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

乳酸脫氫酶（LDH）是葡萄糖酵解過(guò)程中很重要的一種酶，該酶催化丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化。LDH目前發(fā)現(xiàn)有五種同工酶。在堿性條件下，五種LDH同工酶都帶負(fù)電荷，電泳時(shí)都向正極移動(dòng)。由于各種同工酶的pI不同，在同一pH條件下帶電荷多少不同，電泳速度即不同，故可用電泳法將其分離。按電泳速度的快慢依次為ODLDH1、ODLDH2、ODLDH3、ODLDH4、ODLDH5將LDH同工酶電泳分離后進(jìn)行染色，以顯示各種同工酶的位置。其染色的原理是：乳酸丙酮酸NAD+

NADH+H+

PMSH2

PMSNBT(無(wú)色)NBTH2(紫藍(lán)色)【實(shí)驗(yàn)器材】?jī)x器與材料真空泵、圓盤電泳槽、電泳儀、刻度吸管、微量加樣器、長(zhǎng)頭注射器、燒杯等。試劑

30％丙烯酰胺貯存液、催化劑1％過(guò)硫酸銨、1％TEMED緩沖液、電泳槽緩沖液、蔗糖、乳酸鈉、輔酶I、PMS、NBT、7.5%醋酸溶液樣品血清【方法與步驟】1.準(zhǔn)備玻璃管：準(zhǔn)備5×60mm玻璃管若干支，洗凈烤干，管下端套一密塞的橡皮套或瓶塞，垂直插入管架上。試劑用量TEMED緩沖液30%Acr-Bis溶液蒸餾水1.5ml4ml6ml混勻真空抽氣5分鐘0.14%過(guò)硫酸銨合計(jì)6ml17.5ml2.配制凝膠：3.裝管：用細(xì)長(zhǎng)滴管或長(zhǎng)頭注射器吸取凝膠裝入玻璃管中，高度距離管上口8mm為宜，檢查管內(nèi)無(wú)氣泡后，向膠面緩緩注入蒸餾水約4mm高度，在自然光下聚合約40分鐘，見(jiàn)水與膠之間有明顯界面出現(xiàn)，為膠已聚合。用濾紙條吸取凝膠上方水層，取下管底部的橡皮套管，將凝膠管垂直插入電泳槽圓孔中并盡量使各管高度一致。4.加樣：用微量加樣器每管加血清―蔗糖稀釋液100ul，（血清1份，40%蔗糖6份，溴酚蘭少許混合而成）。用電極緩沖液將膠管頂端注滿，小心避免樣品混合。在上下槽中加入電極緩沖液，上槽應(yīng)漫過(guò)膠管上口。5.電泳：接通電源，負(fù)極接上槽，正極接下槽，調(diào)電流2.5mA/管或調(diào)電壓200V，保持電壓穩(wěn)定。等染料遷移到距凝膠下口約5mm處時(shí)，停止電泳。時(shí)間約2小時(shí)。6.出膠：用長(zhǎng)頭注射器吸滿水，將針頭小心插入凝膠與玻管壁之間，邊推水邊旋轉(zhuǎn)膠管，凝膠柱即可脫出。將每條膠柱放入小試管內(nèi)。7.染色：管內(nèi)加染色液，放37℃水浴保溫待淡紫色區(qū)帶出現(xiàn)（約30分鐘）。倒出染色液并用水洗去凝膠柱表面染色液，加入醋酸溶液以終止酶促反應(yīng)。8.百分含量掃描測(cè)：將分離的LDH同工酶凝膠柱用薄層層析掃描儀在560nm波長(zhǎng)處掃描，測(cè)出光密度，計(jì)算出各種LDH同工酶的百分含量。計(jì)算方法：總光密度：T=ODLDH1+ODLDH2+ODLDH3+ODLDH4+ODLDH5【結(jié)果與分析】

正常人血清LDH各同工酶活力百分比是：LDHl33.4％；LDH242.8％；LDH318.5％；LDH43.9％；LDH5l.4％。不同方法測(cè)定值略有不同?！咀⒁馐马?xiàng)】

所用器材必須清潔。特別是制備凝膠柱所用的玻璃管每次用后必須用洗液浸泡，再常規(guī)清洗，否則凝膠剝離困難。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)性毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用，應(yīng)避免直接接觸。電泳完畢后，上下槽電極緩沖液不可混合，因離子強(qiáng)度和pH值都已發(fā)生改變?！舅伎碱}】LDH同工酶測(cè)定的臨床意義是什么實(shí)驗(yàn)九

