DB52∕T 1114-2016 貴州省昆明裂腹魚種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)

2016-04-01發(fā)布2016-10-01實施貴州省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I I 1 13術(shù)語與定義 1 1 1 4 4附錄A(規(guī)范性附錄)檢測方法與同工酶各種試劑的配制 8附錄B(規(guī)范性附錄)染色體各種試劑的配制 ·························本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由畢節(jié)市畜牧水產(chǎn)局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：畢節(jié)市水產(chǎn)技術(shù)推廣站、貴州省水產(chǎn)技術(shù)推廣站、畢節(jié)市鑫有農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)有限責(zé)任公司、貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：詹會祥、晏宏、周禮敬、安苗、劉朝琴、王朝榮、楊林、劉桂蘭、周訓(xùn)才。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A和附錄B為規(guī)范性附錄。11范圍本標(biāo)準(zhǔn)給出了昆明裂腹魚(SchizothoraxschizothoraxgrahamiRegan,1904)的術(shù)語與定義、符下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T18654.1養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢測第1部分：檢測規(guī)則GB/T18654.2養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢測第GB/T18654.12養(yǎng)殖魚類種質(zhì)檢測第12部3術(shù)語與定義昆明裂腹魚Schizothorax(schizothorax)grahami(Regan),1904地方名：細(xì)鱗魚腹鰭均呈青灰或淺黃色，尾鰭呈淺紅色；屬于冷水性底層魚類，a)D.iii-8:指昆明裂腹魚背鰭的不分枝鰭條3條和8條軟條；b)A.iii-5:指昆明裂腹魚臀鰭的不分枝鰭條3條和5條軟條；c)P.i-18~20:指昆明裂腹魚胸鰭的不分枝鰭條1條和18~20軟條；d)V.i-9~10:指昆明裂腹魚腹鰭的不分枝鰭條1條和9~10軟條；e)Tris:指一種溶于乙醇和水的白色結(jié)晶或粉末，中文名為三羥甲基氨基甲烷；g)AP:指一種用于氧化劑和漂白劑的過氧化物，中文名為過硫酸銨。2隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、裂腹魚亞科(Schizothoracinae)、裂腹魚屬5.2.1外形5.2.1.4須部背鰭末根鰭條不分枝，其后緣每側(cè)具12枚~20枚細(xì)小鋸齒或僅為鋸齒5.2.1.7胸腹部5.2.1.8臀尾部3圖1昆明裂腹魚的外形圖5.2.2可數(shù)性狀按照GB/T18654.1和GB/T18654.3的規(guī)定執(zhí)行，獲得以下結(jié)果：——背鰭鰭式：D.iii-8;——側(cè)線鱗：——第一鰓弓鰓耙數(shù)：外側(cè)17~20,內(nèi)側(cè)20~25。5.2.3可量性狀按照GB/T18654.1和GB/T18654.3的規(guī)定執(zhí)行，獲得體長17.0cm~31.0cm,體重101.0g~510.0g的個體實測性狀比值見表1。表1實測可量性狀比例值5.3內(nèi)部構(gòu)造鰾2室，其后室為前室長的2.0倍~2.5倍。5.3.2脊椎骨脊椎骨總數(shù)為48。5.3.3下咽骨4下咽骨狹窄，呈弧形，其長度為寬度的3.8倍~5.0倍。5.3.4下咽齒下咽齒3行，2.3.5~5.3.2;細(xì)圓，頂端尖而稍鉤曲，咀嚼面凹入呈匙狀；內(nèi)行第一枚齒細(xì)小。腹膜黑色。腸管長為體長的1.9倍~3.2倍。6生長與繁殖按照GB/T18654.2的規(guī)定執(zhí)行，獲得不同年齡組魚的全長與體重實測值見表2。表2昆明裂腹魚全長與體重實測值年齡/齡6.2.1性成熟年齡：雄魚3齡，雌魚4齡；最佳繁殖年齡：雄魚4齡~8齡，雌魚5齡~9齡。6.2.2產(chǎn)卵類型：沉性卵。6.2.4懷卵量：不同齡性成熟個體的懷卵量見表3。表3昆明裂腹魚個體懷卵量567相對懷卵量(粒/g體重)7遺傳學(xué)特性7.1生化遺傳特性7.1.1乳酸脫氫酶(LDH)圖譜昆明裂腹魚尾鰭和性腺組織中乳酸脫氫酶(LDH)同工酶電泳圖譜見圖2,呈典型5條酶帶。5+性腺昆明裂腹魚肌肉組織中蘋果酸脫氫酶(MDH)同工酶電泳圖譜見圖3。分為移動速度較快的細(xì)胞質(zhì)型++6SF二°EST-8體細(xì)胞染色體數(shù)：2n=132,臂數(shù)(NF):196,圖6昆明裂腹魚的染色體核型7.3隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)分子遺傳特性大小為200bp~1600bp。引物P04擴(kuò)增昆明裂腹魚種群的電泳圖譜(見圖7)。