DB32T-水稻鎘穩(wěn)定低積累品種篩選和鑒定技術(shù)規(guī)范

STYLEREF標(biāo)準(zhǔn)文件_文件編號(hào)DB32/TXXXX—2024DB32/TXXXX-2024ICS65.020.20CCSB05江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布32江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/TXXXX——2024水稻鎘穩(wěn)定低積累品種篩選和鑒定技術(shù)規(guī)范Technicalspecificationsforscreeningandidentificationofricecultivarswithstablelowcadmiumaccumulation（征求意見(jiàn)稿）2024–XX–XX發(fā)布 2024–XX–XX實(shí)施前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省農(nóng)業(yè)農(nóng)業(yè)村廳提出、歸口并組織實(shí)施。本文件起草單位：江蘇省耕地質(zhì)量與農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)站、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所、江蘇省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)監(jiān)控有限公司、久田環(huán)境科技南京有限公司。本文件主要起草人：汪鵬、唐仲、姜海波、駱永明、趙方杰、董歌、鄭順安、杜兆林、李真、邱丹、何振艷、陳彩艷、邱一格、范玉健、張明超、梁曉輝。水稻鎘穩(wěn)定低積累品種篩選和鑒定技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了水稻鎘穩(wěn)定低積累品種篩選和鑒定的技術(shù)步驟和要求。本文件適用于江蘇省主栽水稻品種中鎘低積累水稻品種的篩選與鑒定工作，可為其他地區(qū)類似工作提供參考。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB2762食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量GB5084農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB5009.15食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鎘的測(cè)定GB15618土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)NY/T674轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品檢測(cè)DNA提取和純化NY/T1300農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范水稻DB32∕T2853農(nóng)作物品種試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范水稻HJ1315土壤和沉積物19種金屬元素總量的測(cè)定電感耦合等離子體質(zhì)譜法DB32/T1124水稻品種田間試驗(yàn)記載規(guī)范DB43/T860雜交水稻種子真實(shí)性和純度鑒定SSR分子標(biāo)記法HNZ218水稻品種鎘積累特性大田驗(yàn)證試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程HNZ219水稻品種鎘積累特性多點(diǎn)篩選試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程術(shù)語(yǔ)和定義本標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)品種、對(duì)照品種、品種試驗(yàn)的相關(guān)定義按NY/T1300的規(guī)定執(zhí)行。試驗(yàn)設(shè)置試驗(yàn)組劃分、試驗(yàn)點(diǎn)選擇及試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)量的設(shè)置按NY/T1300的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。試驗(yàn)品種試驗(yàn)品種申請(qǐng)條件與要求試驗(yàn)品種的申請(qǐng)條件、申請(qǐng)材料、品種數(shù)量、種子質(zhì)量及試驗(yàn)時(shí)間按NY/T1300的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。試驗(yàn)品種應(yīng)為適宜當(dāng)?shù)胤N植且通過(guò)省部級(jí)（農(nóng)作物品種審定委員會(huì)）審定的水稻品種。對(duì)照品種選擇每組試驗(yàn)需設(shè)置3個(gè)對(duì)照品種：常規(guī)對(duì)照品種：按NY/T1300的規(guī)定選擇適合當(dāng)?shù)胤N植的主流水稻品種。鎘低積累對(duì)照品種：選用日本晴或中花11。鎘高積累對(duì)照品種：選用揚(yáng)稻6號(hào)。試驗(yàn)田選擇試驗(yàn)田基本條件試驗(yàn)田應(yīng)選擇當(dāng)?shù)卮硇缘牡咎?，滿足以下條件：? 肥力：土壤養(yǎng)分等級(jí)為中級(jí)及以上，土壤性質(zhì)和肥力均勻。? 排灌：方便可靠，田塊形狀規(guī)正、大小合適。? 土壤鎘含量：土壤總鎘含量應(yīng)低于GB15618《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定的管制值。