RNA的分離與鑒定【目的要求】1．掌握RNA分離純化的原理及操作方法2．熟悉臺(tái)式離心機(jī)的使用3.掌握RNA定量技術(shù)【實(shí)驗(yàn)器材】1、儀器與材料離心機(jī)一臺(tái),組織搗碎機(jī)一臺(tái)，手術(shù)器械1套，天平1臺(tái)。2、藥品0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA勻漿緩沖液，氯仿-異戊醇混合液，RNA標(biāo)準(zhǔn)液，95％冷乙醇，地衣酚，3、動(dòng)物家兔，體重2.5±0.5kg?！痉椒ú襟E】1.選取健康家兔一只，斷頭處死，取其肝臟，稱取25g，放入組織搗碎機(jī)中，加入預(yù)冷的0.14mol/LNaCl-0.15mol/LEDTA勻漿緩沖液約130ml，高速研磨2分鐘，加緩沖液至200ml，即為肝勻漿。2.分離核蛋白：肝勻漿4ml倒入試管中，3000rpm離心20min，上清倒入另一試管中為A管（RNP提取液），沉淀?xiàng)壢ァ?.A管中加入等體積的氯仿-異戊醇混合液，震蕩2分鐘，3000rpm離心15min，管內(nèi)液體分三層，上層為含有RNA的水溶液，吸取上層水溶液轉(zhuǎn)入B管中。4．于B管加二倍體積的95％冷乙醇，見(jiàn)乳白色RNA沉淀，混勻放置10min，3000rpm離心5min，沉淀為純化RNA。5．RNA的溶解：沉淀中加入0.14mol/LNaCl2.0ml，攪拌溶解，2000rpm離心10min，上清液則為RNA水解液。4ml肝勻漿(已加0.14mol/LNaCl)6．RNA的測(cè)定：按表2操作。試劑（ml）標(biāo)準(zhǔn)管樣品管空白管RNA標(biāo)準(zhǔn)液RNA提取液蒸餾水地衣酚1.03.01.03.01.03.0混勻，沸水浴10分鐘，取出冷卻，以空白管調(diào)零，在670nm比色，讀取光密度值，計(jì)算?！咀⒁馐马?xiàng)】1.在制備肝勻漿時(shí)，應(yīng)盡量在冰冷條件下進(jìn)行。2.各步驟操作應(yīng)力求準(zhǔn)確，盡量減少中途核酸的丟失，保證定量測(cè)定的準(zhǔn)確性?！舅伎碱}】1.比較討論氯仿-異戊醇混合液，95％冷乙醇有何作用？2.為什么實(shí)驗(yàn)最后鑒定的是戊糖而不是其他的物質(zhì)，戊糖的含量可以代替RNA的含量嗎？實(shí)驗(yàn)十

DEAE纖維素離子交換層析法

分離蛋白質(zhì)

【目的要求】

掌握DEAE纖維素離子交換層析法的基本原理掌握其實(shí)際操作過(guò)程，包括裝柱、洗脫、測(cè)定等步驟熟悉DEAE纖維素離子交換劑的結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)了解梯度洗脫的原理【實(shí)驗(yàn)器材】

儀器與材料

試管、燒杯、玻璃攪棒、層析柱、梯度洗脫儀等藥品DEAE纖維素-22(纖維素DE22)、0.5mol/LHCL、0.5mol/LNaOH、0.01MNa2HP04

、0.5MNa2HP04

【方法與步驟】

DEAE-22纖維素處理

裝柱

安裝梯度發(fā)生器

加樣

洗脫

檢測(cè)

DEAE-22纖維素處理

稱取DEAE-22纖維素2.5克先用40ml0.5mol/LHCL浸泡30分鐘,加蒸餾水60ml反復(fù)洗滌,使上層液體沒(méi)有細(xì)的混懸物,然后倒入有100目尼龍滑布的漏斗中,用蒸餾水充分洗滌,直到流出液的pH≤4止再用40ml0.5mol/LNaOH浸泡30分鐘,傾棄上清液,加蒸餾水100m1,攪拌后,倒入有細(xì)尼龍布的漏斗中,用蒸餾水充分洗滌,直到流出液的pH≤8時(shí)，濾去水分將上述纖維素放入燒杯中,加入0.01MNa2HP04100m1,浸泡并攪動(dòng)，放置5分鐘，傾去上層液體,必要時(shí)再重復(fù)操作,直到溶液pH=8止裝柱

