DB32T-傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范 第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)VIP

Q/LB.□XXXXX-XXXX傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置技術(shù)規(guī)范第11部分：細(xì)菌類應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)范圍本文件規(guī)定了細(xì)菌類應(yīng)急檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室生物安全要求、準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制、常用顯微鏡檢查技術(shù)、分離培養(yǎng)、分子生物學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)和免疫學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)等。本文件適用于傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置中細(xì)菌類傳染病病原體的應(yīng)急檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS233病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則WS288肺結(jié)核診斷《人間傳染的病原微生物目錄（2023版）》國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。

致病菌pathogenicbacterium能引起人類疾病的細(xì)菌,統(tǒng)稱為致病菌或病原菌。

高通量測(cè)序high-throughputsequencing又稱“下一代”測(cè)序技術(shù)（"Next-generation"sequencingtechnology），一種大規(guī)模并行測(cè)序技術(shù)。該技術(shù)可在較短時(shí)間內(nèi)確定目標(biāo)區(qū)域中核苷酸的順序，用于細(xì)菌全基組或病原宏基因測(cè)序。實(shí)驗(yàn)室生物安全要求實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)GB19489和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的要求，配備不同類型傳染病感染的個(gè)人防護(hù)裝備，包括但不限于防護(hù)服、手套、外科口罩或醫(yī)用防護(hù)口罩、防護(hù)面屏、防護(hù)帽。防護(hù)服宜每隔4h更換一次。在發(fā)生意外暴露時(shí)，根據(jù)應(yīng)急處置預(yù)案采取必要措施。實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所、感染性標(biāo)本處置及消毒滅菌等應(yīng)符合WS233中的實(shí)驗(yàn)室生物安全管理要求。醫(yī)療廢物處置應(yīng)按照《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》規(guī)定執(zhí)行。準(zhǔn)備工作和質(zhì)量控制準(zhǔn)備工作根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇相應(yīng)的生物安全柜、移液器、漩渦震蕩儀、離心機(jī)等儀器和檢測(cè)試劑耗材。質(zhì)量控制每一批次反應(yīng)過程中應(yīng)至少設(shè)置一個(gè)陰性和陽性對(duì)照，必要時(shí)增加空白對(duì)照。常用顯微鏡檢查技術(shù)生理鹽水濕片鏡下檢測(cè)在玻片上滴加適量生理鹽水，將適量樣本與生理鹽水混合并涂抹均勻后，觀察中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞及其數(shù)量；觀察標(biāo)本中細(xì)菌動(dòng)力特征（用暗視野顯微鏡觀察）等。革蘭氏染色顯微鏡檢查直接在玻片上涂抹標(biāo)本，涂片應(yīng)薄且均勻。自然干燥或恒溫干燥器上干燥后，經(jīng)甲醇固定或火焰快速固定3次，革蘭染色，晾干后讀片。革蘭染色脫色時(shí)間因選用不同的脫色劑而異。使用革蘭氏染色儀染色，應(yīng)按照廠家操作說明書進(jìn)行?？顾崛旧@微鏡檢查抗酸染色鏡檢操作流程應(yīng)按照WS288執(zhí)行。熒光染色顯微鏡檢查熒光染色鏡檢步驟如下。