高中生物第4章現(xiàn)代生物技術(shù)4.3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)課件北師大版選修

第3節(jié)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)1.記住PCR技術(shù)的原理。2.簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的基本操作。3.說(shuō)出PCR技術(shù)的應(yīng)用。一二三一、DNA片段的擴(kuò)增1.概念PCR技術(shù)是體外酶促合成特定DNA片段的一種方法。2.擴(kuò)增條件按照DNA復(fù)制所需條件,在體外酶促合成DNA時(shí),必須具備待擴(kuò)增的目的DNA(DNA合成的模板)、合成DNA時(shí)所需的特異引物和原料——4種三磷酸脫氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)、起酶促作用的耐熱TaqDNA聚合酶和作為反應(yīng)介質(zhì)的緩沖溶液。

四一二三3.原理根據(jù)DNA的理化特性,在高溫條件下,雙鏈DNA解旋變?yōu)閱捂淒NA(變性);低溫條件下單鏈DNA又可恢復(fù)為雙鏈DNA(復(fù)性);中溫條件下能進(jìn)行DNA合成,使DNA鏈延伸。由此,PCR反應(yīng)過(guò)程一般采取“高溫變性——低溫復(fù)性——中溫延伸”三個(gè)步驟,促使DNA進(jìn)行復(fù)制。以上述反應(yīng)作為一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,得到大量的目的DNA片段。四一二三四二、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳是一種非常簡(jiǎn)便的快速分離、純化和鑒定DNA的方法。瓊脂糖凝膠具有大小一致的剛性濾孔,帶有大量負(fù)電荷的DNA分子在外加電場(chǎng)的作用下可以通過(guò)這些濾孔向正極泳動(dòng)。DNA片段在凝膠中的泳動(dòng)速率主要取決于其分子的大小,因此

大小一致的DNA分子會(huì)在凝膠的一定位置形成DNA條帶。一二三四三、DNA片段的擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳的方法步驟1.DNA片段的PCR擴(kuò)增(1)把PCR反應(yīng)體系的各種藥品加入冰浴的EP管中,混合均勻后

