HIV檢測(cè)及臨床意義

HIV檢測(cè)及臨床意義中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院艾滋病確認(rèn)試驗(yàn)室尚紅——HIV的發(fā)現(xiàn)Montagnie(LAS)1983.Science220:868-871Gallo(HTLV)1983.Science220:865-86Levy(ARV)1984.Science225:840-842

1986國(guó)際病毒分類委員會(huì)：HIVHIV-21986

西非中國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)的HIV/AIDS

病例數(shù)（1985~）2HIV感染可通過(guò)兩種途徑檢測(cè)直接檢測(cè)病毒或其構(gòu)成部分檢測(cè)人體HIV免疫反應(yīng)——HIV特異性抗體從感染到血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)有一段窗口期，平均為1-3個(gè)月，有一小部分HIV感染者出現(xiàn)延遲反應(yīng)HIV感染后抗原和抗體的變化

及其與疾病關(guān)系HIV感染人體后出現(xiàn)一過(guò)性病毒血癥，6-8周后血清抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)，病毒滴度減少，在隨即的5-8年無(wú)癥狀帶毒期里HIV抗體一直存在，但病毒難查到。進(jìn)入AIDS期后血漿中病毒再次出現(xiàn)。故診斷HIV感染多數(shù)時(shí)間用抗體檢測(cè)診斷，極初期（窗口期）用抗原檢測(cè)。HIV抗體診斷 目前臨床上實(shí)際應(yīng)用的是測(cè)定特異性HIV抗體，包括初篩和確認(rèn)試驗(yàn)。一、檢測(cè)試劑篩查試劑必須是HIV-1/2混合型、經(jīng)國(guó)家藥物監(jiān)督管理局注冊(cè)同意、批批檢合格、臨床評(píng)估質(zhì)量?jī)?yōu)良、在有效期內(nèi)的試劑。目前常用的篩查試劑有酶聯(lián)免疫、顆粒凝集和其他迅速診斷試劑。采供血機(jī)構(gòu)進(jìn)行血液篩查應(yīng)采用酶聯(lián)免疫試劑。自采自供血的單位必須進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)，在尚未建立艾滋病篩查試驗(yàn)室的偏遠(yuǎn)地區(qū)可由通過(guò)培訓(xùn)的技術(shù)人員在規(guī)定的場(chǎng)所用迅速試劑進(jìn)行血液篩查。62、確認(rèn)試劑必須經(jīng)國(guó)家藥物監(jiān)督管理局注冊(cè)同意。確認(rèn)試劑包括免疫印跡試驗(yàn)、條帶免疫試驗(yàn)及免疫熒光試驗(yàn)試劑。目前以免疫印跡試劑最為常用。ELISA措施： 目前最常用的初篩試驗(yàn)，自1985年初次檢測(cè)HIV-1抗體的試劑盒供市以來(lái)，已從第一代的全病毒抗原間接法發(fā)展到第四代的以重組的多肽抗原及抗P24抗體包被的雙夾心法，使窗口期縮短了2-3周。四代艾滋病酶聯(lián)免疫試劑比較solidphasespecificdetectionofconjugate第一代病毒裂解液HIV-1IgG抗體HIV-1-IgG抗體第二代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2IgG抗體HIV-1/-2IgG抗體第三代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-OIgM/IgG抗體HIV-1/-2/-O病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-O第四代病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24AbIgM/IgG抗體HIV-1/-2/-Op24抗原病毒裂解液重組抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗體Closingthewindow<infectivity=>4thgen3rdgen=>