染色：涂片經(jīng)火焰固定后，滴加金胺“O”染色劑蓋滿玻片，染色30min，流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水；脫色：涂膜上端外緣滴加脫色劑，蓋滿玻片，脫色3min或至無色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑；復(fù)染：加復(fù)染劑復(fù)染1min，瀝去復(fù)染液，流水自玻片一端輕洗，自然干燥后鏡檢；鏡檢：玻片涂膜面向上置于熒光或LED顯微鏡載物臺(tái)，并以卡尺固定后，以低倍鏡搜索發(fā)現(xiàn)疑為致病菌的熒光物質(zhì)，使用40×物鏡確認(rèn)。在暗背景下，目標(biāo)菌發(fā)出熒光，呈特征形態(tài)。其他特殊染色顯微鏡檢查細(xì)菌特殊結(jié)構(gòu)如芽孢、鞭毛、莢膜或其他細(xì)菌結(jié)構(gòu)如細(xì)胞壁、核質(zhì)、胞質(zhì)顆粒等，采用相應(yīng)的特殊染色法進(jìn)行顯微鏡檢查。包括且不限于細(xì)胞壁染色、鞭毛染色、莢膜染色、芽孢染色、異染顆粒染色。分離培養(yǎng)無菌部位標(biāo)本一般應(yīng)在患者使用抗生素之前采集無菌部位標(biāo)本如血液標(biāo)本直接接種血培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，陽性血培養(yǎng)物進(jìn)行固體培養(yǎng)基分離純化，并進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步鑒定，對(duì)血培養(yǎng)陰性的標(biāo)本盲傳一代。非無菌部位標(biāo)本非無菌部位標(biāo)本，通過直接培養(yǎng)或選擇性增菌培養(yǎng)的方式，針對(duì)不同細(xì)菌采用不同培養(yǎng)基和分離程序，得到細(xì)菌純培養(yǎng)物。分子生物學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)核酸提取試劑盒法提取核酸根據(jù)標(biāo)本類型選擇相應(yīng)商品化離心柱法或磁珠法基因組核酸提取試劑盒。選擇非人源性內(nèi)參時(shí)，待提取標(biāo)本中宜加入相應(yīng)的內(nèi)參模板。常溫一步法提取核酸根據(jù)標(biāo)本類型選擇相應(yīng)商品化的裂解試劑，將試劑加入標(biāo)本中，常溫裂解。煮沸法提取核酸標(biāo)本離心、重懸后使用煮沸法進(jìn)行簡(jiǎn)易模板制備：取1接種環(huán)（約2μL～5μL）擴(kuò)大培養(yǎng)物放入裝有500μL純水或TE的1.5mL離心管內(nèi)，混勻；100℃加熱10min；12,000rpm離心10min；吸取上清即為PCR模板。選擇非人源性內(nèi)參時(shí)，在待提取標(biāo)本中宜加入相應(yīng)的內(nèi)參模板。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)體系配制（引物、鏈置換型核酸合成酶、基質(zhì)、模板）后置于指定溫度下（60℃～65℃），經(jīng)一個(gè)步驟即可完成。具體參照相應(yīng)細(xì)菌核酸檢測(cè)試劑盒說明書。陰性對(duì)照、陽性對(duì)照結(jié)果成立時(shí)，可使用以下方法進(jìn)行結(jié)果判定：濁度檢測(cè)：肉眼觀察反應(yīng)管內(nèi)出現(xiàn)白色渾濁判定為陽性，未渾濁判為陰性；指示劑檢測(cè)：加入熒光等指示劑后，根據(jù)試劑盒說明書判定結(jié)果。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)反應(yīng)體系配制（PCR反應(yīng)液、酶、引物、探針及模板）及反應(yīng)程序設(shè)置（反應(yīng)溫度、循環(huán)數(shù)及熒光通道）應(yīng)參照相應(yīng)細(xì)菌核酸檢測(cè)試劑盒說明書。陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判斷：陰性顯示無Ct值、無S形擴(kuò)增曲線；陽性顯示Ct值小于或等于細(xì)菌核酸檢測(cè)試劑盒說明書規(guī)定值，且有S形擴(kuò)增曲線。數(shù)字PCR技術(shù)根據(jù)PCR儀器和試劑的要求制備反應(yīng)體系，將體系分配到微小分區(qū)或微滴中并封蓋，進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用熒光染料或探針監(jiān)測(cè)目標(biāo)核酸的擴(kuò)增，配套軟件統(tǒng)計(jì)分析各反應(yīng)中的陽性液滴數(shù)。當(dāng)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判斷，確定目標(biāo)核酸及其定量信息，包括標(biāo)本中每個(gè)熒光通道的濃度、精度、誤差，依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行結(jié)果判讀。