低速離心。每管加入30μL無(wú)菌石蠟油。(2)將EP管放入PCR熱循環(huán)儀中,輸入并運(yùn)行反應(yīng)程序。2.擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)制作電泳膠板→加樣→電泳→觀察。一二三四四、PCR影響因素在PCR實(shí)驗(yàn)中,需要擴(kuò)增的DNA片段的大小決定延伸的時(shí)間,片段較大,中溫延伸的時(shí)間就要相應(yīng)延長(zhǎng);引物的堿基數(shù)量和組成則決定著復(fù)性溫度的選擇,如果引物越短,A、T含量越多,PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度就越低,反之引物長(zhǎng)度較長(zhǎng),G、C含量較高,則需要設(shè)計(jì)較高的復(fù)性溫度。TaqDNA聚合酶在PCR擴(kuò)增過(guò)程中也存在大約為1×10-5的出錯(cuò)概率,而且隨著循環(huán)數(shù)的增加,其活性也逐漸降低。因此,PCR擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)并非越多越好,一般控制在25~35個(gè)循環(huán)。一二三四思考：2014年埃博拉疫情在非洲蔓延,隨后生物科學(xué)研究工作者迅速研制出了埃博拉病毒檢測(cè)試劑盒,使得能夠快速診斷出埃博拉患者。那么,埃博拉病毒檢測(cè)試劑盒所需的大量埃博拉病毒基因是怎樣獲得的呢?提示:采用PCR技術(shù)對(duì)埃博拉病毒的基因迅速擴(kuò)增產(chǎn)生的。1.PCR技術(shù)與DNA的復(fù)制PCR反應(yīng)通過(guò)控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。PCR反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是DNA復(fù)制,所以PCR反應(yīng)與DNA復(fù)制的原理相同,計(jì)算方法也大體相同。例如:PCR反應(yīng)中的目的片段一般以2n的方式積累,其中n為反應(yīng)循環(huán)次數(shù)。一個(gè)DNA片段在30次循環(huán)后反應(yīng)物中大約有10億個(gè)這樣的片段。2.PCR的常見問(wèn)題PCR實(shí)驗(yàn)很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性(檢測(cè)出非目的片段的擴(kuò)增,而未檢測(cè)出目的片段的擴(kuò)增)或假陰性(未檢測(cè)出任何片段的擴(kuò)增)的結(jié)果。PCR技術(shù)高度靈敏,極其微量的靶基因污染都會(huì)造成非目標(biāo)DNA片段的大量擴(kuò)增,因此模板DNA的污染是PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因。此外,樣品中存在靶基因的類似序列也可能造成假陽(yáng)性結(jié)果。為了避免因污染而造成的假陽(yáng)性結(jié)果,PCR操作時(shí)要注意做到隔離操作區(qū),分裝試劑,簡(jiǎn)化操作程序,使用一次性吸頭等。出現(xiàn)假陰性結(jié)果的常見原因有TaqDNA聚合酶活力不夠或其活性受到抑制;引物設(shè)計(jì)不合理;提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過(guò)關(guān)、PCR系統(tǒng)的建立欠妥當(dāng)及循環(huán)次數(shù)不夠,等等。當(dāng)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性的情況時(shí),應(yīng)首先在原來(lái)擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入TaqDNA聚合酶,并增加5~10次循環(huán)。為了防止假陰性結(jié)果的出現(xiàn),在選用TaqDNA聚合酶時(shí),要注意用活力高、質(zhì)量好的酶。盡管TaqDNA聚合酶對(duì)模板純度的要求不高,但也不允許有機(jī)試劑的污染。所以,在提取DNA模板時(shí),應(yīng)特別注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物。PCR擴(kuò)增的先決條件以及特異性的高低,很大程度上取決于引物與靶DNA的互補(bǔ)情況,尤其需要保證引物的3'端與靶基因互補(bǔ)。PCR的原理及應(yīng)用【例題1】

下列有關(guān)PCR的描述,不正確的是(

)A.是體外酶促合成特定DNA片段的一種技術(shù)B.引物一般采用人工合成的單鏈DNA片段C.PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加D.擴(kuò)增對(duì)象是氨基酸序列解析:PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù),它能以極少量的DNA為模板,以四種三磷酸脫氧核苷酸為原料,在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3'端連接脫氧核苷酸,短時(shí)間迅速?gòu)?fù)制上百萬(wàn)倍的DNA片段,其擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)方式增加。答案:D題型一題型二【例題2】

標(biāo)準(zhǔn)的PCR過(guò)程一般分為變性、復(fù)性、延伸三大步,這三大步需要的溫度依次是(

)A.94℃、40℃、72℃

B.72℃、40℃、94℃C.40℃、94℃、72℃

D.80℃、40℃、72℃解析:當(dāng)溫度上升到94~98

℃時(shí),雙鏈DNA變性成單鏈,稱之為變性;當(dāng)溫度迅速下降到40~60

℃時(shí),引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與單鏈DNA結(jié)合;當(dāng)溫度上升到72

℃左右時(shí),溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq

DNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈,稱為延伸。答案:A題型一題型二題型一題型二解析:從土壤中分離微生物的一般流程是土壤取樣→制備培養(yǎng)基→分裝→制備土壤稀釋液→接種培養(yǎng)→觀察。該實(shí)驗(yàn)步驟沒有問(wèn)題,但在前五步操作中都沒有進(jìn)行無(wú)菌操作,因而無(wú)法說(shuō)明分解纖維素的微生物一定來(lái)自于土壤。答案:(1)取樣工具應(yīng)提前滅菌;不能用蒸餾水,應(yīng)用無(wú)菌水;該操作應(yīng)在火焰旁進(jìn)行。(3)培養(yǎng)基分裝并加濾紙條后應(yīng)滅菌。(4)在稀釋土壤溶液的過(guò)程中,每一步都要在火焰旁。(5)接種應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。題型一題型二PCR基本操作與產(chǎn)物測(cè)定【例題3】

