化學(xué)品 快速雄激素干擾活性報告試驗(yàn) 征求意見稿

2GB/TXXXXX—XXXX化學(xué)品快速雄激素干擾活性報告試驗(yàn)本文件規(guī)定了化學(xué)品快速雄激素干擾活性報告試驗(yàn)的術(shù)語、定義和縮略語、試驗(yàn)原理、受試物信息、參比物、儀器設(shè)備、方法概述、試驗(yàn)準(zhǔn)備、試驗(yàn)過程、試驗(yàn)的有效性、數(shù)據(jù)與報告。本文件適用于試驗(yàn)和評價受試物的雄激素干擾活性；用于測定受試物在含有spg1-gfp轉(zhuǎn)基因品系日本青鳉（Oryziaslatipes）胚胎中的熒光強(qiáng)度。本文件適用于不揮發(fā)或低揮發(fā)性、水溶性或非水溶性、能被精確測定的所有受試物。本文件不適用于易揮發(fā)的受試物。若用于試驗(yàn)混合物，UVCB（不明復(fù)雜物質(zhì)）或多組分物質(zhì)的試驗(yàn)，應(yīng)盡可能地對其成分進(jìn)行表征，例如，其成分的化學(xué)特性、定量情況和物質(zhì)特性。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。HJ1257-2022化學(xué)物質(zhì)環(huán)境管理化學(xué)物質(zhì)測試術(shù)語GB/T27850-2011化學(xué)品快速生物降解性通則GB/T21803-2008化學(xué)品快速生物降解性DOC消減試驗(yàn)GB/T21856-2008化學(xué)品快速生物降解性二氧化碳產(chǎn)生試驗(yàn)GB/T21802-2008化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的MITI試驗(yàn)(Ⅰ)GB/T21831-2008化學(xué)品快速生物降解性密閉瓶法試驗(yàn)GB/T21802-2008化學(xué)品快速生物降解性改進(jìn)的OECD篩選試驗(yàn)GB/T21801-2008化學(xué)品快速生物降解性呼吸計量法試驗(yàn)GB/T27861-2011化學(xué)品魚類急性毒性試驗(yàn)OECDNo.23困難物質(zhì)和混合物的水生毒性試驗(yàn)指南（GuidanceDocumentonAquaticToxicityTestingofDifficultSubstancesandMixtures）OECDNo.54生態(tài)毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析方法指導(dǎo)（CurrentApproachesintheStatisticalAnalysisofEcotoxicityData:AGuidancetoApplication）3術(shù)語、定義和縮略語3.1術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1.13GB/TXXXXX—XXXX效應(yīng)濃度XtheconcentrationgivinganeffectattheX%ofmaximumlevel(ECx）引起一組受試生物中的X%生物出現(xiàn)某觀察效應(yīng)的濃度。3.1.2游離胚胎eleutheroembryo胚胎孵化后的生命階段，但在胚胎能夠獨(dú)立進(jìn)食外源性食物供應(yīng)之前，是胚胎發(fā)育的階段。在本試驗(yàn)中定義為日本青鳉胚胎從第39期發(fā)育階段（孵化階段）到第42期發(fā)育階段（形成捕獲獵物所需的結(jié)構(gòu)，包括上頜的牙齒、耳石和所有鰭的形狀）的發(fā)育階段。3.1.3最低可觀察效應(yīng)濃度thelowestobservedeffectconcentration(LOEC)在給定試驗(yàn)周期內(nèi)，與對照組相比，在統(tǒng)計學(xué)意義上對受試生物產(chǎn)生顯著效應(yīng)（p<0.05）的最低受試物濃度。3.1.4最大耐受濃度maximumtoleranceconcentration(MTC)受試物引起小于10%死亡率的最高受試物濃度。3.1.5無可觀察效應(yīng)濃度noobservedeffectconcentration(NOEC)在給定試驗(yàn)周期內(nèi)，與對照組相比，在統(tǒng)計學(xué)意義上對受試生物未產(chǎn)生顯著效應(yīng)（p<0.05）的最高受試物濃度。3.1.6加標(biāo)模式spikedmode在額外添加AR激動劑（即濃度為3μg/L的17α-甲基-5α-二氫睪酮）的情況下進(jìn)行的快速雄激素干擾活性報告試驗(yàn)。3.1.7未加標(biāo)模式unspikedmode未額外添加AR激動劑（即濃度為3μg/L的17α-甲基-5α-二氫睪酮）的情況下進(jìn)行的快速雄激素干擾活性報告試驗(yàn)。3.2縮略語下列縮略語適用于本文件。RADARassay：快速雄激素干擾活性報告試驗(yàn)（RapidAndrogenDisruptionActivityReporterassay）GFP：綠色熒光蛋白（Greenfluorescentprotein）17MT：17α-甲基睪酮（17α-Methyltestosterone）11KT：11-酮睪酮（11-Ketotestosterone）mDHT：17α-甲基-5α-二氫睪酮（17α-Methyl-5α-dihydrotestosterone）4GB/TXXXXX—XXXXMS222:：甲磺酸三堿（Tricainemethanesulfonate）DMSO：二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide）dpf：受精后的天數(shù)（Daypostfertilisation）dph：孵化后的天數(shù)（Dayposthatch）AR：雄激素受體（Androgenreceptors）ER：雌激素受體（Estrogenreceptors）UVCB：不明復(fù)雜物質(zhì)（Substancesofunknownorvariablecomposition,complexreactionproductsorbiologicalmaterials）OECD：經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment）GD：經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織指導(dǎo)文件（OECDguidancedocument）4試驗(yàn)原理本試驗(yàn)方法利用攜帶spg1-gfp遺傳構(gòu)建題的轉(zhuǎn)基因品系日本青鳉（Oryziaslatipes）胚胎，檢測具有潛在雄激素干擾活性的受試物。spg1-gfp遺傳構(gòu)建體包含與綠色熒光蛋白（GFP）的報告基因偶聯(lián)的spiggin1基因的啟動子。在將受試生物暴露于受試物后，spg1基因的轉(zhuǎn)錄可能被激活或抑制，GFP報告基因隨之以不同程度發(fā)出熒光，因此可以通過對其熒光強(qiáng)度的測定判斷受試物是否具有雄激素活性。本試驗(yàn)是在半靜態(tài)暴露體系下，將含有spg1-gfp遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因品系日本青鳉（O.latipes）胚胎在有或沒有激動劑（3μg/L17MT）聯(lián)合暴露的情況下（即“加標(biāo)模式”和“未加標(biāo)模式”），暴露于一定濃度范圍的受試物溶液中。至少設(shè)置5個不同濃度的受試物處理組，以及相應(yīng)空白（培養(yǎng)基和/或溶劑）對照組、激動劑對照組、激動劑+拮抗劑對照組等。本試驗(yàn)通過采集轉(zhuǎn)基因spg1-gfp青鳉胚胎的GFP熒光圖像，并對熒光信號的定量統(tǒng)計，以對具有雄激素活性的受試物的正確分類。5受試物信息受試物的信息應(yīng)包括：a)單組分物質(zhì)：物理外觀、水溶性和其他相關(guān)物理化學(xué)性質(zhì)；化學(xué)標(biāo)識號，如IUPAC或CAS名稱、CAS編號、SMILES或InChI代碼、結(jié)構(gòu)式、純度、雜質(zhì)的化學(xué)標(biāo)識（視情況而定）和實(shí)際可行性等（如適用，包括有機(jī)碳含量）。此外，還可包括光穩(wěn)定性、試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性、pKa、Kow、歸趨信息及其在試驗(yàn)系統(tǒng)中快速降解性等信息，例如，生物降解性試驗(yàn)的結(jié)果，參見GB/T27850-2011《化學(xué)品快速生物降解性通則》；b)多組分物質(zhì)、UVCB和混合物：盡可能表征其化學(xué)特性（見上文）、定量組分及其成分的相關(guān)物理化學(xué)性質(zhì)；c)受試物的定量分析方法，包括定量限值；d)關(guān)于受試物穩(wěn)定性或溶解性的初步研究的現(xiàn)有數(shù)據(jù)或結(jié)果；e)在發(fā)射波長450-500nm(λEM=500–550nm）無熒光的結(jié)果；以及在這些波長下顯示有熒光但在胚胎內(nèi)沒有熒光的結(jié)果。必要時，應(yīng)了解受試物在試驗(yàn)介質(zhì)中的溶解性，并采用有已知準(zhǔn)確性、精度和靈敏性的有效分析方法定量暴露溶液中的受試物，并報告分析效率和定量限。5GB/TXXXXX—XXXX6參比物在使用本文件之前，應(yīng)采用表1中列出的四種參比物以驗(yàn)證方法的有效性。