=>1st-2ndgenHIVantigenIgMabIgGabDetectionlimit<=window第一代試劑檢測(cè)IgG抗體，第三代試劑檢測(cè)IgG、IgM抗體,第四代試劑同步檢測(cè)IgG、IgM抗體和P24抗原使窗口期縮短。檢測(cè)成果的匯報(bào)和處理陰性反應(yīng)出具HIV抗體陰性匯報(bào)，假如近期有高危行為，如性亂、注射毒品等，或有急性流感樣癥狀等狀況，為排除“窗口期”的也許，可以進(jìn)行HIV-1P24抗原或HIV核酸檢測(cè)，或2－3個(gè)月后來(lái)再做抗體檢測(cè)。篩查試驗(yàn)呈陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)反應(yīng)，可出具“HIV抗體待復(fù)查”的匯報(bào)，不能出陽(yáng)性匯報(bào)。樣本初篩檢測(cè)一陰一陽(yáng)均陽(yáng)性反應(yīng)陰性報(bào)告送確認(rèn)重復(fù)檢測(cè)陰性報(bào)告均陰性反應(yīng)陽(yáng)性反應(yīng)原有試劑＋另一種原理初篩試劑選用初篩試劑陰性反應(yīng)HIV抗體初篩檢測(cè)流程圖迅速診斷試劑：采用乳膠凝集、免疫斑點(diǎn)和免疫層析三種原理迅速、不需特殊儀器敏感度、特異度低于ELISA，且價(jià)格貴合用于血站覆蓋不到的邊遠(yuǎn)地區(qū)/都市大醫(yī)院急診手術(shù)前檢查迅速診斷陽(yáng)性成果還需經(jīng)ELISA措施驗(yàn)證HIV抗體確認(rèn)常用確實(shí)認(rèn)試驗(yàn)措施是免疫印跡法（WB）。免疫印跡試劑有HIV-1/2混合型和單一型。一般先用HIV-1/2混合型試劑進(jìn)行檢測(cè)蛋白印跡試驗(yàn)（WB） ——廣泛使用確實(shí)認(rèn)試驗(yàn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳將純化的HIV蛋白抗原分開(kāi)后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。標(biāo)本中存在的HIV抗體與條帶上的抗原結(jié)合，再加入酶偶聯(lián)的抗人IgG抗體和底物，在抗原抗體結(jié)合的部位會(huì)出既有色條帶其可檢測(cè)標(biāo)本中針對(duì)HIV不一樣抗原的抗體，故被用做確認(rèn)試劑。不一樣的研究機(jī)構(gòu)有不一樣的鑒定原則WB成果鑒定原則組織陽(yáng)性陰性WHO2ENV+GAG+POL無(wú)條帶或只有P17FDA（USA）1ENV+p24/p31無(wú)條帶CHINA２ENV或１ENV+p24無(wú)HIV-1特異性條帶“不確定”(±)：出現(xiàn)HIV-1特異性條帶，但帶型局限性以 確認(rèn)陽(yáng)性，每三個(gè)月隨訪一次，共兩次， 仍屬可疑，判為陰性HIV-1抗體特異帶HIV-2抗體特異帶envgp160/gp120gp41gp140/gp105、gp36，也可為gp125/gp80、gp36gagp55、p24、p17（或p18）p56、p26、p16polp66（或p65）、p51、p31p68、p53、p34

HIV抗體確認(rèn)檢測(cè)流程圖免疫印跡法(HIV1/2混合型)HIV-1陽(yáng)性反應(yīng)可疑反應(yīng)出現(xiàn)HIV-2指帶HIV-1陽(yáng)性匯報(bào)可疑反應(yīng)陽(yáng)性反應(yīng)陰性反應(yīng)匯報(bào)HIV-2血清學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)匯報(bào)必要時(shí)測(cè)核酸陰性匯報(bào)免疫印跡法（HIV-2）每3個(gè)月隨訪一次，共2次，仍屬可疑，則作陰性匯報(bào)如隨訪期間出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)則匯報(bào)陽(yáng)性陰性反應(yīng)陰性匯報(bào)

P24抗原測(cè)定（一）合用范圍HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷。HIV-1陽(yáng)性母親所生嬰兒的鑒別診斷。第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測(cè)呈陽(yáng)性反應(yīng)，但HIV-1抗體確認(rèn)陰性者的診斷。監(jiān)測(cè)病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。（三）成果匯報(bào)和解釋