微流體芯片檢測(cè)技術(shù)參照相應(yīng)的多病原檢測(cè)試劑盒（微流體芯片法）說明書。當(dāng)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、內(nèi)參（如有）結(jié)果成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判斷，查看各標(biāo)本擴(kuò)增曲線的形態(tài)及對(duì)應(yīng)的Ct值，對(duì)照試劑盒說明書規(guī)定值進(jìn)行判讀。確定各個(gè)病原體靶點(diǎn)陽性擴(kuò)增所對(duì)應(yīng)的標(biāo)本編號(hào)，報(bào)告該標(biāo)本為對(duì)應(yīng)病原體檢測(cè)項(xiàng)目陽性。高通量宏基因組測(cè)序測(cè)序時(shí)機(jī)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急檢測(cè)中，出現(xiàn)且不限于多病原核酸檢測(cè)陰性、分離培養(yǎng)陰性、免疫學(xué)檢測(cè)陰性等情況時(shí)，宜使用宏基因組測(cè)序。實(shí)驗(yàn)過程對(duì)符合要求的核酸進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等。具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序參照相應(yīng)測(cè)序平臺(tái)及試劑盒說明書，根據(jù)應(yīng)急檢測(cè)實(shí)際選擇是否執(zhí)行去宿主操作。數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)質(zhì)量控制數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求如下：標(biāo)本經(jīng)過高通量測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)，應(yīng)該在去除接頭、低質(zhì)量數(shù)據(jù)和宿主基因組序列后再進(jìn)行下一步分析。測(cè)序完成后，對(duì)Q20和Q30進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，標(biāo)本測(cè)序的堿基質(zhì)量應(yīng)同時(shí)符合：Q201）≥90%、Q302）≥85%。每個(gè)標(biāo)本的高質(zhì)量序列（Q20）數(shù)目應(yīng)大于2×107條，對(duì)于宿主含量較多而又未在核酸提取步驟進(jìn)行去宿主操作的標(biāo)本，數(shù)據(jù)量適當(dāng)增加到4×107～8×107條。測(cè)序數(shù)據(jù)中，堿基識(shí)別質(zhì)量值為20的堿基識(shí)別準(zhǔn)確率為99%，或錯(cuò)誤率為1%。測(cè)序數(shù)據(jù)中，堿基識(shí)別質(zhì)量值為30的堿基識(shí)別準(zhǔn)確率為99.9%，或錯(cuò)誤率為0.1%。物種注釋數(shù)據(jù)質(zhì)控后對(duì)標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋，宜選用得到廣泛認(rèn)可的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，包括但不限于FoodandDrugAdministrationdAtabaseforReferenceGrademicrObialSequences（FDA-ARGOS），WorldDataCentreforMicroorganisms（WDCM），GenomeTaxonomyDataBase（GTDB）等。除特殊方法外，對(duì)于已知物種，數(shù)據(jù)庫(kù)中序列相似度95%以上，覆蓋度90%以上。微生物豐度計(jì)算數(shù)據(jù)質(zhì)控后進(jìn)行物種相對(duì)豐度計(jì)算，并記錄計(jì)算方法或軟件。除特殊方法外，應(yīng)將高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到組裝好的參考基因集或合適的數(shù)據(jù)庫(kù)上，按相似度95%以上，覆蓋度90%以上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到基因水平上的相對(duì)豐度分布情況，再將注釋到同一物種和同一屬的分類水平的基因序列相對(duì)豐度進(jìn)行疊加，得到種水平和屬水平的相對(duì)豐度結(jié)果。