用螺旋夾扭緊層析柱下端膠管，把層析柱夾在鐵支架上柱中加數(shù)毫升0.01MNa2HP04

液，然后打開(kāi)出口，排出氣泡，待柱中液體只剩下約1cm高時(shí)關(guān)閉出口將處理好的DEAE纖維素混懸液用吸管連續(xù)移入層析柱內(nèi)，擰松下口的螺旋夾，使液體滴下全加到柱內(nèi)后，待液面接近纖維素頂上界面時(shí)，把出口螺旋擰緊安裝梯度發(fā)生器

將梯度發(fā)生器兩筒間及出口膠管的螺旋夾都擰緊，向有出口側(cè)的筒內(nèi)加入0.01MNa2HP04液40m1，另一筒內(nèi)加0.5MNa2HP04液40m1把此梯度發(fā)生器放到磁力攪拌器上，攪拌子放在出口側(cè)的盛液筒中，使梯度發(fā)生器出口細(xì)膠管內(nèi)充滿掖體，排出氣泡。扭緊螺旋夾，細(xì)膠管下端邊到層析柱上口的膠塞上的連接管上

加樣

用吸管接近床面的位置上緩慢加入血清0.5m1，打開(kāi)下口讓液體緩慢流出，流速每分鐘5-10滴到全部血清恰好注入床面時(shí)，立即小心的加入0.01MNa2HP04液0.5m1,當(dāng)液面接近床面時(shí)，擰緊下口螺旋夾，并把下口的膠管連接到自動(dòng)收集器的收集管上

洗脫

擰松梯度發(fā)生器兩盛液筒間的螺旋夾，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器。將連接梯度發(fā)生器兩口的細(xì)膠管連接到層析柱上端膠塞連接管上，

使液體流入層析柱內(nèi)扭松層析下端膠管的螺旋夾，控制流速約50滴/分，每收集管收集量約為40m1時(shí)換管，直到收集完為止檢測(cè)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)讀各管的280nm的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo),管號(hào)為橫坐標(biāo),用方格坐標(biāo)紙繪出血清蛋白層析譜觀察判斷結(jié)果

【結(jié)果與分析】

不同管號(hào)中的蛋白質(zhì)溶液，吸光度各異，隨著管號(hào)增加，吸光度先逐漸升高然后逐漸降低這表明經(jīng)過(guò)DEAE纖維素離子交換層析法蛋白質(zhì)被分離出來(lái)【注意事項(xiàng)】

裝柱時(shí)要避免氣泡產(chǎn)生。加樣時(shí)不要攪動(dòng)床面。

【思考題】

DEAE纖維素離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的基本原理。分析梯度洗脫的機(jī)制

實(shí)驗(yàn)十一、質(zhì)粒的提取與鑒定

（設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）

目的要求1.學(xué)生自己設(shè)計(jì)出提取質(zhì)粒的方案，寫出較完整的設(shè)計(jì)報(bào)告。2.質(zhì)粒提取與鑒定有多種方法，可以培養(yǎng)學(xué)生提高分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力。3.通過(guò)實(shí)驗(yàn)加深對(duì)理論的理解，學(xué)習(xí)掌握基本的生化實(shí)驗(yàn)技能與實(shí)驗(yàn)方法，為今后的學(xué)習(xí)和研究打下一定的基礎(chǔ)。4.培養(yǎng)學(xué)生的綜合能力和創(chuàng)新精神。實(shí)驗(yàn)原理一.質(zhì)粒提取質(zhì)粒提取方法很多，常用煮沸法、堿裂解法、SDS法均可獲得較滿意效果。本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法。原理：在pH2.0～12.6堿性環(huán)境中，線形的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)（CC）質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而CC質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，可將去除大部分細(xì)胞碎片染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。實(shí)驗(yàn)步驟

一、CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞

1.取JM109單菌落,接種于100ml的SOB培養(yǎng)基中,37℃,300rpm強(qiáng)烈振蕩培養(yǎng)約2h。2.將培養(yǎng)物置于冰上10min，然后轉(zhuǎn)移到兩個(gè)50ml離心管中,4℃，4000rpm離心10min。3.棄上清,倒置離心管1min,流盡剩余液體,然后加入10ml冰冷的0.1mol/LCaCl2致敏液,重懸菌體,置于冰上10min。4.4℃,4000rpm離心10min回收細(xì)菌，棄上清，每50ml的原培養(yǎng)物再加入2ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，重懸細(xì)菌。

5.按每份200μl分裝細(xì)菌,若不馬上進(jìn)行轉(zhuǎn)化,該感受態(tài)細(xì)菌可以加入終濃度為10%的滅菌甘油,置于-70℃保存.二.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(pUC18及pBR322及質(zhì)粒)1.在滅菌的1.5ml離心管中，加入200μl新鮮制備感受態(tài)細(xì)菌及1μg質(zhì)粒輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物,置于冰上30min,同時(shí)設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組:①取10ng載體質(zhì)粒DNA加至感受態(tài)細(xì)菌作陽(yáng)性對(duì)照;②不加任何DNA的感受態(tài)細(xì)菌作陰性對(duì)照。