表1mDHT、利谷隆、頭孢呋辛和色苷酸鈉參比物信息表7儀器設(shè)備所需儀器設(shè)備如下：a)培養(yǎng)箱（或適當(dāng)?shù)臏囟扰c光照控制設(shè)備）；b)化學(xué)惰性材料制成的透明細(xì)胞培養(yǎng)6孔板；c)如果從下往上觀察，用底部透明的黑色96孔板熒光成像和定量；如果從上往上觀察，使用黑色塑料表面熒光成像和定量；d)pH計；e)配備光源的體式顯微鏡（用于觀測受精卵/未受精卵）；f)配備GFP長通濾光片和彩色照相機(jī)的熒光顯微鏡，用于熒光成像和定量（OECD，2022）；g)圖像分析軟件；h)適用于受試物的分析設(shè)備或外包分析服務(wù)。8方法概述8.1試驗(yàn)設(shè)計利用spg1-gfp遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因青鳉胚胎（發(fā)育至0dph時期）在有或無3μg/L17MT聯(lián)合暴露的情況下（即“加標(biāo)模式”和“未加標(biāo)模式”），在六孔板中暴露于受試物，三個重復(fù)，周期為72h。每次試驗(yàn)至少設(shè)置5個不同濃度的受試物處理組，以及相應(yīng)空白（培養(yǎng)基和/或溶劑）對照組、激動劑對照組、激動劑+拮抗劑對照組等。在半靜態(tài)暴露體系下，每個試驗(yàn)組（包括處理組和對照組）包括四個孔，每個孔使用5個胚胎，共20個胚胎，每天更換暴露溶液（即24h和48h后）。若受試物為不揮發(fā)性物質(zhì)，處理組或?qū)φ战M可共用同一個孔板。五個處理組和對照對照組設(shè)置三個重復(fù)試驗(yàn)，每個重復(fù)試驗(yàn)需要使用280個胚胎，三個重復(fù)共需要840個胚胎。該試驗(yàn)通過熒光成像技術(shù)測定轉(zhuǎn)基因spg1-gfp胚胎的GFP熒光，并完成熒光信號的定量統(tǒng)計。試驗(yàn)條件概述見附錄A。8.2試驗(yàn)對照6GB/TXXXXX—XXXX本試驗(yàn)所有對照組的有機(jī)溶劑濃度應(yīng)相同（如適用但應(yīng)盡可能不使用有機(jī)溶劑或控制最大溶劑濃度為100mg/L（0.01%），選用溶劑二甲基亞砜（DMSO）時濃度不超過0.2%。。a)空白（培養(yǎng)基和/或溶劑）對照組：4個孔，每孔5個胚胎暴露于空白中。該對照組用于確定空白中的熒光強(qiáng)度基線。如果使用其他溶劑，則將該組暴露溶液從空白換成與其它各組濃度相同的溶劑介質(zhì)中。在某些情況下，如使用的溶劑沒有可用的歷史數(shù)據(jù)，則可能需要同時設(shè)置空白對照組和溶劑對照組；b)3μg/L17MT激動劑對照組：4個孔，每孔5個胚胎，暴露于3μg/L的17MT，用于確定17MT濃度為3μg/L時的熒光強(qiáng)度。如果需要設(shè)置下述的附加對照，則該組的結(jié)果可用于附加對照中17MT標(biāo)準(zhǔn)曲線的計算，并可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出任何具有促雄激素效應(yīng)的受試物的17MT當(dāng)量值（選做）；c)10μg/L17MT激動劑對照組：4個孔，每孔5個胚胎，暴露于10μg/L的17MT，用于確定17MT濃度為10μg/L的熒光強(qiáng)度。如果需要設(shè)置下述的附加對照，則該組的結(jié)果可用于附加對照中17MT標(biāo)準(zhǔn)曲線的計算，并可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出任何具有促雄激素效應(yīng)的受試物的17MT當(dāng)量值（選做）；d)3μg/L17MT激動劑+500μg/L氟酰胺拮抗劑對照組：4個孔，每孔5個胚胎，暴露于3μg/L的17MT和500μg/L的氟酰胺，用于與單獨(dú)使用17MT3μg/L的對照組對比，以確定500μg/L濃度氟酰胺的熒光抑制作用。如果需要設(shè)置下述的附加對照，則該組的結(jié)果可用于附加對照中氟酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的計算，并可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出作為AR拮抗劑的受試物的氟酰胺當(dāng)量值，用于任何在加標(biāo)模式（存在3μg/L的17MT）下表現(xiàn)出抗雄激素活性的受試物。由于本試驗(yàn)結(jié)果只能證明受試物是否具有雄激素效應(yīng)相關(guān)的活性，因此計算上述的當(dāng)量值不是必須的，該數(shù)據(jù)僅供參考。如果確定要計算相關(guān)當(dāng)量值，則每次需設(shè)置以下附加對照組。以下的附加對照組是選做的，建議用于實(shí)驗(yàn)室參數(shù)校準(zhǔn)以及質(zhì)量控制。時的熒光強(qiáng)度。該對照組可與3μg/L17MT組和10μg/L17MT組共同用于計算17MT標(biāo)準(zhǔn)曲線?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算用于誘導(dǎo)雄性激素軸信號的受試物的17MT當(dāng)量值；b)3μg/L17MT+167μg/L氟酰胺：4個孔，每孔5個胚胎，暴露于3μg/L17MT和167μg/L的氟酰胺。該對照組用于與單獨(dú)使用17MT3μg/L的對照組相比，確定167μg/L濃度氟酰胺的熒光抑制作用。該對照組可用于計算氟酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線；c)3μg/L17MT+55.6μg/L氟酰胺：4個孔，每孔5個胚胎，暴露在3μg/L17MT和55.6μg/L的氟酰胺。該對照組用于與單獨(dú)使用17MT3μg/L的對照組相比，確定55.6μg/L濃度氟酰胺的熒光抑制作用。該對照組可用于計算氟酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線；d)3μg/L17MT+18.5μg/L氟酰胺：4個孔，每孔5個胚胎，暴露在3μg/L17MT和18.5μg/L的氟酰胺。該對照組用于與單獨(dú)使用17MT3μg/L的對照組相比，確定18.5μg/L濃度氟酰胺的熒光抑制作用。該對照組可用于計算氟酰胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果試驗(yàn)中使用有機(jī)溶劑，所有的對照組和試驗(yàn)組都應(yīng)保證含有相同濃度的溶劑。此外，對照組的試驗(yàn)結(jié)果需通過用于讀數(shù)的成像系統(tǒng)的有效性標(biāo)準(zhǔn)，如未通過，則試驗(yàn)結(jié)果無效。8.3試驗(yàn)平行7GB/TXXXXX—XXXX整個試驗(yàn)包括三個獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，每次試驗(yàn)按照5個胚胎/孔，4孔/組的分配運(yùn)行（如圖1）。在添加或不添加17MT的情況下，受試物至少設(shè)置五個濃度處理組。每次試驗(yàn)必須使用相同的濃度，每次平行使用獨(dú)立的溶液。應(yīng)使用在不同批次孵化的胚胎依次進(jìn)行試驗(yàn)。通過整合三次平行試驗(yàn)結(jié)果得到受試物的原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)，每個處理組共包括60個胚胎（n=60），因此可獲得60個熒光強(qiáng)度的量化數(shù)據(jù)。在三次試驗(yàn)均顯示陽性反應(yīng)的情況下不單獨(dú)展示單個平行下的試驗(yàn)結(jié)果，以更準(zhǔn)確地估計每個試驗(yàn)組的平均熒光值。圖1試驗(yàn)概述9試驗(yàn)準(zhǔn)備本試驗(yàn)的受試生物是純合的spg1-gfp轉(zhuǎn)基因品系日本青鳉胚胎（由兩個純合的spg1-gfp日本青鳉交配得到）。spg1-gfp轉(zhuǎn)基因品系在多個實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培育（見附錄A），當(dāng)受試物在spg1-gfp構(gòu)建體胚胎中可發(fā)出熒光時，可能還需要使用野生型胚胎來驗(yàn)證受試物是否在該胚胎中發(fā)出熒光。本文件的暴露試驗(yàn)從胚胎發(fā)育至0dph時期開始（26°C約受精后10d）。雖然要求必須是0dph時期胚胎，但它們的受精后天數(shù)（dpf）可以不同。單次重復(fù)試驗(yàn)中的差異不應(yīng)超過一個dpf。隨機(jī)選擇胚胎用于不同的暴露組。理想情況下實(shí)驗(yàn)室應(yīng)自行培育胚胎，或者從其他實(shí)驗(yàn)室獲取胚胎，試驗(yàn)開始之前盡可能延長胚胎的適應(yīng)期，已達(dá)到試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)見附錄C。日本青鳉的飼養(yǎng)、繁殖和護(hù)理在許多資料中都有描述，例如Medaka:Biology,Management,andExperimentalProtocols第1卷和第2卷（Kinoshitaetal.,2009;Murataetal.,2019），或美國環(huán)境保護(hù)署日本青鳉養(yǎng)殖指南。