《土壤中銅、鉛、鎘的快速測(cè)定 酶聯(lián)免疫法》

ICS13.080.99

CCSZ18

T/GDKJ

廣東省科技成果轉(zhuǎn)化促進(jìn)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/GDKJXXXX—2023

土壤中銅、鉛、鎘的快速測(cè)定酶聯(lián)免疫法

Rapiddeterminationofcopper，lead，andcadmiuminsoil—enzymelinked

immunosorbentassay

（征求意見稿）

2023-XX-XX發(fā)布2023-XX-XX實(shí)施

廣東省科技成果轉(zhuǎn)化促進(jìn)會(huì)發(fā)布

T/GDKJXXXX—2023

土壤中銅、鉛、鎘的快速測(cè)定酶聯(lián)免疫法

1范圍

本文件規(guī)定了采?膠體金免疫層析試紙條快速測(cè)定土壤中銅、鉛、鎘含量的?法。

本文件適用于土壤中銅、鉛、鎘的快速測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室??規(guī)格和試驗(yàn)?法

HJ/T166土壤環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

HJ605土壤和沉積物揮發(fā)性有機(jī)物的測(cè)定吹掃捕集/氣相色譜-質(zhì)譜法

3術(shù)語和定義

HJ605界定的術(shù)語和定義適用于本文件。

4試驗(yàn)原理

利用二氧化鈦對(duì)土壤浸提液中的重金屬離子進(jìn)行吸附、解吸附操作，氨水調(diào)節(jié)pH值，富集得到的重

金屬離子可通過免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，也即應(yīng)用膠體金試紙檢測(cè)二級(jí)以下的土壤中的重金屬離子。

膠體金免疫層析法試紙條結(jié)構(gòu)見圖1。當(dāng)T線和C線同時(shí)出現(xiàn)紅色帶時(shí)，若T線顏色較C線深或者顏色

相同，表示樣品中待檢物質(zhì)濃度低于檢測(cè)限，或不含待檢物質(zhì)，檢測(cè)結(jié)果為陰性；若T線顏色較C線淺或

T線未顯色，則表示樣品中待檢物質(zhì)濃度高于檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果為陽性；若C線未顯色，檢測(cè)結(jié)果無效，

可能是因?yàn)椴僮鬟^程不正確或試紙條已失效。

說明：

A——加樣孔；

S——檢測(cè)區(qū)

T——檢測(cè)線

C——質(zhì)控線

圖1膠體金免疫層析法試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

1

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5試劑和材料

除?另有說明，分析中僅使?符合GB/T6682規(guī)定的?級(jí)?。

5.1硝酸（HNO3）：優(yōu)級(jí)純。

4M的硝酸溶液：用超純水將26.88mL的濃硝酸稀釋到100mL；分別配制0.5M、1M、2M、3M的稀硝酸

溶液。

5.2鹽酸（HCL）：優(yōu)級(jí)純。

4M的鹽酸溶液：用超純水將33.12mL的濃鹽酸稀釋到100mL；分別配制0.5M、1M、2M、3M的稀鹽酸。

5.3硫酸：優(yōu)級(jí)純。

4M的硫酸溶液：用超純水將18mL的濃硫酸稀釋到100mL；分別配制0.5M、1M、2M、3M的稀硫酸溶

液。

5.4混合酸溶液。

按需要取各個(gè)濃度的稀鹽酸、稀硝酸、稀硫酸溶液分別按1：3、1：1、3：1的體積比兩兩混合。

5.5氯化鈉：分析純。

5.6EDTA·2Na：分析純。

0.1MEDTA·2Na：先配制0.15MPBST緩沖液，稱取氯化鈉8.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化鉀0.2g、磷酸

氫二鈉2.9g、Tween-200.5mL，加蒸餾水至1.0L；用超純水和氫氧化鈉配制1M的EDTA·2Na溶液，然后

用PBST緩沖液將其稀釋10倍。

5.7鎘離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：1000μg/mL。

5.8鉛離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：1000μg/mL。

5.9銅離子標(biāo)準(zhǔn)溶液：1000μg/mL。

5.10標(biāo)準(zhǔn)土壤：GBW07407(GSS-7)。

5.11二氧化鈦：銳鈦，5nm～10nm，純度99.8％。

二氧化鈦在使用前用5M的硝酸浸泡30min，然后于4000rpm下離心10min，去掉上清，用二次水進(jìn)行

洗滌，直至將上清液洗至中性，對(duì)沉淀物進(jìn)行抽濾，然后于100℃下烘干，研磨過篩后于避光干燥處保

存?zhèn)溆谩?/p>

5.12氨水：分析純

濃度為22%氨水溶液：用超純水和氨水配制。

5.13膠體金免疫層析試紙條，不同金屬離子試紙條不同。

市售有證膠體金免疫層析試紙條，也可以配制。

6儀器和設(shè)備

6.1樣品瓶：帶聚四氟乙烯-硅膠襯墊螺旋蓋的40mL棕色寬口玻璃瓶。

6.2采樣器：一次性塑料注射器或不銹鋼專用采樣器。

6.3離心機(jī)。

6.4高速離心機(jī)。

6.5超濾離心管。

6.6便攜式pH計(jì)。

6.7混合振蕩儀。

6.8便攜式pH計(jì)。

6.9膠體金讀數(shù)儀。

6.10微量移液器：10μl～200μl、100μl～1000μl。

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6.11一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