試驗(yàn)點(diǎn)選擇? 試驗(yàn)點(diǎn)選擇：參照DB32∕T2853執(zhí)行，開(kāi)展多點(diǎn)篩選試驗(yàn)工作，設(shè)置7個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。? 土壤要求：試驗(yàn)田土壤（0-20cm）全鎘含量范圍為0.10－1.50㎎/㎏，且分布較均勻（三個(gè)重復(fù)土壤全鎘含量變幅≤10%，土壤pH值≤6.0的試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)不少于50%。? 灌溉條件：試驗(yàn)田需具備穩(wěn)定、清潔的灌溉水源，灌溉水符合GB5084要求。土壤樣品采集及制備? 采樣時(shí)間：試驗(yàn)移栽前30天。? 采樣方法：采用5點(diǎn)取樣法，從試驗(yàn)田5個(gè)不同位置采集土樣，采樣深度為0～20cm，每點(diǎn)采樣0.3kg，混合后總樣品量為1.5kg。? 檢測(cè)項(xiàng)目：土壤全鎘含量。? 檢測(cè)時(shí)間：在區(qū)域試驗(yàn)與生產(chǎn)試驗(yàn)期間。? 檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)：按照HJ1315標(biāo)準(zhǔn)中鎘含量測(cè)定方法執(zhí)行。? 檢測(cè)評(píng)價(jià)：對(duì)每塊試驗(yàn)田按照GB15618標(biāo)準(zhǔn)定性評(píng)價(jià)各田塊的土壤環(huán)境質(zhì)量等級(jí)。灌溉水樣品采集及制備? 采樣時(shí)間：在水稻孕穗期，從大田進(jìn)水口采集2500mL水樣。? 檢測(cè)項(xiàng)目：灌溉水中鎘含量。? 檢測(cè)時(shí)間：在區(qū)域試驗(yàn)與生產(chǎn)試驗(yàn)期間檢測(cè)。? 檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)：按照GB5084標(biāo)準(zhǔn)中推薦的測(cè)試方法和標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。? 檢測(cè)評(píng)價(jià)：對(duì)每塊試驗(yàn)田灌溉水樣品根據(jù)GB5084標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行灌溉水質(zhì)等級(jí)評(píng)價(jià)。田間設(shè)計(jì)品種篩選試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，具體要求如下：區(qū)組設(shè)置與重復(fù)次數(shù)? 區(qū)組設(shè)計(jì)為完全隨機(jī)排列，重復(fù)3～4次。? 每個(gè)品種種植5～6行，每行栽植6～8株。區(qū)組試驗(yàn)田塊要求? 區(qū)組試驗(yàn)應(yīng)安排在同一田塊內(nèi)進(jìn)行，確保試驗(yàn)條件一致性。? 區(qū)組排列方向需結(jié)合試驗(yàn)田實(shí)際情況，以利于水流方向和田間操作。保護(hù)行設(shè)置? 試驗(yàn)區(qū)域四周須設(shè)置保護(hù)行，保護(hù)行不少于5行，均種植對(duì)照品種。操作道設(shè)計(jì)? 區(qū)組之間及試驗(yàn)區(qū)與保護(hù)行之間應(yīng)設(shè)置操作道，寬度不超過(guò)40cm。田間布局參考? 田間區(qū)組及品種排列布局參照附錄A，其余設(shè)置按NY/T1300的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。栽培管理一般原則播種、移栽及相關(guān)操作按NY/T1300的規(guī)定執(zhí)行，確保試驗(yàn)過(guò)程的規(guī)范性。試驗(yàn)田準(zhǔn)備? 無(wú)論秧田還是本田，翻耕后需要反復(fù)耙勻、耙平至少3次，以保證試驗(yàn)田的平整性。? 控制小區(qū)間土壤鎘含量誤差最小，前茬稻樁需徹底分解后再翻耕1～2次。? 試驗(yàn)田須便于排水，確保管理操作的便捷性。肥水管理? 肥水管理參照HNZ219執(zhí)行，禁止使用鈣鎂磷肥、過(guò)磷酸鈣、石灰，以免影響試驗(yàn)結(jié)果。其他要求? 其他管理措施：按照當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)的常規(guī)習(xí)慣進(jìn)行，以保證試驗(yàn)的實(shí)際適應(yīng)性。? 田間記載項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)參照HNZ218水稻品種鎘積累特性大田驗(yàn)證試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程執(zhí)行檢驗(yàn)取樣水稻進(jìn)入黃熟期后，各品種種植小區(qū)采用5點(diǎn)取樣法進(jìn)行取樣。每個(gè)品種種植小區(qū)取10穴樣品、每穴采集2個(gè)主分蘗穗，將其混合形成一個(gè)籽粒樣品。每個(gè)品種種植小區(qū)采集5株以上水稻的幼嫩葉片，混合形成一個(gè)葉片樣，低溫保存?zhèn)溆?。糙米中鎘含量測(cè)定檢測(cè)參照GB5009.15執(zhí)行，分析并依據(jù)GB2762評(píng)價(jià)各品種的鎘積累特性，同時(shí)整理并列出數(shù)據(jù)表以供分析和比較。水稻品種的基因型鑒定樣品采集與DNA提?。嚎蓮牟煌酒贩N的任何生長(zhǎng)期及任何組織中采集樣品，提取品種基因組DNA，利用分子標(biāo)記鑒別基因型。DNA提取及純化方法參照NY/T674執(zhí)行。