8GB/TXXXXX—XXXX每一代spg1-gfp轉(zhuǎn)基因品系都應(yīng)該通過運(yùn)行全套完整的對照（包括附加對照）進(jìn)行驗(yàn)證，確保符合所有有效性標(biāo)準(zhǔn)，以及獲得17MT和氟酰胺對照的預(yù)期響應(yīng)曲線。每年應(yīng)對隨機(jī)選擇的胚胎的發(fā)育階段進(jìn)行一次質(zhì)量控制檢查，以確保試驗(yàn)結(jié)束時游離胚胎的發(fā)育階段不高于第42期。9.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基可以是培養(yǎng)日本青鳉胚胎用水（見附錄D如礦泉水、山泉水、井水和木炭過濾的自來水。由于不同地區(qū)的水質(zhì)可能有很大差異，因此應(yīng)進(jìn)行水質(zhì)分析以排查可能干擾測定結(jié)果的潛在污染物（包括重金屬）和化學(xué)物質(zhì)，尤其是在沒有關(guān)于水質(zhì)是否適合飼養(yǎng)日本青鳉的歷史數(shù)據(jù)的情況下。特別需要注意的是銅、氯和氯胺，這些化學(xué)物質(zhì)對日本青鳉胚胎具有毒性。培養(yǎng)基中不應(yīng)使用螯合劑。水質(zhì)分析結(jié)果應(yīng)包含在報告中。適用于日本青鳉胚胎孵育的培養(yǎng)基的化學(xué)特性如附錄D中所列。同時，任何能夠支持日本青鳉正常生長和發(fā)育并滿足試驗(yàn)有效性標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)介質(zhì)都適合作為培養(yǎng)基。9.3喂食該試驗(yàn)使用的日本青鳉胚胎從發(fā)育至0dph時期開始試驗(yàn)，到3dph時期（約第40期）結(jié)束試驗(yàn)。在試驗(yàn)之前或期間都不能喂食（Iwamatsu，2004）。胚胎的卵黃囊直到發(fā)育至第41/42期仍然存在，并作為青鳉胚胎發(fā)育的能量來源。9.4檢測受試物的潛在熒光本試驗(yàn)不適用于檢測在激發(fā)波長為450-500nm(λEX=450-500nm發(fā)射波長為500-550nm(λEM=500-550nm）的熒光范圍內(nèi)自身發(fā)出熒光的受試物，以及可以在胚胎內(nèi)發(fā)出熒光的受試物。具有這兩種特性的受試物可能會誘發(fā)熒光，并被誤解為GFP信號，導(dǎo)致受試物被錯誤鑒定為對雄激素軸有活性。鑒定受試物是否在這些波長下發(fā)出熒光的方法為：在96孔板的10個孔中分別添加200μL的受試物溶液，濃度為本文件處理組的最高濃度，然后在96孔板的另外10個孔中分別添加200μL的空白介質(zhì)，然后使用與胚胎熒光成像和定量相同的儀器和設(shè)置對熒光進(jìn)行定量。通過統(tǒng)計分析評估空白介質(zhì)和受試物之間的潛在熒光強(qiáng)度差異。首先，進(jìn)行D'Agostino-Pearson正態(tài)性檢驗(yàn)。如果空白介質(zhì)和受試物的熒光數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，則進(jìn)行雙尾T-檢驗(yàn)，以確定兩者的熒光數(shù)值是否在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。如果其中一組或兩組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則應(yīng)進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)。如果確定了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，則應(yīng)在26±1°C的溫度下，將20個野生型日本青鳉胚胎暴露于這種熒光化學(xué)物質(zhì)72±2h，同時每天更換受試物溶液。然后對熒光進(jìn)行定量，并將其與在相同條件下僅暴露于空白介質(zhì)的20個野生型胚胎的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較。按照上述統(tǒng)計分析方法，對比空白介質(zhì)與受試物，如果兩者的熒光強(qiáng)度值在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異，則認(rèn)定該受試物是會發(fā)出熒光的，且熒光存在于胚胎內(nèi)，此時本文件不適用該受試物的檢測。如果受試物在未加標(biāo)和加標(biāo)模式下均能誘發(fā)熒光，則存在其已被代謝為熒光代謝物的可能。在這些情況下，應(yīng)檢查圖像以確定熒光是否僅限于腎臟。如果不是，則應(yīng)執(zhí)行上述暴露野生型胚胎的步驟，以確定該受試物是否代謝為熒光代謝物。9.5試驗(yàn)濃度的選擇9.5.1確定最高試驗(yàn)濃度最大耐受濃度（MTC即在三次單獨(dú)重復(fù)試驗(yàn)中，每次導(dǎo)致的死亡率均不超過10%的受試物最高試驗(yàn)濃度。應(yīng)使用日本青鳉胚胎進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)確定暴露濃度范圍，以評估可能的毒性。9GB/TXXXXX—XXXX確定暴露濃度范圍的預(yù)試驗(yàn)應(yīng)至少設(shè)置三個濃度組。濃度的選擇一般按幾何級數(shù)排列，濃度間隔系數(shù)不超過10倍。在選定的試驗(yàn)濃度和對照條件下，只需進(jìn)行一次試驗(yàn)（20個胚胎/組）。預(yù)試驗(yàn)可使用野生型或spg1-gfp轉(zhuǎn)基因胚胎，以5個胚胎/孔的密度，在每孔中添加8mL的暴露溶液，每個試驗(yàn)組和對照組均為4孔。通過整合暴露于相同試驗(yàn)濃度或?qū)φ盏乃?0個胚胎的數(shù)據(jù)，計算得到死亡（和/或畸形）胚胎的百分比。暴露濃度范圍的確定中，設(shè)置的最高濃度必須導(dǎo)致10%以上的死亡率（和/或畸形），除非最高試驗(yàn)濃度已達(dá)到100mg/L或到達(dá)受試物最大溶解度。應(yīng)根據(jù)受試物在試驗(yàn)介質(zhì)中的溶解度限值、MTC、在胚胎中引起10%以上死亡率和/或畸形的最大濃度或100mg/L的最大濃度（以最低者為準(zhǔn)）等參考指標(biāo)確定受試物的最高試驗(yàn)濃度。9.5.2試驗(yàn)濃度范圍本試驗(yàn)要求受試物至少有五個試驗(yàn)濃度并通過有效性標(biāo)準(zhǔn)。建議每個相鄰試驗(yàn)濃度之間的濃度間隔（間隔系數(shù)）為3-10倍。9.5.3受試溶液通常通過稀釋儲備液得到所設(shè)濃度的試驗(yàn)溶液。將每種試驗(yàn)溶液的pH值調(diào)節(jié)至6.5至8.0之間。配制儲備液時，應(yīng)根據(jù)需要使用機(jī)械方法（如攪拌、攪動或超聲波）或其他適當(dāng)方法溶解受試物。對于難以試驗(yàn)的受試物，參考OECD發(fā)布的第23號關(guān)于難以試驗(yàn)受試物的水相水生毒性試驗(yàn)指導(dǎo)文件（OECD，2019b）。在可能的情況下，盡量不使用溶劑或限制最大溶劑濃度為100mg/L（0.01%）。如果確認(rèn)所使用的溶劑和溶劑濃度能夠滿足所有有效性標(biāo)準(zhǔn)，則按照OECD第23號指導(dǎo)文件的描述進(jìn)行（OECD，2019b）。這些有效性標(biāo)準(zhǔn)包括胚胎存活率和對照組的毒性。如果使用溶劑，所有試驗(yàn)濃度組和對照組中的溶劑濃度應(yīng)保持一致。選擇的溶劑是否合適取決于受試物的物理化學(xué)特性和日本青鳉的敏感性，最好在預(yù)試驗(yàn)中確定。還應(yīng)考慮溶劑對生殖軸的潛在效應(yīng)（Hutchinson等，2006年）。在開展試驗(yàn)的第一天配制對照組溶液，儲存在4°C條件下，并在每次更新對照組溶液時使用，或每天重新配制。同一配制的對照溶液或試驗(yàn)溶液不得用于不同批次試驗(yàn)。4°C條件下儲存的溶液應(yīng)在溫度達(dá)到26±1°C后再暴露于胚胎，以防止溫度對暴露試驗(yàn)的影響。根據(jù)受試物的穩(wěn)定性，含有受試物的暴露溶液應(yīng)在試驗(yàn)的當(dāng)天配制并儲存在4°C下，或在每次更新試驗(yàn)溶液之前重新配制。試驗(yàn)期間，對保存在4°C的更新溶液進(jìn)行分析測量。10試驗(yàn)過程10.1暴露條件將胚胎暴露于化學(xué)惰性塑料的細(xì)胞培養(yǎng)六孔板中（通?？變?nèi)徑為34mm、高度20mm）。每孔加入8mL溶液，放置5個胚胎。在每次平行中，每個試驗(yàn)濃度下有20個胚胎。每個對照組包含20個胚胎。如果塑料孔板不適用于檢測特殊受試物，則替換為其他玻璃容器（如小直徑皮氏培養(yǎng)皿）。在整個試驗(yàn)過程中，胚胎在26±1°C的恒溫箱中孵育72±2h，并保持黑暗。這限制了不同培養(yǎng)箱之間的技術(shù)差異，并簡化了進(jìn)行試驗(yàn)的要求。如果使用光照周期，則需要特定的波長和強(qiáng)度來限制差異性。這也是試驗(yàn)光敏受試物的優(yōu)點(diǎn)。在每次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)時，都應(yīng)準(zhǔn)備一套新的暴露溶液。GB/TXXXXX—XXXX10.2分析檢測由于采用半靜態(tài)換液方法，因此需記錄受試物的濃度穩(wěn)定性。理想情況下，受試物的穩(wěn)定性應(yīng)允許暴露濃度在24h內(nèi)保持在標(biāo)稱濃度的±20%內(nèi)。