7樣品

7.1樣品采集

土壤樣品的采集參考HJ/T166的規(guī)定。采樣部位均為0.0cm～20.0cm的表層土壤，利用蛇形采樣

法進(jìn)行，將10個(gè)取樣點(diǎn)的土壤混合為一個(gè)土壤樣品，除去土樣中的石子和動(dòng)植物殘?bào)w，利用四分法取

1kg左右土壤于聚四氟乙烯密封袋中。將土壤樣品于90℃的鼓風(fēng)干燥箱中烘干，利用四分法取0.25kg

左右的土壤，用瑪瑙棒碾碎，過2mm尼龍篩，混勻，繼續(xù)研磨，過0.154mm(100目)檢驗(yàn)篩，于陰涼干

燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

7.2樣品保存

樣品采集后應(yīng)冷藏運(yùn)輸。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后應(yīng)盡快分析。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)樣品存放區(qū)域應(yīng)無有機(jī)物干擾，在4℃

以下保存時(shí)間為10d。

8試驗(yàn)步驟

8.1樣品處理

8.1.1鎘提取液

稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入5mL4M的鹽酸和15mL4M的硫酸，振蕩30s，

40℃下反應(yīng)20min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。

將鎘提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg

納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的EDTA·2Na溶液，振蕩15min，

靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液待用。

8.1.2鉛提取液

稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入10mL4M的鹽酸和10mL4M的硝酸，振蕩

30s，60℃下反應(yīng)50min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。

將鉛提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg

納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的EDTA·2Na溶液，振蕩15min，

靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液待用。

8.1.3銅提取液

稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入1mL4M的鹽酸和3mL4M的硫酸，振蕩30s，

80℃下反應(yīng)60min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。

將銅提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg

納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的EDTA·2Na溶液，振蕩15min，

靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液待用。

8.2試樣測(cè)試

8.2.1取出2℃～8℃保存的膠體金試紙條，并恢復(fù)至15℃～25℃。分別取8.1上清液80μL加入加樣

孔A中，水平放置8min～15min，觀察結(jié)果。

8.2.2膠體金免疫層析法試樣測(cè)試也可參考附錄A、附錄B試驗(yàn)方法。

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9結(jié)果判定

膠體金免疫層析法結(jié)果判定見圖2。當(dāng)T線和C線同時(shí)出現(xiàn)紅色帶時(shí)，若T線顏色較C線深或者顏色相

同，表示樣品中待檢物質(zhì)濃度低于檢測(cè)限，或不含待檢物質(zhì)，檢測(cè)結(jié)果為陰性；若T線顏色較C線淺或T

線未顯色，則表示樣品中待檢物質(zhì)濃度高于檢測(cè)限，檢測(cè)結(jié)果為陽性；若C線未顯色，檢測(cè)結(jié)果無效，

可能是因?yàn)椴僮鬟^程不正確或試紙條已失效。

圖2膠體金免疫層析法結(jié)果判定示意圖

10檢出限

以0.1M的EDTA·2Na溶液為溶劑，將1g/L重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋到150μg/L、300μg/L、600μg/L、

900μg/L、1200μg/L等濃度，充分混勻后取80μL用試紙條檢測(cè)，8min～15min內(nèi)立即讀值，觀察結(jié)果并拍

照，每個(gè)濃度重復(fù)5次，考察重金屬離子膠體金免疫層析試紙條的檢測(cè)限。

本文件定義膠體金免疫層析試紙條的定量下限：肉眼下能明顯區(qū)別檢測(cè)線（T）比控制線（C）顏色

淺，此時(shí)的濃度為試紙條的定量下限。

鎘離子：隨鎘離子濃度的增加，T線的顏色逐漸變淺，150μg/L時(shí)T線顏色明顯比C線顏色淺，6000μg/L

時(shí)T線完全消失，確定膠體金試紙條的檢出限為0.15mg/kg。

鉛離子：鉛離子膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)時(shí)間在15min內(nèi)，檢出限為0.041mg/kg，定量限為

097mg/kg。

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附錄A

(資料性)

鎘離子膠體金免疫層析試紙?jiān)囼?yàn)

A.1試劑和材料

A.1.1硝酸（HNO3）：優(yōu)級(jí)純。

A.1.2鹽酸（HCL）：優(yōu)級(jí)純。

A.1.3硫酸：優(yōu)級(jí)純。

A.1.4EDTA·2Na：分析純。

0.1MEDTA·2Na：先配制0.15MPBST緩沖液，稱取氯化鈉8.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化鉀0.2g、磷酸

