DB33T 2254-2020 豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒 雙重?zé)晒舛?RT-PCR 檢測方法　　

DB33porcineepidemicdiazhangchenrrheavirusand浙江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。1豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法的材料準(zhǔn)備、樣品采集、核酸提取、熒光定量RT-PCR檢測及本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的核GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaliPEDV：豬流行性腹瀉病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirRNA：核糖核酸（RibonucleicRT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscriptionPolymerTGEV：豬傳染性胃腸炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVir4試劑和材料水配制中所使用的水應(yīng)符合GB/T6682-2008分4.2Trizol：RNA抽提試劑，2℃~8℃保存。4.3氯仿：2℃~8℃預(yù)冷。4.4異丙醇：2℃~8℃預(yù)冷。4.575%乙醇：用新開啟的無水乙醇和DEPC水配制，2℃~8℃預(yù)冷。4.70.01mol/LPBS，pH7.2：配制方法見附24.11陽性對照：豬流行性腹瀉和豬傳染性5器材和設(shè)備5.2高壓滅菌鍋。5.6微量移液器。采樣及樣品前處理過程中應(yīng)無菌操作，防止樣本交叉污3采集的樣品密封后，采用保溫容器加冰袋或干冰，樣品在2℃~8℃條件下保存不應(yīng)超過24h；若需長期保存，應(yīng)放置于-80℃冰箱中，且應(yīng)避免反復(fù)可采用核酸提取試劑盒或全自動(dòng)核酸抽提儀及配套核酸提取試劑進(jìn)行49.3熒光RT-PCR擴(kuò)增9.4熒光通道的設(shè)定PEDVReportDye設(shè)定為FAM，Q閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過陽性對照品“5HEX通道均無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線。陽性若被檢樣品FAM通道無Ct值，且無典型的擴(kuò)增曲線，判為PEDV核酸陰性；若被檢樣品FAM通道Ct值>36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，建議對該樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Ct值≤38.0且出若被檢樣品HEX通道無Ct值，且無典型的擴(kuò)增曲線，判為TGEV核>36.0，且出現(xiàn)典型“S”型擴(kuò)增曲線，宜對該樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Ct值≤38.0且出現(xiàn)6A.10.01mol/LPBS（pH7.2）的配制稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O)3.0g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2g，氯化鉀（KCl） A.2DEPC水的配制一級水中加入0