對分析試驗(yàn)的最低要求是科學(xué)上合理的最低樣本量。OECD第23號指導(dǎo)文件提供了相關(guān)指導(dǎo)(OECD，2019b)。更新暴露液的時間最長為24±2h。如果在試驗(yàn)系統(tǒng)中不能維持濃度在±20%以內(nèi)，可以考慮縮短更新周期。對于濃度不能保持在標(biāo)稱濃度80-120%范圍內(nèi)的受試物，允許使用測量濃度的幾何平均值；詳見OECD指導(dǎo)文件第23號第5章(OECD，2019b)。10.3試驗(yàn)運(yùn)行a）第0d：1)在胚胎孵化當(dāng)天（0dph；受精后約10d；溫度為26°C）將其放入暴露液中；2)在挑選胚胎時，觀察胚胎并將出現(xiàn)明顯畸形或身體損傷（如尾部損傷、水腫、脊柱側(cè)彎）的胚胎排除在試驗(yàn)之外（見附錄E）。收集健康和外觀正常的胚胎至單獨(dú)的含有合適體積的培養(yǎng)基容器中。選擇的胚胎應(yīng)大小均勻，將大小差異明顯的胚胎去除。若在0dph時期健康和正常的游離胚胎數(shù)量低于80%，則認(rèn)定當(dāng)批次胚胎不適用于試驗(yàn)。在進(jìn)行試驗(yàn)之前，應(yīng)在移除死亡和畸形胚胎時確認(rèn)是否適用于試驗(yàn)；3)試驗(yàn)開始時，使用移液管將5個胚胎轉(zhuǎn)移至六孔板中。去除培養(yǎng)基，并首次添加受試物溶液。注意每次只處理一個孔板，以避免胚胎缺水。b）第1d和第2d應(yīng)在24±1h和48±2h內(nèi)分別更換受試物溶液和對照組溶液。檢查每個孔內(nèi)是否有外觀異常（損傷、異常游泳行為等）的胚胎。移除死亡胚胎、明顯畸形或損傷的胚胎并實(shí)施安樂死，并記錄所有觀察結(jié)果。在每次試驗(yàn)中，如果在一個對照組或一個處理組中出現(xiàn)超過10%的累積死亡率和可觀察到的亞致死效應(yīng)，而未受影響的試驗(yàn)濃度少于五個，則應(yīng)停止試驗(yàn)并查明導(dǎo)致死亡或異常的原因。c）第3d1)暴露72±2h后，對每個胚胎的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。首先用8mL不含受試物的培養(yǎng)基更新試驗(yàn)溶液，并移除死亡胚胎或明顯畸形的胚胎，記錄所有觀察結(jié)果。如果在一個對照組或一個處理組中出現(xiàn)超過10%的累積死亡率和可觀察到的亞致死效應(yīng)，而未受影響的試驗(yàn)濃度少于五個，則應(yīng)停止試驗(yàn)并查明導(dǎo)致死亡或異常的原因。不考慮對數(shù)據(jù)異常的實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如果需要對胚胎進(jìn)行麻醉后成像，則應(yīng)在六孔板中每孔加入2mL1g/L的MS222（甲基磺酸三卡因）緩沖液；2)建議在將胚胎進(jìn)行成像的所有情況前都進(jìn)行麻醉。只有當(dāng)它們在自由游動時（如在96孔板的孔中才不需使用麻醉。為了避免過度麻醉，只應(yīng)麻醉一個系列中可讀取的生物體數(shù)量。必要時，麻醉開始后（1-5min將胚胎轉(zhuǎn)移到用于成像的支架上（如黑色塑料表面或黑色96孔板）。然后用彩色相機(jī)和GFP長通濾光片進(jìn)行成像。使用校準(zhǔn)過程中確定的參數(shù)，應(yīng)拍攝到包括每個生物體腎臟在內(nèi)的背側(cè)區(qū)域圖像。d）終止試驗(yàn)在讀取熒光強(qiáng)度之后，將每個胚胎持續(xù)暴露于1g/L的MS222緩沖液至少20min，對其進(jìn)行安樂死。GB/TXXXXX—XXXX11試驗(yàn)的有效性11.1熒光定量分析本試驗(yàn)依賴于對每個胚胎發(fā)出的熒光強(qiáng)度進(jìn)行量化。為了確保實(shí)現(xiàn)適當(dāng)、準(zhǔn)確的定量，應(yīng)開展預(yù)試驗(yàn)。開展預(yù)試驗(yàn)是為了校準(zhǔn)熒光成像系統(tǒng)并確保設(shè)備可讀取合適動態(tài)范圍的熒光測量值（詳細(xì)說明見附錄B）。如果使用替代的熒光測量系統(tǒng)，則應(yīng)按照熒光成像系統(tǒng)的詳細(xì)說明（見附錄B）對其進(jìn)行校準(zhǔn)和驗(yàn)證。不過，最好使用配備照相機(jī)的熒光顯微鏡，因?yàn)檫@樣方便對圖片進(jìn)行質(zhì)量控制，以識別定位不佳的胚胎或與雄激素軸激活無關(guān)的熒光信號（包括熒光粉或纖維，熒光化學(xué)物質(zhì)在胚胎內(nèi)發(fā)出熒光的情況和異常的熒光模式）。11.2試驗(yàn)的有效性為了保證試驗(yàn)結(jié)果的有效性，每次運(yùn)行都應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)，否則視為無效：a)空白對照組和10μg/L17MT對照組之間測量到的熒光強(qiáng)度之間應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)差異。10μg/L17MT對照組的平均熒光強(qiáng)度值至少為空白對照組或溶劑對照組（如使用溶劑）的300%；b)在17MT存在和不存在的情況下，每個對照組和至少五個濃度處理組的死亡率和/或畸形率，以及由于胚胎定位不佳導(dǎo)致的無效數(shù)據(jù)（見附錄F）的總和不應(yīng)超過10%。不符合這些標(biāo)準(zhǔn)的組得到的結(jié)果是無效的。為了使試驗(yàn)有效，三組重復(fù)試驗(yàn)的整合數(shù)據(jù)應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)，否則所有三個重復(fù)的結(jié)果都被視為無a)10μg/L17MT對照組的平均熒光強(qiáng)度值應(yīng)至少比3μg/L17MT對照組的高10%。這可確保17MT10μg/L組的平均熒光高于3μg/L組的平均熒光，歷史數(shù)據(jù)表明這對于確保檢測的準(zhǔn)確性非常重要。通常，兩者之間的差異遠(yuǎn)大于10%；b)3μg/L17MT對照組和3μg/L17MT+500μg/L氟酰胺對照組之間的熒光抑制應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)差c)對于三次重復(fù)試驗(yàn)，每次試驗(yàn)應(yīng)至少具有五個“數(shù)據(jù)有效組”的試驗(yàn)濃度?！皵?shù)據(jù)有效組”的鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下：如果三次重復(fù)試驗(yàn)（每次最好為20個胚胎）都通過了有效性標(biāo)準(zhǔn)（死亡率、和/或畸形率以及由于胚胎位置不佳（見附錄F）而導(dǎo)致的無效數(shù)據(jù)的總和不應(yīng)超過10%則該處理組（最好為60個胚胎）可被視為“數(shù)據(jù)有效組”；d)如果進(jìn)行了圖像質(zhì)量控制，則這些有效性標(biāo)準(zhǔn)適用于圖像質(zhì)量控制之后。如果觀察到與有效性標(biāo)準(zhǔn)有細(xì)微偏差，則應(yīng)考慮與試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性有關(guān)的結(jié)果，并將這些考慮因素包含在報告中。12數(shù)據(jù)與報告12.1數(shù)據(jù)處理在分析之前，應(yīng)從數(shù)據(jù)中刪除從位置不佳的胚胎圖像得到的熒光測量值（見附錄F）。每個處理組由于胚胎位置不佳導(dǎo)致的綜合死亡率和/或畸形率以及無效數(shù)據(jù)的總和不應(yīng)超過10%。使用合適的軟件處理胚胎的彩色圖像，提取GFP的熒光數(shù)值。開源的處理軟件可選擇ImageJ或者最新版本的FIJI（Schindelin等，2012）。為了排除圖像中的自發(fā)熒光（非GFP熒光建議將圖像的紅、綠和藍(lán)顏色層分開。然后從綠色層減去紅色層，或?qū)⒓t色層的值加倍并從綠色層中減去，接著可以對得GB/TXXXXX—XXXX到的圖像應(yīng)用強(qiáng)度閾值，以減少內(nèi)源性色素沉著造成的背景干擾。最后對所得圖像中所有像素的熒光總和進(jìn)行量化。這項技術(shù)是一種有效限制測量GFP而非內(nèi)源性（自發(fā)）熒光的方式。因?yàn)镚FP相關(guān)的熒光僅出現(xiàn)在綠色層中，而黃色熒光則同時出現(xiàn)在綠色和紅色層中。如果在減去未加倍的紅色層后仍有一些內(nèi)源性熒光，則根據(jù)成像系統(tǒng)的不同將紅色層加倍也是有用的。根據(jù)成像系統(tǒng)和所用熒光過濾片的不同，還可以應(yīng)用其他技術(shù)來減少內(nèi)源性色素沉著對GFP信號定量的影響。一旦證明圖像分析工作流程能夠滿足特定熒光成像系統(tǒng)的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)將其應(yīng)用于所有后續(xù)的試驗(yàn)。對于每個有效試驗(yàn)濃度處理組組和對照組，將來自三個獨(dú)立試驗(yàn)的數(shù)據(jù)合并，以獲得54-60個熒光數(shù)據(jù)，最多數(shù)為60個，因?yàn)槊總€試驗(yàn)條件或?qū)φ盏倪\(yùn)行由20個胚胎組成，試驗(yàn)由三次重復(fù)組成。