氫二鈉2.9g、Tween-200.5mL，加蒸餾水至1.0L；用超純水和氫氧化鈉配制1M的EDTA·2Na溶液，然后

用PBST緩沖液將其稀釋10倍。

A.1.5二氧化鈦：銳鈦，5nm～10nm，純度99.8％。

A.1.6氨水：分析純

A.1.7鎘離子膠體金免疫層析試紙條。

A.2儀器和設(shè)備

A.2.1膠體金讀數(shù)儀(BMZ6000北京美正生物科技有限公司)。

A.2.2移液器：10μl～200μl。

A.2.3離心機(jī)：

A.2.4超濾離心管：

A.2.5便攜式pH計(jì)：

A.2.6混合振蕩儀：

A.2.7一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備

A.3測(cè)試步驟

B.3.1樣品處理

稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入5mL4M的鹽酸和15mL4M的硫酸，振蕩30s，

40℃下反應(yīng)20min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。

將鎘提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg

納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的EDTA·2Na溶液，振蕩15min，

靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液（待測(cè)樣品）待用。

B.3.2測(cè)試

將待測(cè)樣品滴于免疫層析試紙加樣孔中，由于毛細(xì)作用，液體向前移動(dòng)；到達(dá)T線時(shí)，待測(cè)樣品中

的Cd-EDTA與包被在T線上的Cd-ITCBE-BSA偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Cd單克隆抗體膠體金復(fù)合物。

當(dāng)測(cè)定有效進(jìn)行時(shí)，控制線(C線)總會(huì)顯示紅色；若不顯色，則測(cè)試無效。當(dāng)待測(cè)樣品中Cd-EDTA

質(zhì)量濃度小于最低檢測(cè)限濃度時(shí)，膠體金結(jié)合墊中的Cd單克隆抗體膠體金復(fù)合物與T線上Cd-ITCBE-BSA

及C線上羊抗鼠IgG大量結(jié)合，T線呈色與C線相近，結(jié)果為陰性；反之，則抗Cd單克隆抗體膠體金復(fù)合物

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基本上與檢測(cè)試樣中的Cd-EDTA結(jié)合，T線顏色將比C線淺或完全看不到顏色(樣品中Cd-EDTA質(zhì)量濃度越

高，T線顯色越淺)，結(jié)果為陽性。

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附錄B

(資料性)

鉛離子膠體金免疫層析試紙?jiān)囼?yàn)

B.1試劑和材料

B.1.1硝酸（HNO3）：優(yōu)級(jí)純。

B.1.2鹽酸（HCL）：優(yōu)級(jí)純。

B.1.3硫酸：優(yōu)級(jí)純。

B.1.4EDTA·2Na：分析純。

B.1.5二氧化鈦：銳鈦，5nm～10nm，純度99.8％。

B.1.6氨水：分析純

B.1.7鉛離子膠體金免疫層析試紙條。

B.2儀器和設(shè)備

B.2.1膠體金讀數(shù)儀(BMZ6000北京美正生物科技有限公司)。

B.2.2移液器：10μl～200μl。

B.2.3離心管。

B.2.4離心機(jī)。

B.2.5禍旋混合器。

B.2.6一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

B.3測(cè)試步驟

B.3.1樣品處理

稱取1.0000g±0.0005g土壤樣品于50mL離心管中，加入10mL4M的鹽酸和10mL4M的硝酸，振蕩

30s，60℃下反應(yīng)50min，然后于8000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，上清液待用。

將鉛提取液轉(zhuǎn)入50mL比色管中，用濃度25%氨水調(diào)節(jié)pH至8.5，并用超純水定容至刻度。加入50mg

納米TiO2，振蕩5min，靜置20min后于4000rpm下離心8min，加入1mL0.1M的EDTA·2Na溶液，振蕩15min，

靜置20min后于4000rpm下離心8min，取上清液待用。

B.3.2測(cè)試

a）在進(jìn)行檢測(cè)前先完整閱讀使用說明書，從原包裝中取出試劑桶，打開后取出所需數(shù)量的微孔試

劑和試紙條，并做好標(biāo)記，微孔試劑取出后，請(qǐng)立即蓋好試劑桶蓋；

b）使用前將試紙條微孔試劑和待檢樣品恢復(fù)至室溫25℃，將所需微孔試劑置于加熱器上的微孔中。

一次檢測(cè)樣品數(shù)量不要超過4個(gè)，如果一次檢測(cè)樣品數(shù)量超過4個(gè)，請(qǐng)按照4個(gè)一組，分批檢測(cè)；

c）用微量移液器移取200μL回溫后的樣品于微孔試中，緩慢抽吸至檢測(cè)樣品與微孔試劑充分混勻；

使用計(jì)時(shí)器，開始計(jì)時(shí)；

d）40℃條件下孵育5min；孵育結(jié)束后，停止時(shí)，從試劑桶中取出所需數(shù)量的試紙條并插入微孔試

劑中，使印有LOGO手柄端向上，另一端向下并充分浸入溶液中；再次按下計(jì)時(shí)器，開始第二次5min孵

育；