Chapter20 高效液相色譜法課件

Chapter20高效液相色譜法黃河科技學(xué)院信建豪Chapter20高效液相色譜法一.定義：經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和實驗技術(shù)，高壓輸送流動相，高效固定相及高靈敏度檢測器，現(xiàn)代液相色譜分析方法。Chapter20高效液相色譜法二.與經(jīng)典液相色譜法相比

顆粒極細(xì)（一般為10

m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高；高壓輸液泵輸送流動相，流速快，分析速度快；高靈敏度檢測器，靈敏度大大提高。Chapter20高效液相色譜法三.與氣相色譜法相比氣相試樣液相試樣液相流動相氣體、容易轉(zhuǎn)變?yōu)闅怏w的液體氣體、液體、固體常用氫氣、氮?dú)饪捎玫娜軇┹^多氣相柱溫液相柱溫高柱溫常溫氣相流動相Chapter20高效液相色譜法第一節(jié)高效液相色譜法的主要類型和原理

一、主要類型 四類基本類型色譜法分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）化學(xué)鍵合相色譜法Chapter20高效液相色譜法

其他色譜類型親合色譜法（affinitychromatography；AC）手性色譜法（chiralchromatography；CC）膠束色譜法（micellarchromatography；MC）電色譜法（electrochromatography；EC）Chapter20高效液相色譜法二、化學(xué)鍵合相色譜法

1.定義：鍵合相色譜法(bondedphasechromatography；BPC)：以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法?；瘜W(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相Chapter20高效液相色譜法2.分類：正相（normalphase，NP）鍵合相色譜法：反相（reversedphase，RP）鍵合相色譜法：根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動相極性的相對強(qiáng)弱區(qū)分Chapter20高效液相色譜法（一）正相鍵合相色譜法

固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）或二羥基鍵合硅膠。流動相：非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑）適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì)Chapter20高效液相色譜法（二）反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠流動相：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑常用甲醇－水、乙腈－水等應(yīng)用：最廣。非極性至中等極性的組分，（還有有機(jī)酸、堿及鹽等極性組分）Chapter20高效液相色譜法

1.保留機(jī)制:疏溶劑理論（solvophobictheory）Chapter20高效液相色譜法流動相固定相組分組分分子被“擠出”“疏溶劑腔”保留Chapter20高效液相色譜法

2.保留行為的主要影響因素a.溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性）極性越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。 同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大； 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。b.固定相鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增加，溶質(zhì)的k也增大。硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶質(zhì)的k越大。Chapter20高效液相色譜法c.流動相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑溶劑比例：水的比例增加，使k增大中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的k增大pH：影響弱酸、弱堿的離解（離子抑制色譜法）Chapter20高效液相色譜法

把離子對試劑加入到含水流動相中，組分離子在流動相中與離子對試劑的反離子（counterion）生成中性離子對，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。反相離子對色譜法

(pairedion

chromatography；PICorionpairchromatography；IPC)Chapter20高效液相色譜法1.離子對模型33++()+3s3(+固定相+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH離子對mB+ABAmA(s流動相通式Chapter20高效液相色譜法2.影響容量因子的因素離子對試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的k增大。流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的k值最大.

Chapter20高效液相色譜法適用范圍：有機(jī)酸、堿、鹽、離子型和非離子型化合物的混合物。離子對試劑的選擇：分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）3.適用范圍和離子對試劑的選擇Chapter20高效液相色譜法第二節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動相及其選擇固定相應(yīng)符合下列要求：顆粒細(xì)且均勻；傳質(zhì)快；機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓；化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。Chapter20高效液相色譜法一、化學(xué)鍵合相色譜法的固定相（一）鍵合相的種類

1.非極性鍵合相：

非極性烴基，如C18﹑C8﹑C1與苯基等鍵合在硅膠表面；用于反相色譜Chapter20高效液相色譜法

2.弱極性鍵合相：醚基和二羥基等鍵合相

3.極性鍵合相：常用氨基﹑氰基鍵合相鍵合硅膠一般用于正相色譜Chapter20高效液相色譜法（二）鍵合相的性質(zhì)和特點

1.鍵合反應(yīng)硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷與硅膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng)