54個值的下限代表每次試驗(yàn)中10%的死亡率和/或畸形率，因此每次平行試驗(yàn)最低獲得18個熒光數(shù)據(jù)。進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)可提高試驗(yàn)的穩(wěn)定性。然而這三次重復(fù)可能會產(chǎn)生不同的結(jié)果。如果是這種情況，則該測定仍被視為有效。只有在根據(jù)整合的數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)受試物具有活性、且觀察到非單調(diào)濃度響應(yīng)曲線的情況下，三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果才可相互比較。如果在試驗(yàn)中使用了溶劑，則應(yīng)對溶劑的潛在影響進(jìn)行評估，具體做法是對溶劑對照組和空白對照組的統(tǒng)計比較。如果空白對照和溶劑對照之間沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，則應(yīng)使用混合的試驗(yàn)介質(zhì)和溶劑對照。如果在三次試驗(yàn)中檢測到空白對照組和溶劑對照組之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異，則證明試驗(yàn)失敗。應(yīng)單獨(dú)分析每次重復(fù)試驗(yàn)，以確定溶劑在三次重復(fù)中的結(jié)果是否可重現(xiàn)。如果顯著性差異的確存在，則證明試驗(yàn)失敗，應(yīng)使用新批次的溶劑或其他溶劑進(jìn)行新的試驗(yàn)。所選溶劑是否符合所有有效性標(biāo)準(zhǔn)也必須得到驗(yàn)證。如果有歷史數(shù)據(jù)表明所選溶劑在所選濃度下與空白對照相比在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異，則可能不需要設(shè)置空白對照組。12.2統(tǒng)計分析應(yīng)根據(jù)OECD第54號文件關(guān)于《生態(tài)毒性數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析的現(xiàn)行方法：應(yīng)用指南》（OECD，2006年）使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計方法。一般而言，與對照相比，使用雙尾假設(shè)檢驗(yàn)法（p<0.05）分析受試物對誘發(fā)熒光的影響。推薦的統(tǒng)計學(xué)方法（已在實(shí)驗(yàn)室間的驗(yàn)證過程中進(jìn)行了評估）是通過D'Agostino-Pearson正態(tài)性檢驗(yàn)來確定每個暴露組的數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，然后，如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則進(jìn)行Dunn’s檢驗(yàn)，然后進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)；如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，或違反齊次方差假設(shè)，則進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunn檢驗(yàn)（詳見附錄G）。另外，也可使用嵌套ANOVA分析（也稱混合ANOVA分析）來分析這類數(shù)據(jù)，該方法帶有隨機(jī)效應(yīng)項，可反映每次平行或每個孔帶來的變異性。隨后可進(jìn)行Dunnett檢驗(yàn)等事后檢驗(yàn)，以確定差異的大小和顯著性。12.3決策邏輯本文件制定了決策邏輯流程圖，為試驗(yàn)和結(jié)果解讀提供幫助（如圖2所示）。該決策邏輯基于三次有效重復(fù)試驗(yàn)的匯總統(tǒng)計分析，如果在加標(biāo)17MT或未加標(biāo)17MT模式下，受試物至少有一個試驗(yàn)濃度具有活性，并且觀察到單調(diào)的濃度-響應(yīng)關(guān)系，則認(rèn)為該受試物呈陽性結(jié)果。a)17MT未加標(biāo)模式中，活性濃度的定義是：與溶劑對照相比，熒光強(qiáng)度在統(tǒng)計學(xué)上顯著增加的受試物濃度；b)17MT加標(biāo)模式中，活性濃度的定義是：與3μg/L17MT對照組相比，熒光強(qiáng)度顯著增加或減少的受試物濃度。如果觀察到非單調(diào)濃度響應(yīng)，則應(yīng)通過比較三次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果來確認(rèn)結(jié)果的可靠性。如果結(jié)果不可GB/TXXXXX—XXXX靠，應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)，可使用不同的濃度范圍，以驗(yàn)證結(jié)果（見圖2）。如果結(jié)果可靠，則認(rèn)為該受試物對雄激素軸具有活性。如果在第二次重復(fù)的驗(yàn)證試驗(yàn)中得到相同的結(jié)果，則本文件可能不適用于該受試物，可能需要進(jìn)行替代試驗(yàn)。由于胚胎發(fā)育階段難以生成可檢出的雄激素水平，因此在未加標(biāo)模式下不會出現(xiàn)熒光下降。如果在未加標(biāo)模式下觀察到熒光強(qiáng)度在統(tǒng)計學(xué)上顯著降低，這可能表明本文件不適用于該受試物，或者生物體、試驗(yàn)條件存在潛在問題，需要進(jìn)一步調(diào)查。應(yīng)分析單次重復(fù)試驗(yàn)，以確定三次重復(fù)中是否存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著熒光下降，然后根據(jù)專業(yè)判斷來決定是否重復(fù)：可選擇不重復(fù)多次，只使用一批新的胚胎進(jìn)行一次重復(fù)試驗(yàn)；或者使用較低的濃度范圍進(jìn)行一次完整的試驗(yàn)；或者進(jìn)行不同的雄激素軸活性試驗(yàn)。圖2用于解釋試驗(yàn)結(jié)果的決策邏輯圖OECDGD150文件為分析結(jié)果分類群之間的解釋和外推提供了進(jìn)一步指導(dǎo)（OECD，2018）。如果熒光強(qiáng)度在未加標(biāo)模式下有統(tǒng)計學(xué)上的顯著下降，詳細(xì)描述見12.3。13試驗(yàn)報告試驗(yàn)報告應(yīng)包括以下信息：GB/TXXXXX—XXXX該部分詳細(xì)信息見第5章。13.2受試生物a)學(xué)名、轉(zhuǎn)基因品系、供應(yīng)商或來源以及培養(yǎng)條件。b)試驗(yàn)前從批次中去除的死亡和畸形游離胚胎的百分比。13.3試驗(yàn)條件a)試驗(yàn)程序（例如試驗(yàn)的濃度、溫度、持續(xù)時間、半靜態(tài)、體積、每毫升的胚胎數(shù)量b)培養(yǎng)基特性的詳細(xì)信息（參考礦泉水或泉水、自來水處理說明，如木炭過濾等）或使用的人工培養(yǎng)基及所做的任何測量；c)儲備液的配制方法和更新頻率（如使用溶劑，應(yīng)提供溶劑及其濃度信息d)用于暴露的六孔板和用于熒光成像和定量的所有孔板的品牌和參考信息；e)用于定量的熒光顯微鏡的參考資料和設(shè)置。還應(yīng)提供用于圖像分析的方法。13.4結(jié)果討論a)確定試驗(yàn)濃度范圍的結(jié)果，可用于確定MTC和/或?yàn)檫x擇用于正式試驗(yàn)的試驗(yàn)濃度；b)試驗(yàn)濃度，在可能的情況下，還應(yīng)報告為確定試驗(yàn)容器中受試物的濃度而進(jìn)行的所有化學(xué)分析結(jié)果；如適用，報告以適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計平均值（例如算術(shù)平均值、時間加權(quán)平均值等）表示的測得的暴露濃度；還應(yīng)報告分析方法的回收效率和定量限；c)報告每次試驗(yàn)中死亡和畸形胚胎的數(shù)量，以及它們的所在組別和天數(shù)；d)報告熒光定量原始數(shù)據(jù)（例如單個熒光原始數(shù)據(jù)）。理想情況下，數(shù)據(jù)應(yīng)以tab或csv格式收集，文件中應(yīng)包含以下元數(shù)據(jù)：日期、受試物名稱、使用濃度、溶劑、設(shè)備名稱、設(shè)備信號收集參數(shù)、實(shí)驗(yàn)室名稱、游離胚胎批號和熒光值；e)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和處理方法，包括所使用的統(tǒng)計檢驗(yàn)，以及是否和為何進(jìn)行數(shù)據(jù)審查；f)所有有效性標(biāo)準(zhǔn)；g)每個試驗(yàn)組（包括所有對照組和受試物濃度組）的熒光平均值及其SEM（平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差以圖像的形式表示，并與樣本量一起在表格中顯示；h)在加標(biāo)和未加標(biāo)模式下，與其各自的對照組相比，每個濃度的熒光增加或減少的百分比；i)選做且在適用的情況下，提供溶劑的潛在影響的評估結(jié)果：溶劑對照組與空白對照組的統(tǒng)計比較（如果包括在本文件中）或先前研究的結(jié)果；j)其他已觀察到的生物效應(yīng)或測量結(jié)果：報告觀察到或測量到的任何其他生物效應(yīng)（例如，行為異常、畸形或異常色素沉著k)對任何偏離試驗(yàn)或偏離有效性標(biāo)準(zhǔn)的解釋，以及對試驗(yàn)結(jié)果的潛在后果的考慮；l)在適用情況下，討論在加標(biāo)和/或未加標(biāo)模式下發(fā)現(xiàn)的活性濃度；m)得出結(jié)論，表明受試物對雄激素軸上是有活性的還是無活性的。