結(jié)果判定結(jié)果判定規(guī)則如下：結(jié)合《人間傳染的病原微生物目錄》或其他相關(guān)的病原微生物目錄篩選出物種注釋中的致病菌和條件致病菌的信息，針對(duì)不同標(biāo)c本類型并結(jié)合檢出病原微生物的種類進(jìn)行解讀，確認(rèn)致病微生物時(shí)，應(yīng)區(qū)分無菌部位（血、無菌體液、組織、骨髓等）與正常有菌部位（如呼吸道、尿液、開放性傷口）。正常有菌部位應(yīng)綜合分析檢出細(xì)菌是否為導(dǎo)致感染的致病病原。對(duì)于條件致病菌3），應(yīng)綜合考慮臨床表現(xiàn)和物種豐度等信息謹(jǐn)慎進(jìn)行判斷。對(duì)于致病菌，當(dāng)種特異性序列數(shù)較低時(shí)（小于3條）一般不考慮為致病病原，但檢出菌為敏感度較低的菌株，如結(jié)核分支桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，布魯氏菌，諾卡菌等以及烈性傳染病的時(shí)候（包括鼠疫，炭疽等),應(yīng)結(jié)合臨床癥狀考慮感染可能，并使用分離培養(yǎng)、涂片染色或抗體檢測(cè)等手段予以確認(rèn)或排除。如果疑似暴發(fā)疫情標(biāo)本大部分都報(bào)告相應(yīng)序列且能夠排除標(biāo)本之間或環(huán)境污染時(shí)即可認(rèn)定其為此次疫情的致病菌。對(duì)于無菌部位檢出病原菌時(shí)，在排除標(biāo)本污染的情況下，高度懷疑其為致病菌。對(duì)于鑒定出可分離培養(yǎng)的病原菌，應(yīng)按相應(yīng)操作指南對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)。在一定條件下，原來不致病的細(xì)菌成為致病菌，稱為條件致病菌或機(jī)會(huì)致病菌。免疫學(xué)應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)膠體金檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本的類型、上樣體積及操作步驟參照相應(yīng)的試劑盒說明書。實(shí)驗(yàn)完成后按照試劑盒要求的時(shí)間觀察結(jié)果，當(dāng)檢測(cè)線和質(zhì)控線均為陽性結(jié)果時(shí)，判定對(duì)應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目陽性結(jié)果；當(dāng)質(zhì)控線為陽性結(jié)果，檢測(cè)線為陰性結(jié)果時(shí)，判定對(duì)應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目為陰性結(jié)果；當(dāng)質(zhì)控線為陰性結(jié)果時(shí)，判定結(jié)果為無效結(jié)果，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）參照說明依次加入抗原包被（如需要）、待檢標(biāo)本及對(duì)照、酶標(biāo)記物、底物、終止液，具體流程參照相應(yīng)細(xì)菌ELISA檢測(cè)試劑盒說明書。以空白對(duì)照調(diào)零，讀取酶標(biāo)儀器上各孔450nm和（或）492nm等波長(zhǎng)的OD值，參照說明書要求設(shè)置參比波長(zhǎng)并計(jì)算陽性值，判定結(jié)果?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)參照說明依次加入磁性顆?？乖?、待檢及對(duì)照血清、堿性磷酸酶標(biāo)記的蛋白、底物、堿性磷酸酶催化底物液發(fā)光，具體流程參照相應(yīng)細(xì)菌化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒說明書。根據(jù)化學(xué)發(fā)光試劑盒的生物參考區(qū)間判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每一批次化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)做質(zhì)控品，質(zhì)控品結(jié)果成立時(shí)，進(jìn)行結(jié)果判定。凝集試驗(yàn)包括玻片凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、乳環(huán)凝集試驗(yàn)等，通過已知抗體或抗原成份，與相應(yīng)的菌體抗原或抗體結(jié)合產(chǎn)生肉眼可見凝集反應(yīng)。按照試劑盒要求的時(shí)間觀察結(jié)果，出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)判為陽性；液體均勻混濁、未見到凝集反應(yīng)判為陰性4）。布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)抗體滴度為1:100++及以上，或者