如：YWG－C18H37，無定形硅膠YWG上鍵合了十八硅烷基；SpherisorbODS，球形硅膠Spherisorb上鍵合了ODS。

Chapter20高效液相色譜法

2.鍵合相的性質(zhì)含碳量：含碳的百分?jǐn)?shù)覆蓋度：已反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例封尾（end-capping）：在鍵合反應(yīng)后，用三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，減少殘余硅醇基。Chapter20高效液相色譜法

3.鍵合相的特點使用過程中不流失；化學(xué)穩(wěn)定性好；適于梯度洗脫；載樣量大

4.注意：流動相的pH一般應(yīng)在2-8，否則會引起硅膠溶解；(也有適用寬pH范圍的鍵合相)。

Chapter20高效液相色譜法二、化學(xué)鍵合相色譜法的流動相

對流動相的要求：與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。對試樣有適宜的溶解度。與檢測器相適應(yīng)。純度高，粘度小。Chapter20高效液相色譜法（一）流動相對分離的影響n由色譜柱（固定相）性能決定，α主要受溶劑種類的影響，k受溶劑配比的影響。Chapter20高效液相色譜法（二）流動相的強(qiáng)度和選擇性

1.溶劑的極性（強(qiáng)度）正相色譜：溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強(qiáng)

2.溶劑的選擇性不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同混合溶劑（二元或多元流動相）Chapter20高效液相色譜法以反相色譜流動相的選擇為例：

反相色譜常用溶劑的強(qiáng)度因子水甲醇乙腈丙酮03.03.23.4二惡烷乙醇異丙醇四氫呋喃3.53.64.24.5Chapter20高效液相色譜法反相色譜法中混合溶劑的強(qiáng)度因子：

Chapter20高效液相色譜法（三）流動相最優(yōu)化方法簡介：1.根據(jù)snyder的溶劑選擇性分組，選擇具有顯著選擇性差異的溶劑。2.以其中一種溶劑與底劑組成的二元基礎(chǔ)溶劑A系統(tǒng)進(jìn)行實驗，調(diào)整溶劑配比，使組分的k在適宜的范圍內(nèi)。例：40%甲醇的水溶液：Chapter20高效液相色譜法3.計算確定具有等洗脫強(qiáng)度的另外兩個二元溶劑B和C的組成。如：4.以溶劑a、b、c為溶劑選擇三角形上的三個項點A、B、C。在ΔABC各點的洗脫強(qiáng)度均相等。在三角形三條邊上的任何一點，都可組成三元混合溶劑流動相。在三角形內(nèi)任何一點，都可組成四元溶劑流動相。Chapter20高效液相色譜法5.在ΔABC上選擇7或10個流動相進(jìn)行實驗，對實驗結(jié)果進(jìn)行分析，以色譜優(yōu)化指標(biāo)尋找確定最佳流動相。ABC①②③⑤0/0.5/0.5④0.5/0.5/0⑥0.5/0/0.5⑦0.33/0.33/0.33⑨0.16/0.67/0.160.16/0.16/0.67⑩⑧0.67/0.16/0.1640%甲醇溶液37.5%乙腈溶液26.7%四氫呋喃溶液Chapter20高效液相色譜法三、分離條件的選擇

HPLC中的速率理論1.渦流擴(kuò)散A=2λdp

球形、小粒度、均勻（RSD＜5%）固定相，勻漿高壓填充，以降低A。2.縱向擴(kuò)散B=2γDm可以忽略。

因為Dm很小，室溫操作，且U大于U最佳，則B項可以忽略。Chapter20高效液相色譜法3.傳質(zhì)阻抗固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略，因df極小流動相傳質(zhì)阻抗Cm

要求：dp小，Dm大Chapter20高效液相色譜法靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗：由于部分流動相在固定相微孔內(nèi)的滯留。

Csm∝dp2，Csm∝1/Dm，而Dm∝T/η要求:固定相dp、流動相η都小Chapter20高效液相色譜法

總結(jié)：

H=A+Cmu+Csmu原因：化學(xué)鍵合相，液體流動相結(jié)果：HPLC的實驗條件應(yīng)該是：①小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相；②低粘度流動相，流速不宜過快；③柱溫適當(dāng)。

Chapter20高效液相色譜法第三節(jié)高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)