GB/TXXXXX—XXXX附錄A（資料性附錄）試驗(yàn)條件概述表A.1試驗(yàn)條件概述含spg1-gfp的O.latipes胚胎GB/TXXXXX—XXXX附錄B（資料性附錄）最佳成像設(shè)置條件的確定校準(zhǔn)校準(zhǔn)的目的是雖然采集試驗(yàn)結(jié)果的成像設(shè)備不同，但確保所有實(shí)驗(yàn)室對參比物17MT和氟他胺獲得相似的響應(yīng)程度和靈敏度。校準(zhǔn)的兩個步驟：1.確定最佳成像設(shè)置條件，使?jié)舛葹?0μg/L的17MT獲得合適的GFP誘導(dǎo)結(jié)果。2.將這些設(shè)置應(yīng)用于17MT和氟他胺的三次濃度反應(yīng)試驗(yàn)，以通過使用增加的17MT和氟他胺濃度以及誘導(dǎo)可檢測的GFP反應(yīng)的最低濃度的17MT或氟他胺來檢查誘導(dǎo)的幅度。以下兩個步驟描述的示例操作中所有暴露溶液使用0.2%的二甲基亞砜（DMSO）。僅作示例；可使用替代溶劑進(jìn)行相同的試驗(yàn)操作。如果在進(jìn)行本文件試驗(yàn)時更換了溶劑，或首次試驗(yàn)時沒有使用溶劑，則校準(zhǔn)過程不需要重復(fù)。B.1選擇圖像拍攝設(shè)置第一步是為校準(zhǔn)試驗(yàn)確定正確的圖像拍攝設(shè)置，確定后的這些設(shè)置將用于后續(xù)的試驗(yàn)。為了選擇圖像拍攝的設(shè)置，將50個胚胎暴露于50μg/L的17MT中，并按照以下方案調(diào)整設(shè)置。此步驟只需重復(fù)一次。B.1.1配制暴露溶液a)試驗(yàn)組由10個孔組成，每孔5個spg1-gfp轉(zhuǎn)基因日本青鳉魚的胚胎；b)所有孔中DMSO的最終濃度為0.2%；c)配制50mg/L17MT的DMSO溶液；1)將50mg/L的17MT溶液均分，每份200μL；2)均分溶液在-20°C下保存，不超過2個月。d)配制含有0.2%DMSO的50μg/L17MT的以下暴露溶液。1)空白培養(yǎng)基100mL；2)含17MT50mg/L的DMSO100μL；3)DMSO100μL。B.1.2開始暴露a)向每個孔中添加5個spg1-gfp轉(zhuǎn)基因日本青鳉魚胚胎；b)在胚胎不缺水的情況下移除最大量的液體（最大剩余體積800μLc)每個孔添加8mL暴露溶液；d)在黑暗中于26°C下孵育孔板。試驗(yàn)期間，禁止喂食。B.1.3在24h和48h更換暴露溶液a)記錄死亡率，并移除所有死亡胚胎；b)根據(jù)B1.1配制暴露溶液；GB/TXXXXX—XXXXc)去除最大體積的溶液；d)每個孔添加8mL暴露溶液；e)在黑暗中于26°C下孵育孔板。試驗(yàn)期間，禁止喂食。B.1.472h時期潤洗胚胎a)準(zhǔn)備含有8mL水的六孔潤洗板，可使每個孔中的胚胎正常生長和發(fā)育；b)將暴露組孔板中的所有胚胎轉(zhuǎn)移至潤洗孔板中。B.1.572h時期觀察胚胎a)如必要，在六孔板的每孔暴露于50μg/L17MT的胚胎中加入2mL濃度為1g/L的MS222用于麻醉。注意一次只能麻醉一塊孔板；b)放置好胚胎，使成像系統(tǒng)可以對背側(cè)進(jìn)行成像；c)調(diào)整熒光顯微鏡的變焦和聚焦，以確定允許兩個腎臟成像的最大變焦；d)檢查孔板上的其他胚胎，以確保所選的縮放使兩個腎臟在同一幅圖像中顯示。否則，則重新調(diào)整縮放，重新開始該過程；e)如果可能，重置相機(jī)的白平衡；f)將相機(jī)的增益設(shè)置為零，并調(diào)整曝光時間，調(diào)整到腎臟盡可能明亮而不顯白；g)如果曝光需要設(shè)置在100ms以上，以導(dǎo)致GFP信號飽和（GFP信號中的白色區(qū)域則增加增益并重新啟動；h)檢查孔板上的其他胚胎，以確保選定的暴露時間不會導(dǎo)致腎臟的很大一部分變白。否則，則重新調(diào)整縮放，重新開始該過程；i)保存并記錄相機(jī)的選定設(shè)置，并保存設(shè)置文件，以便在以后的每次成像過程中調(diào)用；j)拍攝每個胚胎的圖像；k)拍攝完所有圖像后，對胚胎進(jìn)行安樂死；l)按照第12章的說明對圖像進(jìn)行分析；m)暴露于雄激素后的胚胎的示例圖像（背側(cè)視圖）見附錄F。B.2測定17MT和氟他胺的線性和靈敏度確定17MT和氟他胺的線性和靈敏度。在3μg/L17MT存在的情況下，將20個胚胎暴露于一定濃度范圍的17MT和一定濃度范圍的氟他胺中。該步驟需要三次獨(dú)立重復(fù)。B.2.1配制暴露溶液a)每個試驗(yàn)組由4個孔組成，每孔5個spg1-gfp轉(zhuǎn)基因日本青鳉魚胚胎；b)所有孔中DMSO的最終濃度為0.2%；c)配制10mg/L17MT的DMSO溶液；-將10mg/L17MT溶液均分，每份溶液為200μL；-均分的溶液在-20°C下保存，不超過2個月。d)配制500mg/L氟他胺溶于DMSO的溶液。-將500mg/L氟他胺溶液均分，每份溶液200μL；-將均分的溶液在-20°C下保存，不超過2個月。根據(jù)以下內(nèi)容配制試驗(yàn)溶液：GB/TXXXXX—XXXX無無無無3表B.1試驗(yàn)溶液和中間溶液的配制B.2.2試驗(yàn)組為：溶劑對照：含0.2%DMSO的培養(yǎng)基含0.2%DMSO的17MT1.5μg/L含0.2%DMSO的17MT3μg/L含0.2%DMSO的17MT10μg/L氟他胺18.5μg/L+含0.2%DMSO的17MT3μg/L氟他胺55.6μg/L+含0.2%DMSO的17MT3μg/L氟他胺167μg/L+含0.2%DMSO的17MT3μg/L氟他胺500μg/L+含0.2%DMSO的17MT3μg/LB.2.3開始暴露a)在每孔添加5個spg1-gfp轉(zhuǎn)基因胚胎；b)在胚胎不缺水的情況下移除最大體積的液體（最大剩余體積800μLc)繼續(xù)處理對照組、17MT組和17MT+氟他胺組；d)每個孔添加8mL暴露溶液；e)在黑暗中于26°C下孵育孔板。試驗(yàn)期間，禁止喂食。B.2.3.1在24h和48h更新暴露液a)記錄死亡率，并移除所有死亡胚胎；b)根據(jù)B2.1配制暴露溶液；c)使用軟移液管移除最大體積的液體；d)每個孔添加8mL暴露溶液；e)在黑暗中于26°C下孵育孔板。試驗(yàn)期間，禁止喂食。GB/TXXXXX—XXXXB.2.3.2在72h潤洗胚胎a)準(zhǔn)備六孔潤洗板，每孔含有8mL脫氯水或礦泉水；b)將暴露組的所有胚胎從暴露板轉(zhuǎn)移到潤洗板；c)將潤洗板運(yùn)送至將進(jìn)行讀數(shù)的位置。B.2.3.3在72h觀察胚胎a)加載第一步校準(zhǔn)試驗(yàn)結(jié)束時保存的圖像拍攝參數(shù)；b)如有必要，在六孔板的每孔中加入2mL濃度為1g/L的MS222，麻醉暴露于溶劑對照溶液的胚胎；c)注意一次只能麻醉一塊孔板；d)如果需要，在麻醉開始后（1至5min將胚胎轉(zhuǎn)移到用于成像的載體上，如黑色塑料表面或透明底部黑色96孔板；e)放置好胚胎，以便成像系統(tǒng)可以對背側(cè)進(jìn)行成像；f)拍攝每個胚胎的圖像；g)在拍攝暴露組的所有圖像后，對胚胎進(jìn)行安樂死；h)繼續(xù)拍攝，直到完成所有組的拍攝；i)按照第12章的說明分析圖像。B.2.4結(jié)果分析a)匯總數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并繪制圖表，應(yīng)注意17MT和氟他胺的最低LOEC；b)17MT的LOEC應(yīng)至少為3μg/L，氟他胺的LOEC至少為500μg/L；c)17MT和氟他胺應(yīng)在濃度試驗(yàn)范圍內(nèi)應(yīng)呈現(xiàn)濃度-響應(yīng)關(guān)系；d)如果由于低濃度時靈敏度低或較高濃度時信號飽和，和濃度-響應(yīng)關(guān)系不明顯，則應(yīng)盡量調(diào)整圖像拍攝參數(shù)以改善濃度-響應(yīng)關(guān)系。GB/TXXXXX—XXXX（資料性附錄）收集胚胎：馴化和批量收集試驗(yàn)所需胚胎最遲應(yīng)在試驗(yàn)開始前3d收集，以便恢復(fù)和適應(yīng)；從接收胚胎到暴露開始時間內(nèi)，死亡或異常胚胎數(shù)量少于總數(shù)的20%時，才可收集該批胚胎。試驗(yàn)開始前三天收集胚胎方法：a)不同受精日期的胚胎不得混用；b)對胚胎進(jìn)行分類，以去除死亡和異常胚胎且應(yīng)少于20%，否則該批次不適用于本文件試驗(yàn)；c)將正常胚胎轉(zhuǎn)移到1L晶體容器或15cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中裝有適合培養(yǎng)日本青鳉胚胎的培養(yǎng)基（見附錄Dd)每個晶體容器的最大密度為500個胚胎，每個培養(yǎng)皿的最大密度是200個胚胎；e)在約26℃的溫度和14h:10h的光暗周期下孵育胚胎。根據(jù)需要調(diào)整孵化溫度，控制胚胎在9dpf或10dpf時期左右孵化最佳（胚胎在7-12dpf期間孵化均符合實(shí)驗(yàn)開展要求f)試驗(yàn)所需胚胎為0dph時期胚胎，但允許0dph時期胚胎有不同的受精天數(shù)。