《犬胎兒三毛滴蟲(chóng)和五毛滴蟲(chóng)雙重實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)方法》

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團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/CVMAXXXXX—XXXX

犬胎兒三毛滴蟲(chóng)和五毛滴蟲(chóng)雙重實(shí)時(shí)熒光

PCR檢測(cè)方法

Real-timePCRassayfordetectionofTritrichomonasfoetusandPentatrichomonas

hominisindogs.

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在提交反饋意見(jiàn)時(shí)，請(qǐng)將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

犬胎兒三毛滴蟲(chóng)和五毛滴蟲(chóng)雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法

1范圍

本文件規(guī)定了犬胎兒三毛滴蟲(chóng)和五毛滴蟲(chóng)雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的試劑、儀器和耗材、操作

步驟、結(jié)果判定、實(shí)驗(yàn)室生物安全等技術(shù)要求。

本文件適用于糞便中的犬胎兒三毛滴蟲(chóng)和五毛滴蟲(chóng)核酸的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4試劑

4.1DNA提取試劑

DNA提取試劑采用現(xiàn)成的病毒核酸提取試劑條，或選取商品化的病毒DNA提取試劑盒并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)

行DNA提取。

4.2已滅菌1×PBS緩沖液

4.3引物探針

4.3.1采用針對(duì)犬胎兒三毛滴蟲(chóng)和五毛滴蟲(chóng)的引物及探針：

上游引物TF-F：5'-GAACGTTGCAAATGCGATAAGC-3'

下游引物TF-R：5'-AACATATATGCGTTCTAGCAAGCT-3'

熒光探針TF-Probe：5'-ATCTTTGAATGCACATTGCGCC-3'

上游引物PH-F：5'-GGTGGTGCAATCGTGGCTTGA-3'

下游引物PH-R：5'-CATAGAACGGAACGTTAGGTA-3'

熒光探針PH-Probe：5'-TCAGCTAATCCGTTAGATTCCGGCCAA-3'

4.3.2使用國(guó)家農(nóng)業(yè)行政主管部門(mén)批準(zhǔn)的其他引物、探針，應(yīng)對(duì)檢測(cè)程序和判定標(biāo)準(zhǔn)作相應(yīng)調(diào)整。

4.4陰性及陽(yáng)性對(duì)照

陰性及陽(yáng)性對(duì)照的制備方法見(jiàn)附錄A。

4.5其他試劑

?次氯酸消毒液、2XTaqManFastqPCR預(yù)混液、無(wú)菌無(wú)核酸酶水、1xPBS。

5儀器和耗材

1

分析天平（感量0.1mg）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最高離心速度不低于12000r/min）、冰盒、實(shí)時(shí)

熒光PCR儀及配套反應(yīng)管（板）、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2μL，20μL，200μL，1000μL）、1.5mL

離心管（無(wú)核酸酶）、自動(dòng)化核酸提取機(jī)。

6操作步驟

6.1樣品采集及運(yùn)輸

樣品采集及運(yùn)輸按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行，采集犬糞便用于檢測(cè)，樣品應(yīng)在冷藏條件下盡快運(yùn)輸至

實(shí)驗(yàn)室，避免反復(fù)凍融。采樣時(shí)應(yīng)穿戴個(gè)人生物安全防護(hù)裝備，實(shí)施現(xiàn)場(chǎng)消毒和廢棄物處理。

6.2樣品處理

檢測(cè)前樣品應(yīng)在二級(jí)生物安全柜中處理。糞便寄生蟲(chóng)：用無(wú)菌拭子蘸取糞便，插入到預(yù)先已加入

500~600μl滅菌1xPBS的無(wú)菌1.5ml離心管中并轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，讓PBS更充分的稀釋糞便后，將棉拭子抽

出。把裝有糞便渾濁液的離心管放入小型離心機(jī)中短暫離心，將渾濁液中的固體糞便顆粒離心到管底部

后，用移液槍將沉淀吸出，轉(zhuǎn)移到裝有研磨珠的研磨機(jī)專用離心管內(nèi)進(jìn)行震蕩破碎，最后取400μl破碎

完成的糞便沉淀液加入采樣管中即可。

6.3樣品保存

采集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；如需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-20℃冰箱，但應(yīng)

避免反復(fù)凍融（凍融不超過(guò)3次）。

6.4寄生蟲(chóng)DNA提取

6.4.1DNA提取應(yīng)在樣本制備區(qū)內(nèi)采用以下方法進(jìn)行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照

