《蛋白表達純化》課件

蛋白表達純化本課程旨在介紹蛋白表達純化的基本原理和技術，幫助學生了解蛋白表達純化的流程和步驟，掌握常用方法和技巧。蛋白質及其重要性生命的基本構成蛋白質是生命體的重要組成部分，參與幾乎所有生命活動。結構與功能蛋白質具有多種多樣的結構和功能，如催化酶反應、運輸物質、免疫防御等。蛋白質結構層次1一級結構氨基酸序列2二級結構α螺旋和β折疊3三級結構空間三維結構4四級結構多個多肽鏈組裝蛋白質的主要功能催化酶是蛋白質，它催化生物體內(nèi)的化學反應。例如，消化酶分解食物，而合成酶制造新的分子。免疫抗體是一種蛋白質，它識別并中和外來物質，例如細菌和病毒?？贵w是免疫系統(tǒng)的重要組成部分。運輸運輸?shù)鞍淄ㄟ^細胞膜運輸物質，例如營養(yǎng)物質、氧氣和廢物。例如，血紅蛋白將氧氣從肺部運送到全身的細胞。蛋白質的表達和純化1蛋白質表達將目的基因導入合適的宿主細胞，并通過細胞的蛋白質合成系統(tǒng)表達目的蛋白。2蛋白質純化從宿主細胞中分離出目的蛋白，并去除其他雜質蛋白。3蛋白質鑒定確認所獲得的蛋白質是目標蛋白質，并評估其純度和活性。表達系統(tǒng)概述大腸桿菌酵母昆蟲細胞哺乳動物細胞大腸桿菌表達系統(tǒng)大腸桿菌表達系統(tǒng)是應用最廣泛的表達系統(tǒng)之一，具有以下優(yōu)點：培養(yǎng)成本低生長速度快遺傳背景清楚，操作方便可進行高密度培養(yǎng)，產(chǎn)量高酵母表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)是一種常用的蛋白質表達系統(tǒng)。酵母菌是真核生物，具有真核生物的翻譯后修飾機制，可以表達折疊正確、具有生物活性的蛋白質。酵母表達系統(tǒng)具有以下優(yōu)點：1.酵母菌生長迅速，培養(yǎng)成本低。2.酵母菌可以進行糖基化修飾，表達具有生物活性的蛋白質。3.酵母表達系統(tǒng)可以進行基因工程改造，提高蛋白質的表達水平。昆蟲細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)是一種常用的蛋白質表達系統(tǒng)，它具有以下優(yōu)點：可以表達真核蛋白質，包括復雜的蛋白質，并進行翻譯后修飾。能夠獲得高水平的蛋白質表達。易于操作和放大，適合工業(yè)化生產(chǎn)。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)以其能正確折疊和修飾蛋白質而聞名。這種系統(tǒng)適用于生產(chǎn)復雜藥物蛋白和疫苗。它可以提供人類蛋白質的正確翻譯后修飾，如糖基化，磷酸化和?；?，這些修飾對于蛋白質功能至關重要。蛋白質純化的工藝流程細胞裂解破壞細胞膜，釋放目標蛋白粗提去除細胞碎片和雜蛋白層析分離利用目標蛋白的物理化學性質進行分離純化濃縮和脫鹽提高蛋白濃度，去除鹽類等雜質純度和活性檢測確認目標蛋白的純度和生物活性蛋白質純化的關鍵步驟1蛋白質溶解和裂解將目標蛋白從細胞中釋放出來，并將其溶解在合適的緩沖液中。2蛋白質初步分離去除雜質蛋白，例如細胞碎片和核酸，以提高純度。3層析技術利用不同的分離原理，將目標蛋白從其他蛋白中分離出來。4蛋白質濃縮和脫鹽去除多余的緩沖液，并提高蛋白濃度。蛋白質溶解和裂解1細胞裂解通過物理或化學方法破壞細胞膜，釋放出目標蛋白。2溶解選擇合適的緩沖液，使目標蛋白溶解并保持活性。3去除細胞碎片通過離心或過濾等方法，去除細胞碎片和雜質。蛋白質初步分離1離心去除細胞碎片2鹽析利用蛋白質溶解度差異3熱處理去除熱不穩(wěn)定蛋白層析技術概述分離原理利用物質在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同進行分離。應用范圍廣在生物化學、醫(yī)藥、食品等領域有著廣泛的應用。