在單次重復(fù)試驗(yàn)中，所有實(shí)驗(yàn)胚胎的受精天數(shù)差異不應(yīng)超過一天。應(yīng)隨機(jī)選用胚胎到不同暴露組中；g)在胚胎發(fā)育至孵化期間，胚胎培養(yǎng)基應(yīng)至少更換一次。GB/TXXXXX—XXXX（資料性附錄）日本青鳉胚胎孵化所需的培養(yǎng)基化學(xué)特性表D.1適合青鳉胚胎孵化的培養(yǎng)基參數(shù)要求--GB/TXXXXX—XXXX（資料性附錄）鑒別正常與異常游離胚胎的拍攝方法圖E.1識別正常和異常胚胎的拍攝方法(A)正常游離胚胎；異常胚胎包括B）胚胎較小，長度明顯比同批次的其他胚胎短；(C)部分孵化，胚胎尚未完全從卵中孵出D和E）發(fā)育不良，孵化的青鳉胚胎都表現(xiàn)出非常大的卵黃囊，但仍呈球形；(F)畸形，尾巴向下彎曲。比例尺為1mm。GB/TXXXXX—XXXX（資料性附錄）胚胎定位圖F.1用于成像的胚胎的預(yù)期定位如果胚胎的位置允許對背側(cè)區(qū)域（包括腎臟的位置）進(jìn)行成像，則該定位是正確的。圖F.1A)和B）為兩個spg1-gfp青鳉胚胎背側(cè)圖像，胚胎腎臟中顯示綠色熒光蛋白(GFP)信號。胚胎朝向圖像的右側(cè)。GB/TXXXXX—XXXX（資料性附錄）試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析方法采用的統(tǒng)計方法首先要進(jìn)行D'Agostino-Pearson正態(tài)性檢驗(yàn)以確定每個暴露組的數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布。為確定方差是否均勻，應(yīng)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)（如Levene檢驗(yàn)）。如果數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且不違反方差齊性假設(shè)，則應(yīng)對未加標(biāo)模式下的受試物處理組和空白對照（若未使用溶劑，溶劑對照或試驗(yàn)介質(zhì)對照）進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunnett’spost-hoc檢驗(yàn)。同樣，應(yīng)對加標(biāo)模式下的受試物處理組和17MT3μg/L對照進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunnett’spost-hoc檢驗(yàn)。如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差非齊次，則應(yīng)執(zhí)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，然后執(zhí)行Dunnett’spost-hoc或Welchsl多對一比較檢驗(yàn)。如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則應(yīng)對未加標(biāo)模式下的受試物處理組和空白對照（若未使用溶劑，溶劑對照或試驗(yàn)介質(zhì)對照）進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunnett’spost-hoc檢驗(yàn)。同樣，應(yīng)對加標(biāo)模式下的受試物處理組和17MT3μg/L對照進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，然后進(jìn)行Dunnett’spost-hoc檢驗(yàn)。圖G.1比較兩組及以上的試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計分析流程另外，如果在試驗(yàn)期間記錄了孔內(nèi)信息，也可以使用嵌套ANOVA試驗(yàn)（也稱為混合ANOVA）來分析這類數(shù)據(jù)，其中的隨機(jī)效應(yīng)項應(yīng)考慮到運(yùn)行或孔內(nèi)帶來的可變性。隨后進(jìn)行事后檢驗(yàn)如Dunnett’s檢驗(yàn)，以確定差異的大小和顯著性。如果僅比較兩組數(shù)據(jù)，例如3μg/L17MT激動劑對照組和3μg/L17MT+500μg/L氟酰胺拮抗劑對照組，則應(yīng)首先通過D'Agostino-Pearson正態(tài)性檢驗(yàn)，以確定每個暴露組的數(shù)據(jù)是否為正態(tài)分布。如果每個暴露組的數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，則應(yīng)進(jìn)行Welch校正的student-t檢驗(yàn)。如果一個或兩個暴露組的數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，應(yīng)進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)。GB/TXXXXX—XXXX（資料性附錄）關(guān)于SPG1-GFP品系日本青鳉的獲取關(guān)于spg1-gfp青鳉轉(zhuǎn)基因品系的獲取，可以通過WatchFrog以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室獲取該品系，這些實(shí)驗(yàn)室包括TEFOR,France;TheNationalBioResourceProject,Japan;IDEAConsulting,Japan;TheNationalMuseumofNaturalHistory,France，ibaconGmbH、Eurofins、CharlesRiver和Scymaris等。使用該品系魚類需要同相關(guān)實(shí)驗(yàn)室簽署協(xié)議。GB/TXXXXX—XXXX參考文獻(xiàn)[1]Borg,B.,Antonopoulou,E.,Andersson,E.,Carlberg,T.,Mayer,I.1993.Effectivenessofseveralandrogensinstimulatingkidneyhypertrophy,asecondarysexualcharacter,incastratedmalethreespinedsticklebacks,Gasterosteusaculeatus.Can.J.Zool.7,2327–2329.[2]Cui,J.,Shen,X.,Yan,Z.,Zhao,H.,andNagahama,Y.(2009).Homology-modeledligand-bindingdomainsofmedakaestrogenreceptorsandandrogenreceptors:amodelsystemforthestudyofreproduction.Biochem.Biophys.Res.Commun.380,115–121.[3]Hahlbeck,E.,Katsiadaki,I.,Mayer,I.,Adolfsson-Erici,M.,James,J.,andBengtsson,B.-E.(2004).Thejuvenilethree-spinedstickleback(GasterosteusaculeatusL.)asamodelorganismforendocrinedisruptionII--kidneyhypertrophy,vitellogeninandspiggininduction.Aquat.Toxicol.70,311–326.[4]Horie,Y.,Watanabe,H.,Takanobu,H.,Yagi,A.,Yamagishi,T.,Iguchi,T.,andTatarazako,N.(2017).Developmentofaninvivoanti-androgenicactivitydetectionassayusingfenitrothioninJapanesemedaka(Oryziaslatipes).J.Appl.Toxicol.37,339–346.[5]HornungM.W.,CookP.M.,FitzsimmonsP.N.,KuehlD.W.,NicholsJ.W.(2007).Tissuedistributionandmetabolismofbenzo[a]pyreneinembryonicandlarvalmedaka(Oryziaslatipes).Toxicol.Sci.100,393–405.[6]Hutchinson,T.H.,Shillabeer,N.,Winter,M.J.,andPickford,D.B.(2006).Acuteandchroniceffectsofcarriersolventsinaquaticorganisms:Acriticalreview.Aquat.Toxicol.[7]Iwamatsu,T.(2004).StagesofnormaldevelopmentinthemedakaOryziaslatipes.Mech.Dev.121,605–618.Iwamatsu,T.,Kobayashi,H.,andYamashita,M.(2006).Sexreversalinmedakatreatedinvitrowith17α-methyldihydrotestosteroneduringoocytematuration.Dev.GrowthDiffer.48,59–64.