試劑說(shuō)明書(shū)操作。

6.4.2在已經(jīng)取好樣本的采樣管中分別加入20μl蛋白酶K和10μlCarrierRNA，期間每次加樣都

用相應(yīng)規(guī)格的移液槍進(jìn)行反復(fù)混勻，按順序分別在自動(dòng)核酸提取機(jī)的版塊上放入采樣管、移液槍頭、已

標(biāo)記樣本姓名、提取日期、樣本類型的核酸收集管后啟動(dòng)程序等待提取完畢即可。*組織類樣本試劑條

的使用與以上稍有不同，具體按廠家提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理。

6.5實(shí)時(shí)熒光PCR操作

6.5.1在反應(yīng)混合物配制區(qū)、樣品制備區(qū)和檢測(cè)區(qū)分別進(jìn)行6.5.2～6.5.4。

6.5.2每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)體系需使用20μL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液。按照八聯(lián)排每孔12.5μl的2XTaqMan

FastqPCR預(yù)混液，0.5μl的上游引物和下游引物和熒光探針Probe，6μl未開(kāi)封無(wú)菌水的量配置，

配置量計(jì)算公式：（樣本數(shù)+陰性對(duì)照孔1組+陽(yáng)性質(zhì)控孔1組）*2+1~10以內(nèi)的額外損耗數(shù)。

6.5.3充分混勻后分裝，每個(gè)PCR八聯(lián)排反應(yīng)管20μL。轉(zhuǎn)移PCR反應(yīng)管至PCR加樣區(qū)。

6.5.4在上述5.6.2的反應(yīng)管中分別加入5.5中RT的DNA溶液5μL，使每管總體積達(dá)到25μL，

記錄反應(yīng)管對(duì)應(yīng)的樣品名稱。蓋緊管蓋后，瞬時(shí)離心。

6.5.5將5.6.3加樣后的反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀內(nèi)，記錄反應(yīng)管擺放順序。選定5-羧基熒

光素（FAM）作為報(bào)告基團(tuán)，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：預(yù)變性94℃/3min；94℃/5s，60℃/30s，40個(gè)

循環(huán)；在每次循環(huán)的60℃退火延伸時(shí)收集熒光。試驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)收集的Ct值和熒光曲線判定結(jié)果。

7結(jié)果判定

7.1結(jié)果分析條件設(shè)定

2

實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)閾值設(shè)定原則：閾值線超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且相交于陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增

曲線進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期的拐點(diǎn)，或根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整。每個(gè)樣品反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的

域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值。

7.2結(jié)果描述及判定

當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤28.0且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)Ct值無(wú)擴(kuò)增曲線時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立。當(dāng)被

檢樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線且Ct值≤35.0時(shí)，判為犬胎兒三毛滴蟲(chóng)/犬五毛滴蟲(chóng)核酸陽(yáng)性；被檢樣品

無(wú)Ct值，判為犬胎兒三毛滴蟲(chóng)/犬五毛滴蟲(chóng)核酸陰性；對(duì)于Ct值＞35.0的樣品且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲

線，應(yīng)重檢，重檢仍出現(xiàn)上述結(jié)果的判為弱陽(yáng)性，否則判為陰性。

8實(shí)驗(yàn)室生物安全要求

8.1使用過(guò)的實(shí)驗(yàn)器材和液體廢棄物應(yīng)先經(jīng)過(guò)次氯酸消毒液噴灑靜置擦拭處理，再經(jīng)高溫高壓處理后

廢棄剩余樣品。等固體廢棄物應(yīng)在生物安全柜中密封包裝，經(jīng)表面消毒后移出，再經(jīng)高溫高壓處理后廢

棄。

3

A

A

附錄A

（規(guī)范性）

犬胎兒三毛滴蟲(chóng)/犬五毛滴蟲(chóng)陽(yáng)性及陰性對(duì)照

A.1陽(yáng)性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照制備方法：人工合成犬胎兒三毛滴蟲(chóng)和犬五毛滴蟲(chóng)基因片段，將基因連接于pUC57-KAN

載體制成陽(yáng)性質(zhì)粒。

A.2陰性對(duì)照

陰性對(duì)照為無(wú)菌水。

4

B

B

附錄B

（規(guī)范性）

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液配方

組分1個(gè)檢測(cè)體系的加入量

2XTaqManFastqPCR預(yù)混液12.5μL

上游引物1（10μmol/L）0.5μL

下游引物1（10μmol/L）0.5μL

熒光探針1（10μmol/L）0.5μL

上游引物2（10μmol/L）0.5μL

下游引物2（10μmol/L）0.5μL

熒光探針2（10μmol/L）0.5μL

去離子水

4.5μL

總體積