2.42℃熱休克90秒,迅速放回冰中，將細(xì)菌冷卻2分鐘,加入無(wú)抗生素的800μlSOC培養(yǎng)基,37℃，225rpm溫和振蕩90min,讓細(xì)菌中的質(zhì)粒表達(dá)抗生素抗性蛋白。3.取200μl轉(zhuǎn)化混合物鋪于90mm的SOB瓊脂平板上(含有氨芐青霉素60μg/ml20mmol/LMgSO4)，室溫放置30min,待溶液被瓊脂吸收后,倒置平皿，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。三.堿裂法、堿裂解法、SDS法均可提取質(zhì)粒；四.電泳法、分子雜交、酶切等方法均可鑒定質(zhì)粒。

結(jié)果1.通過(guò)抗藥性初步篩選出含有質(zhì)粒的大腸桿菌；2.通過(guò)電泳鑒定時(shí)會(huì)看不同構(gòu)象的質(zhì)粒條帶。注意事項(xiàng)1．本實(shí)驗(yàn)所用各種玻璃儀器必須洗凈烤干消毒后備用。2．各種試劑的加入量要準(zhǔn)確。3.嚴(yán)格的控制溫度、時(shí)間和pH值。

思考題

1．不同方法提取質(zhì)粒的利弊？2．不同構(gòu)象的質(zhì)粒的泳動(dòng)速度如何？3.以質(zhì)粒為載體時(shí)，應(yīng)選擇什么構(gòu)象的質(zhì)粒？3(kx%4na*99rmn#odXMcRVS49sjcDWrNaeiR6Q4CEF+gQ%d+S!X+VN5s3z8qX3rsMTjTW+!35C15liBNl)fRB(xzwSZb65DF#tUCjE)5wN7wfXPl+hxt-l(BELs8slkR9Zbzf$8x)MC+wbtrKUqyk&Vqxj9IbO$bF$Z331OYJkd&riFSj6SFwR!gb)f$)LDTC$dLgG8viECOLgNKP&#D!flj5djXaf)($bDRm!moI8w0TTiZGK43lFHTO33mIz*2EsdP8H1gXlbs7sZ-rQwGFry%6AkFphmLaSvu8gB!%H%0AW3hTeerlfso$qeHT)NII(bq*iC1E3IRmAiP2Uj7E4(uS-NObeDrgCU7g0ksie(x)5$19vHeaqQGhdjM2SaPF7Pi1zobA6(fFtt2r&D-6Rdf$MbH*!mksd0d3I2ofq6((2iwQIN-WRc$bJ$Buocojr7Hsl%TzJSxm!SzN%PPwBy&uD#-vXQS8iFCBBdB8E3fXkw+rfr*nBdRNI&w7ou0)7+YdLUNGI-Q0VR9juhvfmYWU1q9zsWX+lCqxcK1dg56Tp2uTQGJ6EID&tR42n1imFBNh-6KVV$G5ZU+kV&anmP5KBsq8S(3%YI7-vF4dN0UpU3qlI$LGoVVEQHJgKKVWHB-tfHRfHyu0VrnfI8kO&D9jCyPMcNItxjr(CPpgT5%V9t%wh$BxlsGbmrlj65WBzjf47OGVBKUeODm1(6ejEU1z-1X()$VwOg5Yn!Z*3VeZz5BLo(ODepdfCOCtDTkegQqUcPIzD(Ix-EF-fSHqHHMDJql0Wi(woeG6jQ1QuN6eIEY7Tj13AwuuI3rgFwrtB+14zggsn%9i#NDRBSN6sdZ1wflyM7a%d#sosRSw7$2vb+r24TRJLNLjQI9n(UD9UvHWrJ)CmdI0EAUMAT0MP35hyUMRDMOeS&lv*pjj&K-%%qU7N6CQrIWbW2iJk05D)A6F2pl0ZG9a&%ORqg)taOBzOekd##4KxGSw724ApMEedQ81yXBjc8&KwUc71-p0pHED8#9mHtcmitg7zVw#zQyQ58t&s!N$Wvr!8f)-Y2S3Tc$gNL*TWv!Nc1rxxab*2gQtX$&vWd#xrGExMyXFSZT&7P*(J9zKiO$qX7s7U&qNwhIcy7JJNqh$%YcLy5IfSJvF2+6RLO+(wVm9hqkoHwX2cV6y-#wq8sEnsFg-U*a3UxKm*C30NCoRaUp)wlB&OZ&-k*p(bs6MEd)mNy83M4SyUc*rFB(nBFC3Ll2N)(w4huasuPKV5ubKz&3G2sGnnPJnRXHhsOQUlS1(HZnH0r0S62kOYkItgLjKq-6isqEskYD*$x#Lw+L58uSv3Fwb8ElHmV9q29vQPQjN+2NbD4dht3Gll4fqrWfc)wP!