PCR擴(kuò)增：以不同水稻品種基因組DNA為模板，分別采用qGCd2、LCd-11、LCd-38和LCd-41分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物信息見(jiàn)附錄）。PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件按DB43/T860執(zhí)行。酶切處理：LCd-11、LCd-38和LCd-41分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切（見(jiàn)附錄C），酶切體系及反應(yīng)條件如下：PCR產(chǎn)物10μL，10XCutFastBuffer2μL，內(nèi)切酶1μL，ddH2O7μL；、37℃反應(yīng)15分鐘。電泳檢測(cè)：酶切產(chǎn)物及qGCd2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)方法參照DB43/T860的規(guī)定執(zhí)行。基因型判定：通過(guò)電泳條帶的大小和位置判定高鎘基因型和低鎘基因型（見(jiàn)附錄B）。qGCd2：高鎘基因型PCR產(chǎn)物電泳條帶為183bp，低鎘基因型條帶為149bp；LCd-11：高鎘基因型酶切PCR產(chǎn)物電泳條帶為100bp，低鎘基因型條帶為75bp；LCd-38：高鎘基因型酶切PCR產(chǎn)物電泳條帶為112bp，低鎘基因型條帶為86bp；LCd-41：高鎘基因型酶切PCR產(chǎn)物電泳條帶為114bp，低鎘基因型條帶為86bp。水稻品種主要農(nóng)藝性狀測(cè)定水稻品種篩選田間試驗(yàn)的主要農(nóng)藝性狀及綜合評(píng)價(jià)參照DB32/T1124執(zhí)行。低鎘積累水稻品種判定根據(jù)不同水稻品種籽粒鎘含量和基因型鑒定結(jié)果，結(jié)合代表性穩(wěn)定低鎘積累特征的水稻品種（日本晴或中花11）的籽粒鎘含量，對(duì)低鎘積累品種進(jìn)行評(píng)定。低鎘積累品種評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：? 籽粒鎘含量：品種籽粒鎘含量不高于日本晴或中花11籽粒鎘含量值的20%。? 水稻品種基因型：4條分子標(biāo)記（qGCd2、LCd-11、LCd-38、LCd-41）的基因型均為低鎘基因型。符合上述條件的水稻品種評(píng)定為穩(wěn)定低鎘積累水稻品種。其他性狀指標(biāo)的評(píng)價(jià)參照NY/T1300的相關(guān)要求執(zhí)行。

附錄A（資料性）品種篩選試驗(yàn)田間區(qū)組設(shè)計(jì)及品種排列示意圖

附錄B（資料性）4種分子標(biāo)記鑒定高鎘和低鎘積累水稻品種基因型的差異附錄C（資料性）水稻籽粒鎘積累相關(guān)的分子標(biāo)記標(biāo)記引物染色體DNA序列起始位置專利號(hào)內(nèi)切酶qGCd2FCCCATTGATTAGTTCCCTGChr02CCCATTGATTAGTTCCCTGATTTTTCACATAAGCAAAATCTTCTTCCCTGACGAAGTTGACAATGTTGCTCATCTCCCTGTTGGGTTTTATTTGCCAGCTCCGAGAGAGGCTGCCTGTCATGGAGGACATATGCGGTTTTGTATAGTATAAGGTAATCAGATAAGGTCATTGCGGTATG31169114CN106967836BRCATACCGCAATGACCTTATCLCd-11FCTTCCGCATACCACTGAACTTGChr03CTTCCGCATACCACTGAACTTGTTTGTTTGTGTGGTGCTTTACAATGTAAGTGAAAGTGTTCTTACTGAATCTCATGATTCTAATCTGTTGATTTCCTTCAAAAATAACATTTTTTTCTGTGAATTTTGCAGGTGAATGCATTCCCTATCACTGTCATGTTTGGCATGTGTTCTATCTTCCTCTTCATGGCGGCAATCCTGCAGAGACGGCTAATGGTTGTTTCTGACCTACACAAATCATCGACAAGTATGCATCTTTCTTCATTACTCCACATATAAAAACTAAAATCGCTTTGCCAATCAATTTCTTTGATTCCTAACTGTTGGGGTTAACATTTTCTGCAGAAGCACAAGAGATGGWTGATGAAGATGAGCCACTGAATCCTTAAGG845677CN105671156BTaqIRCCTTAAGGATTCAGTGGCTCLCd-38FGTCACAAAGAAGAAATAATGGCChr10GTCACAAAGAAGAAATAATGGCACCATGGTAACTATGCAAGTGGTGAAAGTCTTCAACTGAAAAACCATTTGCTTTTGTTTTCCTTATGGTGCAGTATTCTAACCAAATCAAGAATCATATGTAGAGATTGCAGGGTATTTTATATTTTAATGAAACATTTCACAGGATAAGCATACAGATGCCTTCTCCAATACTGGCTTCAGACAAAAGCAAAGGATATCAGCTAAGACAGAATGATGATGTCATTGGCAGGCAGCAGGGAAGTGGTAAAAGCACCCACAYTGTGTAGGTAAGCATTCCATAAG20089673CN105543397BBsrDIRCTTATGGAATGCTTACCTACALCd-41FRGGCTCTCAACTCAAGTATTCATGACACTTCACATTCTCACAAACChr10GGCTCTCAACTCAAGTATTCATCCTTCTGAAATCTGATTTCTCTCTTTCCAATTACCAGTTTTTTTTTTTTTTACTTTCCTCCTGAATAATCTCACTGCTTTAAATTCCTGATATCTTATGATGAAACTGCAAAATGTAAATTCAGACACAGCACAAGGTCGAGATGGACAAGAGGGACGGCAAGTTTGGAC