流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用課件

流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室馬莉流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5什么是流式細(xì)胞儀？

（FlowCytometer,FCM)在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)細(xì)胞各種物理及生物特征的一種儀器InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)懸浮液中的細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行快速測(cè)量和多參數(shù)檢測(cè)的細(xì)胞分析技術(shù)，是上世紀(jì)70年代在單細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對(duì)細(xì)胞理化特性，諸如大小、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等進(jìn)行快速測(cè)量并分類收集的高科技技術(shù)。它綜合了激光技術(shù)，計(jì)算機(jī)技術(shù)，流體力學(xué)，細(xì)胞化學(xué)，單克隆抗體，熒光化學(xué)，分子生物學(xué)等各門學(xué)科，在對(duì)細(xì)胞群體的亞群進(jìn)行定量分析時(shí)，具有其它手段無法比擬的優(yōu)越性。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞儀特點(diǎn)及檢測(cè)標(biāo)本特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測(cè)的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞(2)血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5細(xì)胞周期及DNA倍體分析在臨床腫瘤中應(yīng)用免疫指標(biāo)檢測(cè)在臨床腫瘤中應(yīng)用監(jiān)測(cè)癌基因與抗癌基因表達(dá)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用監(jiān)測(cè)分析腫瘤多藥耐藥細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞周期與DNA倍體分析的基本原理通過DNA檢測(cè)進(jìn)行細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期：G0、G1、S、G2、M細(xì)胞周期中DNA含量：G0/G1--2C（二倍體）S期--2C→4C、G2/M-4C（四倍體）流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5DNA熒光染料特異性與細(xì)胞DNA結(jié)合DNA含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度與DNA所吸收熒光分子多少成正比。最常用的熒光染料：碘化丙啶（PI）FCM分析細(xì)胞周期的基本方法流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5DNA含量的表示細(xì)胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指數(shù)（DNAindex，DI)表示相對(duì)含量，一個(gè)正常的二倍體細(xì)胞峰，其G0/G1期細(xì)胞DNA含量為2C，DI值為1.0。DI=（樣本G0/G1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)）/（正常二倍體標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞峰平均熒光道數(shù)）流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5DNA倍體的判定標(biāo)準(zhǔn)二倍體的DI為1.0，四倍體的DI為2.0。變異系數(shù)（CV）：標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞CV

≤3%，新鮮組織標(biāo)本≤5%。DNA倍體判定標(biāo)準(zhǔn)，DNA非整倍體具有2個(gè)分離的G0/G1峰，并根據(jù)DI值判斷DNA倍體。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5

對(duì)于一個(gè)正常人體的二倍體細(xì)胞群，G0/G1期占85-90%以上，S+G2M細(xì)胞占10-15%以下。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5以二倍體參考細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞DNA含量定為2C值DI=1.0，基于標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞的CV在5%以下，判定標(biāo)準(zhǔn)即；DNA二倍體=2C+2CV，DNA異倍體不等于2C+2CV。1.DI=1.0±0.1(0.9~1.10)為二倍體。2.DI=1.0±0.15(0.85~1.15)為近二倍體。3.DI=2.0±0.1(1.90~2.10)為四倍體。4.DI>2.10為多倍體5.其余DI均為異倍體。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞周期與DNA倍體的分析方法（一）單細(xì)胞懸液制備1、新鮮或冰凍實(shí)體組織：酶消化法、機(jī)械法、化學(xué)試劑處理法等。剪碎法：取新鮮或冰凍（浸泡于生理鹽水中）實(shí)體組織0.5cm3，眼科手術(shù)剪剪碎，加入生理鹽水，300目尼龍膜過濾，200g離心5min，生理鹽水洗滌二次。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5半自動(dòng)機(jī)械法單細(xì)胞制備系統(tǒng)：是目前較為理想的方法，簡(jiǎn)便，實(shí)用，單細(xì)胞獲取率較高，特別適用于臨床應(yīng)用。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5由于各種實(shí)體組織成份、特性各不相同，對(duì)不同的實(shí)體組織必須采用不同的單細(xì)胞分散方法，才能使單細(xì)胞產(chǎn)量高，細(xì)胞損傷小。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5新鮮組織單細(xì)胞懸液制備注意事項(xiàng)：①手術(shù)或活檢的新鮮組織及時(shí)浸泡于生理鹽水。