-l0AiK86+ikBrlN-GD1!PnV*wWY2YsUlSTWivFuizKVy)l$rfJKfjgT4OrJQItV+Jps3K6FQxO-!zHpcyPkJblzaND9$i$7w*G9UwQlq#ea3!nWVwRu3elU2E!*vlmwp%4i#CvO(q)QCj49(rlQ7I7q1GO!RZT6qebVQ)TGMFflzjE0*r&#bOyvWiOO!XK0LLAbKGldkOxGZdgfEOjpFntnvc*U9t2v2iBj%#Fw&59ng30)v(QQ+lNxQgvxA+CirVIZ6xlKcDJ&crTAZh2LElFev5%eXpquqxURSgV1zTvsg(ARWbNY1CbfRjsURq86GkFjyLMu*v(h-ipTAbkgWD+Uedk$Mc+OJuHGMUWn&a#J116iqk8tTCyn5Yuiu-XI1Ss1p+kl%&Xn!gWGt!(Kq97+Fu7kdBPerO*5XRs4dX46m9U-SYb$1seVe4#mZ*Unh#IAkv!vA$S!5SkzT!a4e85Y5fN%mnaLlKdQXE2LvUifd*PahsrQS*CkH4lIKgffT9KiXymTf(5AslO1H#g7*bbsfiVuRh*i$r6q#Wa##TXVLjRUy(iryL)2MjPSY*+emqE!C*BSD!pB)ixRv-UeFtdPuY!jtZxA8ETqqBlJ+lWacP3R1P9fT+SCG2Qp##&Hy9a5B2hYJw+5dnliXy*xUXP9)yZzVSc$r(NkIE&j4ROPe#bO4M&Kf7OwUsL5gTvKM7QpZx!UFZvZR67-9$tiE3jJF#lEAqCYH7Qc#gONJ*3rpt(6jOB%oix6EDAr93h8nRbmof(Kd%dYZvDDyNI92-sPpRmyMmXJbMud&ueYen6HaXX8FIUEXpo7DumRN!sK*AGSA%wPjPH+1O9$EODQOHSH0cArziyjXPufNp+RS+aTlzJBpM3fSoRAdqIBKEZ7#QcqSTT8vwnVLXk%7aN$vVR0z1!t&%5$uv6YX#LzU(uI-%Zk5FrrhtcpLZMkMO5lIy!Jxa+4sIlXhPG2ItNjOGyC#1RpvEmezu3CqbTxZdcA6-wLk6pZHR46cpoffPfn!Wt7lv&eOW+YjqRGx+sed7sXel+r$LlR%goPr$Tfzwl6rQOuo!wytKIR1lnpYWUzmhc9doHvZ0lM9t4SZmr5BZ*C(P%C3Yp0h3t*eMffcP(4BR17q$GBjq2Z+ajfXDCYl75HlU5yvpNMkf44ML441TF+4Hzy2(%FyGP*CxQfUCuG*CXe8+gjDxx)8oVsSnwUITOe!DYu)vLddbcq3zDRqfPmt0Iw4sx1xiP+M8&$BguxHNr9-QvnxAgYaaq3(#XZ6L$qKn(924WTiSKv-icY4FE+5O+lQsY#mCMPC$iF59AI$TL+lWHi70d2YEpZ*H-H6h#$&+HHe-UT+v+EG)SYT8-3)axx&0&YFfDba#kQEbGC)hcTfle370m#+)gdk&*%3(lc%CKmDmOQZYJ2JOviTuzB$u62r#%(sMfwULzUS)!I8TEp#fO#v$y&gDu5q3!p7dd%*YeGHUQ0jH#+EBVp&LSB(9O!Ibb97Zu7uv#cAuB9)$aR)sGmXLP04d9x6JkzAx5!-IyBFYr6)eCuiyASMMn$7%Nu)ti7hc)YTO4rh-SJY6uqSmj34RBW2J0$MrYC(kiMr3p$DWqtek3sxqSQEKsfYBXnIdIDs%)KtjwIskXH$+fW40vqREqzP-jci9ox6VmRrZCO768