在PCR實(shí)驗(yàn)操作中,下列說(shuō)法不正確的是

(

)A.在擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)中需配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的瓊脂糖凝膠,制成電泳膠板B.離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán),防止液體外溢C.在檢測(cè)時(shí),需將膠板浸入溴化乙錠溶液染色5~10minD.離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部,提高反應(yīng)效果解析:在擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)中,需配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠,制作成電泳膠板。答案:A12341.有關(guān)PCR技術(shù),下列敘述不正確的是(

)A.用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20~30個(gè)核苷酸B.在用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA時(shí),DNA的復(fù)制過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制類似C.PCR反應(yīng)只需一定的緩沖溶液和DNA模板以及四種三磷酸脫氧核苷酸D.PCR一般經(jīng)歷25~30個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)分為變性、復(fù)性、延伸答案:C解析:PCR反應(yīng)中需要的條件有模板(DNA分子)、原料(4種三磷酸脫氧核苷酸)、酶(耐高溫DNA聚合酶)、引物和一定的緩沖液等。5612342.引物的作用是(

)A.打開DNA雙鏈B.催化合成DNA子鏈C.使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始復(fù)制DNAD.提供模板答案:C解析:DNA分子的復(fù)制具有方向性,即只能從引物的3'端開始,從子鏈的5'端向3'端延伸。引物的作用是與DNA聚合酶結(jié)合促使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始復(fù)制DNA。5612343.使用PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增的具體實(shí)驗(yàn)操作順序應(yīng)為

(

)①設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序②按配方準(zhǔn)備好各組分③用微量移液器在離心管中依次加入各組分④進(jìn)行PCR反應(yīng)⑤離心使反應(yīng)液集中在離心管底部A.②③⑤④①

B.①⑤③④②C.②③⑤①④

D.④②⑤③①答案:C解析:使用PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增前,首先按照PCR體系配方,依次將各組分加入離心管離心,使反應(yīng)液集中于試管底部,然后再設(shè)計(jì)好PCR儀的循環(huán)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。5612344.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中,需加入(

)A.耐高溫的解旋酶以保證DNA雙鏈完全解開B.2種已知核苷酸序列的引物以保證核苷酸鏈的延伸C.4種足量的核糖核苷酸以保證目的基因的擴(kuò)增D.一定量的鹽酸和氫氧化鈉溶液以維持pH的穩(wěn)定答案:B解析:在PCR過(guò)程中,解旋是通過(guò)加熱到94

℃實(shí)現(xiàn)的,不需要加入解旋酶。PCR過(guò)程中以解開的DNA的兩條鏈為模板,因此需要2種已知序列的引物分別與兩條模板鏈結(jié)合(注意由于DNA分子的兩條鏈?zhǔn)欠聪虻?2種引物會(huì)分別在DNA的兩端與互補(bǔ)的模板鏈結(jié)合)。PCR反應(yīng)的原料是4種三磷酸脫氧核苷酸。反應(yīng)溶液體系的pH依靠磷酸緩沖液維持穩(wěn)定。561234565.要使PCR反應(yīng)在體外條件下順利地進(jìn)行,需要嚴(yán)格地控制(

)A.氧氣的濃度

B.酸堿度C.溫度

D.大氣的濕度答案:C1234566.生物技術(shù)的迅速發(fā)展,給社會(huì)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)效益,受到社會(huì)廣泛重視。請(qǐng)回答下列生物技術(shù)方面的問(wèn)題。(1)Taq耐熱菌的發(fā)現(xiàn)和分離為基因工程的發(fā)展作出了突出貢獻(xiàn)。從培養(yǎng)液或自然環(huán)境分離Taq耐