20條引物在昆明裂腹魚中檢測到的總位點數(shù)為121個，多態(tài)位點數(shù)為57個，多態(tài)頻率為47.11%(見表4)。7=引物編碼序列(5'-3')735242646283537342537362562516352855364合計(Total)47.11%見(表5)。8A.1.1年齡鑒定A.1.1.1材料A.1.1.2操作步驟b)用40nm~60nm細(xì)度磨石或700#粒度金相砂紙兩面磨制平面(鏡檢可清晰見到輪紋)清洗，中c)在解剖鏡下觀察年齡，確定魚的年齡。A.1.2繁殖力測定在繁殖季節(jié)，取出性成熟雌魚卵巢(IV),稱重后，在前、中、后部各稱取1.0g卵巢組織，用10%甲卵量；單位體重(g)所含的卵粒數(shù)為相對懷卵量。A.1.3同工酶分析——主要儀器：FA1004型號的電子天平(上海良平儀器儀表有限公司，精度為0.1mg)、型電泳槽(北京市六一儀器廠生產(chǎn))、凝膠成像系統(tǒng)(SYNGNE);B-醋酸萘酯、固牢藍(lán)RR鹽。A.1.3.2樣品制備各1g~2g,隨后快速分裝并投入液氮中，帶回實驗室置于——稱取約0.3g組織于勻漿器內(nèi)，加入預(yù)冷PBS緩沖液(0.1M,pH=7.0),在冰浴上研磨提取粗液。肝臟和性腺按1:4加入緩沖液，肌肉和尾鰭則按1:3加入緩沖液；——研磨液在10000rppm,4℃下冷凍離心。肌肉和尾鰭各離心2次，第1次離心時間為20min,第2次為30min;肝臟和性腺離心3次，第1次離心時間為20min,第2次為30min,第3次為10min。上清液按1:1比例加20%蔗糖溶液分裝?；旌暇鶆蚝蟊４嬗?20℃冰箱中供分析用。9——采用高pH不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳法。ADH和EST所用分離膠濃度為7.5%(pH=8.9),另2種酶為5%。濃縮膠濃度都為3%(pH=6.7)。電極緩沖液為Tris-甘氨酸(0.1M,pH=8.3);——初始電壓為100V,待溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入濃縮膠后將電泳槽置于4℃冰箱中。指示劑進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)到220V,繼續(xù)電泳，待指示劑距分離膠底部1cm時停止電泳，全過程4h~5h;——電泳結(jié)束后，放入預(yù)先配好并在37℃恒溫箱中保溫的同工酶染色液中染色(溶液配方標(biāo)準(zhǔn)見附錄A)。倒出染色液，用蒸餾水沖洗凝膠2~3次，加入5%的冰乙酸固定。隨后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照保存圖片。同工酶的縮寫、基因座位和等位基因命名采用Shaklee等(1967)所推薦的標(biāo)準(zhǔn)。酶的編號以向陽極泳動最快的編為1號，依順序編為2,3,4,…。最后將凝膠A.1.4染色體檢測A.1.5分子遺傳特性檢測A.1.5.1儀器和試劑PCR儀(TECHNETC-512)、紫外分光光度計-752型(上海菁華科技儀器有限公司)、DNA聚合酶、2×ReactionMix(天根生化科技〈北京〉有限公司)、引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、250bpDNALadderMarker、DNA提取純化試劑盒DV811(寶生物工程〈大連>有限公司),其它藥品和試劑均A.1.5.2樣品采集取活魚背部肌肉2g~5g,用料塑袋封裝后迅速投入液氮保存待用。圖A.1昆明裂腹魚肌肉組織提取的基因組DNA電泳檢測圖循環(huán)，每個循環(huán)為94℃變性60s,37.1℃復(fù)性60s,72℃延伸90s,首次循環(huán)前94℃預(yù)變性5min,最后一瓊脂糖凝膠(稱取0.56克瓊脂糖放入40ml10×TBE緩沖液中，用電爐加熱充分溶解均勻得到)進(jìn)行電泳，4500bp,共8條帶)作為分子量標(biāo)記。凝膠用EB(溴化乙錠)染色后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)成像，然后進(jìn)行統(tǒng)A.2.1凝膠制備溶液配制丙烯酰胺單分離膠緩沖18.16gTris溶解在60ml雙蒸水中，用1N的鹽酸調(diào)pH至8.9,再用雙蒸水稀釋至100ml,在4℃保存?zhèn)溆?。濃縮膠緩沖3.03gTris溶解在60ml雙蒸水中，用1N的鹽酸調(diào)pH至6.8,再用雙蒸水稀釋至100ml,在4℃保存?zhèn)溆谩ｋ姌O緩沖液稱0.6gTris和2.88g甘氨酸溶于雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH至8.3,定容到名稱分離膠系統(tǒng)(5%)分離膠系統(tǒng)(7.5%)用量(ml)用量(ml)加雙蒸水到100ml加雙蒸水到100ml濃縮膠系統(tǒng)(3%)名稱用量(ml)加雙蒸水到100ml加水到100ml酶名稱染色配方酯酶(EST)藍(lán)。乳酸脫氫酶(LDH)1MDL-乳酸鈉溶液(pH7.0)10ml,0.1MNaCl溶液5ml,0.5MTris-HCl(pH7.4)15ml,NAD+50mg,NBT30mg,PMS2mg加雙蒸水至蘋果酸脫氫酶(MDH)PMS(1%)10.5mg,1M蘋果酸鈉溶液(pH7.0),加入雙蒸水至100ml。乙醇脫氫酶(ADH)0.2MTris-HCl(p