Chapter20高效液相色譜法一、輸液系統(tǒng)（一）、高壓輸液泵恒流泵：在輸送流動相過程中流量恒定。常用柱塞式往復(fù)泵恒壓泵

Chapter20高效液相色譜法Chapter20高效液相色譜法輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕

Chapter20高效液相色譜法輸液泵操作注意事項：防止固體微粒進(jìn)入泵體流動相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完不超過規(guī)定的最高壓力流動相一般應(yīng)該先脫氣Chapter20高效液相色譜法（二）梯度洗脫裝置

高壓梯度洗脫低壓梯度洗脫Chapter20高效液相色譜法二、分離和進(jìn)樣系統(tǒng)

1.進(jìn)樣器進(jìn)樣閥（六通閥）、自動進(jìn)樣裝置2.色譜柱（column）由柱管和固定相組成分析柱、制備柱性能評價H、n、fs、k和α的重復(fù)性，或R。

Chapter20高效液相色譜法三、檢測系統(tǒng)（一）檢測器(detector)的主要性能要求：靈敏度（sensitivity）高（檢測限低）噪音（noise）低線性范圍（linearrange）寬重復(fù)性（repeatability）好適用范圍廣（通用型、專屬型）

Chapter20高效液相色譜法（二）紫外檢測器(ultravioletdetector)

1.檢測原理：朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律，響應(yīng)信號（吸光度）與濃度成正比A=εCl2.特點：靈敏度較高（10-6—10-9g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度洗脫，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。Chapter20高效液相色譜法3.局限：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。專屬型、濃度型檢測器4.分類：固定波長檢測器：254nm可變波長檢測器：Chapter20高效液相色譜法工作原理：復(fù)合光通過流通池，再進(jìn)入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時獲得各波長的信號強(qiáng)度，即獲得組分的吸收光譜。獲得三維光譜－色譜圖。用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量,判斷峰純度。

光電二極管陣列檢測器(photodiodearray

detector；PDAD)：Chapter20高效液相色譜法Chapter20高效液相色譜法Chapter20高效液相色譜法（三）熒光檢測器（fluorescencedetector；FD)1.檢測原理：化合物受紫外光激發(fā)后，發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的光，稱為熒光；熒光強(qiáng)度(F)與激發(fā)光強(qiáng)度(I0)及熒光物質(zhì)濃度(C)之間的關(guān)系為：

F=2.3QKI0εCl Q為量子產(chǎn)率，K為熒光效率，ε為摩爾吸光系數(shù)，l為光徑長度。

F=KCChapter20高效液相色譜法2.特點：選擇性好，專屬型檢測器靈敏度比紫外檢測器高（檢測限10-10g/ml）3.激發(fā)波長(

ex)和發(fā)射波長(

em)的選擇Chapter20高效液相色譜法（四）、安培檢測器1.原理：在電極間施加一恒定電位，當(dāng)電活性組分經(jīng)過電極表面時，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電量的大小(Q)符合法拉第定律：Q=nFN.Chapter20高效液相色譜法2.應(yīng)用范圍：凡具有氧化還原活性的化合物，或經(jīng)過衍生化具有氧化還原活性的化合物均能進(jìn)行檢測。Chapter20高效液相色譜法（五）蒸發(fā)光散射檢測器1.原理：

色譜柱流出液霧化器氣體小液滴加熱的漂移管氣溶膠強(qiáng)光或激光光電二極管檢測器Chapter20高效液相色譜法Chapter20高效液相色譜法散射光強(qiáng)度(I)與氣溶膠中組分的質(zhì)量：

特點：通用型檢測器靈敏度較低Chapter20高效液相色譜法第四節(jié)高效液相色譜分析方法

一、定性分析方法1.色譜鑒定法2.化學(xué)鑒定法3.兩譜聯(lián)用鑒定法Chapter20高效液相色譜法二、定量分析方法：1.外標(biāo)法：Y=a+bx2.內(nèi)標(biāo)法：內(nèi)標(biāo)校正曲線法

Ai/As=a+bCChapter20高效液相色譜法內(nèi)標(biāo)對比法

校正因子法Chapter20高效液相色譜法例：校正因子法測定復(fù)方炔諾酮片中炔諾酮的含量ODS色譜柱、甲醇－水（60：40）流動相、檢測器UV280nm、對硝基甲苯為內(nèi)標(biāo)物。