[8]Jakobsson,S.,Borg,B.,Haux,C.,andHyllner,S.J.(1999).An11-ketotestosteroneinducedkidneysecretedprotein:thenestbuildinggluefrommalethree-spinedstickleback,Gasterosteusaculeatus.FishPhysiol.Biochem.20,79–85.[9]Jolly,C.,Katsiadaki,I.,Morris,S.,LeBelle,N.,Dufour,S.,Mayer,I.,Pottinger,T.G.,andScott,A.P.(2009).Detectionoftheanti-androgeniceffectofendocrinedisruptingenvironmentalcontaminantsusinginvivoandinvitroassaysinthethree-spinedstickleback.Aquat.Toxicol.92,228–239.[10]KashiwadaS.,GokaK.,ShiraishiH.,ArizonoK.,OzatoK.,WakamatsuY.,HintonD.E.(2007).AgedependentinsituhepaticandgillCYP1Aactivityinthesee-throughmedaka(Oryziaslatipes).Comp.Biochem.Physiol.CToxicol.Pharmacol.145,96–102.[11]Katsiadaki,I.,Morris,S.,Squires,C.,Hurst,M.R.,James,J.D.,andScott,A.P.(2006).Useofthethreespinedstickleback(Gasterosteusaculeatus)asasensitiveinvivotestfordetectionofenvironmentalantiandrogens.Environ.HealthPerspect.114Suppl1,GB/TXXXXX—XXXX[12]Katsiadaki,I.,Scott,A.P.,Mayer,I.2002a.PotentialofthesticklebackasacombinedbiomarkerforestrogensandandrogensinEuropeanwaters.Mar.Environ.Res.54,[13]Katsiadaki,I.,Scott,A.P.,Hurst,M.R.,Matthiessen,P.,Mayer,I.200b.Detectionofenvironmentalandrogens:anovelmethodbasedonenzyme-linkedimmunosorbentassayofspiggin,thestickleback(Gasterosteusaculeatus)glueprotein.Environ.Toxicol.Chem.21,[14]Kawahara,R.,andNishida,M.(2007).Extensivelineage-specificgeneduplicationandevolutionofthespigginmulti-genefamilyinstickleback.BMCEvol.Biol.7,209.[15]Kinoshita,M.,Murata,K.,Naruse,K.,andTanaka,M.(2009).Medaka:Biology,Management,andExperimentalProtocols(JohnWiley&Sons).[16]Kiparissis,Y.,Metcalfe,T.L.,Balch,G.C.,andMetcalfe,C.D.(2003).Effectsoftheantiandrogens,vinclozolinandcyproteroneacetateongonadaldevelopmentintheJapanesemedaka(Oryziaslatipes).Aquat.Toxicol.63,391–403.[17]Kullman,S.W.,andHinton,D.E.(2001).Identification,characterization,andontogenyofasecondcytochromeP4503Agenefromthefreshwaterteleostmedaka(Oryziaslatipes).Mol.Reprod.Dev.58,149–158.[18]Masuyama,H.,Yamada,M.,Kamei,Y.,Fujiwara-Ishikawa,T.,Todo,T.,Nagahama,Y.,andMatsuda,M.(2012).Dmrt1mutationcausesamale-to-femalesexreversalafterthesexdeterminationbyDmyinthemedaka.ChromosomeRes.20,163–176.[19]Matsuda,M.,Nagahama,Y.,Shinomiya,A.,Sato,T.,Matsuda,C.,Kobayashi,T.,Morrey,C.E.,Shibata,N.,Asakawa,S.,Shimizu,N.,etal.(2002).DMYisaY-specificDM-domaingenerequiredformaledevelopmentinthemedakafish.Nature417,559–563.[20]Murata,K.,Kinoshita,M.,Naruse,K.,Tanaka,M.,andKamei,Y.(2019).Medaka:Biology,Management,andExperimentalProtocols(JohnWiley&Sons).Muschket,M.,DiPaolo,C.,Tindall,A.J.,Touak,G.,Phan,A.,Krauss,M.,Kirchner,K.,Seiler,T.-B.,Hollert,H.,andBrack,W.(2018).Identificationofunknownantiandrogeniccompoundsinsurfacewatersbyeffect-directedanalysis(EDA)usingaparallelfractionationapproach.Environ.Sci.Technol.52,288–297.[21]Nakamura,A.,Takanobu,H.,Tamura,I.,Yamamuro,M.,Iguchi,T.,andTatarazako,N.(2014).VerificationofresponsesofJapanesemedaka(Oryziaslatipes)toanti-androgens,vinclozolinandflutamide,inshort-termassays.J.Appl.Toxicol.JAT34,545–553.[22]OECD(1992),TestNo.301:ReadyBiodegradability,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section3,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264070349-en.[23]OECD(1998),TestNo.212:Fish,Short-termToxicityTestonEmbryoandSac-FryStages,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264070141-en.[24]OECD(2006).CurrentApproachesintheStatisticalAnalysisofEcotoxicityData:AGuidancetoApplication,SeriesonTestingandAssessmentNo.54,OECD,Paris.GB/TXXXXX—XXXX[25]OECD(2009),TestNo.230:21-dayFishAssay:AShort-TermScreeningforOestrogenicandAndrogenicActivity,andAromataseInhibition,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264076228-en.[26]OECD(2010a).ValidationReportofthe21-DayAndrogenisedFemaleSticklebackScreeningAssay,SeriesonTestingandAssessmentNo.128,OECD,Paris.OECD(2011a).GuidanceDocumentontheAndrogenisedFemaleSticklebackScreen,SeriesonTestingandAssessmentNo.148,OECD,Paris.[27]OECD(2011b),TestNo.234:FishSexualDevelopmentTest,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264122369-en.[28]OECD(2012),TestNo.229:FishShortTermReproductionAssay,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264185265-en.[29]OECD(2013),TestNo.210:Fish,Early-lifeStag