種類多樣包括離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。離子交換層析原理利用蛋白質表面帶電荷的差異，將蛋白質吸附在帶相反電荷的離子交換樹脂上，然后通過改變緩沖液的離子強度或pH值，將蛋白質洗脫下來。分類陽離子交換層析陰離子交換層析應用離子交換層析廣泛用于蛋白質的純化，例如去除鹽類、雜蛋白和核酸等。親和層析利用靶蛋白與配體之間的特異性親和力進行分離。配體可為抗體、酶、受體、金屬離子等。通過洗脫步驟，分離目標蛋白。凝膠滲濾層析1分離原理根據(jù)蛋白質分子大小不同進行分離。2凝膠類型常用的凝膠包括Sephadex、Sepharose和Superdex等。3應用范圍適用于蛋白質脫鹽、純化和分子量測定。蛋白質濃縮和脫鹽濃縮濃縮是將目標蛋白溶液中的水分去除，提高蛋白濃度。脫鹽脫鹽是去除溶液中的鹽分，通常采用透析或凝膠過濾等方法。蛋白質的活性檢測酶活性檢測通過測定酶催化特定底物的轉化速率來評估酶的活性?？贵w活性檢測通過測定抗體與抗原結合的能力來評估抗體的活性。受體結合檢測通過測定受體與配體結合的能力來評估受體的活性。蛋白質的產(chǎn)量分析1產(chǎn)量根據(jù)實驗條件和蛋白表達水平，評估蛋白質的產(chǎn)量。2純度通過SDS或其他方法，評估蛋白質的純度。3活性通過酶活性或其他生物活性測定，評估蛋白質的活性。蛋白質純度分析常見的蛋白質純度分析方法包括SDS、HPLC和質譜。蛋白質的結構表征一級結構氨基酸序列，決定蛋白質的折疊方式和功能。二級結構局部結構，如α螺旋和β折疊，形成蛋白質的骨架。三級結構蛋白質的整體三維形狀，由二級結構之間的相互作用決定。四級結構多個蛋白質亞基組成的復雜結構，形成功能蛋白。蛋白質的功能鑒定酶活性測定通過檢測酶催化特定反應的速度或產(chǎn)物生成量來確定酶的功能?；蚯贸蜻^表達通過敲除或過表達目標基因，觀察對細胞或生物體功能的影響來推斷蛋白質的功能。蛋白質相互作用研究通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等方法研究蛋白質之間的相互作用來確定蛋白質的功能。蛋白質應用領域藥物蛋白的開發(fā)蛋白質藥物的開發(fā)是目前生物制藥領域的重要方向之一。利用蛋白質的生物活性，可以開發(fā)出針對特定疾病的藥物。疫苗蛋白的研發(fā)蛋白質疫苗的研發(fā)是預防疾病的重要手段。利用蛋白質抗原，可以刺激機體產(chǎn)生免疫應答，從而預防疾病的發(fā)生。工業(yè)酶的生產(chǎn)蛋白質酶在工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，例如在食品加工、洗滌劑、生物燃料等領域。藥物蛋白的開發(fā)治療性抗體針對特定疾病靶點的抗體，如腫瘤治療的單克隆抗體。激素和生長因子用于治療荷爾蒙失衡或促進生長發(fā)育的蛋白質，如胰島素和生長激素。酶催化特定生化反應的蛋白質，用于治療遺傳疾病或代謝紊亂。疫苗蛋白的研發(fā)1抗原蛋白疫苗蛋白通常是病原體的抗原蛋白，可以刺激機體產(chǎn)生特異性免疫反應。2免疫策略疫苗蛋白可以采用不同的免疫策略，例如滅活疫苗、亞單位疫苗、重組蛋白疫苗等。3安全性疫苗蛋白的研發(fā)需要嚴格的安全評估，確保其安全性和有效性。工業(yè)酶的生產(chǎn)酶催化反應工業(yè)酶通過催化特定化學反應，加速生產(chǎn)過程，提高效率。食品加工用于食品加工，例如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，用于提高產(chǎn)品質量，延長保質期。洗滌劑洗滌劑中使用的酶，例如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，可以有效地分解污漬?？偨Y與展望1技術進步