②立即送檢

③冷凍或冷藏。（室溫過高，放置時(shí)間過長(zhǎng)而造成組織自溶發(fā)生，影響檢測(cè)結(jié)果）流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗52、石蠟包埋組織：擴(kuò)大了FCM分析應(yīng)用范圍，并可以對(duì)大量臨床隨訪病例資料進(jìn)行重新研究與利用。標(biāo)體制備：①二甲苯脫蠟法②組織清潔劑脫蠟法③甲酸雙氧水處理法。注意事項(xiàng)：①脫蠟完全：檢驗(yàn)方法加入100%乙醇，如果無絮狀物浮起，即可視為脫凈，反之則沒有脫凈。②掌握消化時(shí)間，避免細(xì)胞核消化掉。③切片薄厚適宜，過薄碎片大多，過厚不宜脫蠟。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗53、骨髓、血液及體液：去除紅細(xì)胞及濃縮有核細(xì)胞。①骨髓及血液：淋巴細(xì)胞分離液②體液：一般需經(jīng)300g離心5min，PBS洗滌二次。如體液中紅細(xì)胞太多，可用溶血素去除紅細(xì)胞。注意事項(xiàng)：①每次同時(shí)制備對(duì)照血液淋巴細(xì)胞標(biāo)本，作為二倍體細(xì)胞外參標(biāo)準(zhǔn)。②視標(biāo)本中有核細(xì)胞濃度的高低進(jìn)行調(diào)整，一般細(xì)胞濃度調(diào)至5~10*109/L。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5（二）DNA染色及FCM分析1、PI染色法應(yīng)用BD公司CycleTESTIMKKit（1）單細(xì)胞懸液制備（2）加入A液250ul，放置10分鐘。（3）加入B液200ul，放置10分鐘。（4）加入冷C液200ul，避光放入2-8oC冰箱10分鐘。置2~8oC冰箱避光保存，4h內(nèi)FCM檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5（5）流式細(xì)胞分析：流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)與設(shè)置、數(shù)據(jù)獲取用Cellquest軟件，SSC/FSC、FL2設(shè)置為線性放大，閾值設(shè)為FL2。收集圖：FSC/SSC和FL2W/FL2A散點(diǎn)圖、

FL2-H或FL2-A熒光直方圖數(shù)據(jù)分析：ModFit軟件流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5

流式細(xì)胞周期與DNA倍體分析在臨床腫瘤學(xué)中應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5FCM分析在腫瘤早期診斷和監(jiān)別診斷中的應(yīng)用DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個(gè)重要標(biāo)志，有助于癌變的早期診斷。淋巴瘤在病理形態(tài)學(xué)還不能作出診斷前，F(xiàn)CM倍體分析可以提供準(zhǔn)確的診斷信息。DNA非整倍體的交界瘤應(yīng)按惡性腫瘤對(duì)待。形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示有惡變的可能。DI可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5FCM分析DNA含量和DNA倍體的預(yù)后意義通常認(rèn)為DNA含量高，非整倍體的腫瘤惡性程度高，預(yù)后差，二倍體或近二倍體腫瘤預(yù)后好。除DI及倍體外，反映腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)的S期細(xì)胞比例也被作為判斷預(yù)后的指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用馬麗5FCM分析在腫瘤脫落細(xì)胞學(xué)檢查中的應(yīng)用FCM分析診斷腫瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)現(xiàn)DNA非整倍體細(xì)胞峰診斷為癌。(2)