1、HIV-1P24抗原的陽(yáng)性成果必須通過(guò)中和試驗(yàn)確認(rèn)。2、HIV-1P24抗原陽(yáng)性僅作為HIV感染的輔助診斷根據(jù)，不能依此確診。3、HIV-1P24抗原陰性成果只表達(dá)在本試驗(yàn)中無(wú)反應(yīng)，不能排除HIV感染。HIV核酸檢測(cè)

1、輔助診斷某些非經(jīng)典的抗體反應(yīng)，尤其是不確定反應(yīng)時(shí)，RNA的測(cè)定可提供非常有用的證據(jù)。單純使用RNA測(cè)定不能完全確定感染與否，但當(dāng)RNA測(cè)定出現(xiàn)較高拷貝數(shù)的陽(yáng)性成果時(shí)（>1000）提醒感染發(fā)生的也許性非常大。使用此指標(biāo)應(yīng)綜合其他檢測(cè)數(shù)據(jù)和樣品背景狀況進(jìn)行綜合分析與判斷。222、窗口期輔助診斷在窗口期抗原峰出現(xiàn)前后一般出現(xiàn)一種病毒載量的高峰，一般此高峰高于發(fā)病時(shí)的血漿病毒水平，初期病毒RNA測(cè)定具有特殊的意義。目前國(guó)際上正在嘗試使用這種檢測(cè)對(duì)采供血樣品進(jìn)行多種樣品混合后的RNA檢測(cè)以減少窗口期傳播的殘存危險(xiǎn)度。3、病程監(jiān)控由于HIV感染發(fā)生后病毒載量的變化具有一定規(guī)律，并且這種變化與疾病的進(jìn)程有著親密的有關(guān)性。一般在感染后無(wú)癥狀期內(nèi)發(fā)生的臨床癥狀很難與AIDS發(fā)病時(shí)的癥狀區(qū)別，病毒載量測(cè)定可以協(xié)助醫(yī)生判斷一種剛發(fā)生的癥狀與否與HIV感染有關(guān)。4、指導(dǎo)治療方案及療效測(cè)定并非在任何狀況下感染者都應(yīng)當(dāng)進(jìn)行抗病毒治療，這不僅是經(jīng)濟(jì)上的原因，更重要的是在于抗病毒藥物的副作用和療效。一般在病毒載量到達(dá)一定水平后（如>35000-50000拷貝/毫升）才具有良好的效果。只有通過(guò)治療后病毒水平的檢測(cè)才能確定治療與否有效，一般治療后病毒水平減少50%才被認(rèn)為臨床有效。通過(guò)監(jiān)測(cè)病毒滴度反應(yīng)療效255、預(yù)測(cè)疾病進(jìn)程HIV疾病進(jìn)程與病毒載量的關(guān)系十分親密，觀測(cè)感染者病毒RNA水平可大體預(yù)測(cè)其發(fā)病的也許。如右圖所示，病毒載量與6年發(fā)病率的關(guān)系為：<500時(shí)5.4%，501-3000時(shí)16.6%，3001-10000時(shí)31.7%，10001-30000時(shí)55.2%，>30000時(shí)則為80%。26定性檢測(cè)HIV核酸檢測(cè)有定性和定量?jī)深?，定性檢測(cè)用于HIV感染的輔助診斷。一般使用PCR或RT-PCR技術(shù)，使用分子生物學(xué)試驗(yàn)室通用的擴(kuò)增試劑，引物可來(lái)自文獻(xiàn)或自行設(shè)計(jì)，應(yīng)盡量涵蓋所有的或常見(jiàn)的毒株，也可使用復(fù)合引物。27

定量檢測(cè)定量檢測(cè)常用于監(jiān)測(cè)HIV感染者的病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。目前常用的HIVRNA定量測(cè)定措施有逆轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn)（RT-PCR）、核酸序列擴(kuò)增試驗(yàn)（NASBA）、分支DNA雜交試驗(yàn)（bDNA）等，這幾種進(jìn)口試劑盒的最低檢測(cè)限為20-50拷貝/毫升按照儀器讀數(shù)匯報(bào)成果，應(yīng)注明使用的試驗(yàn)措施、樣品種類和樣品量。測(cè)定成果不不小于最低檢測(cè)限時(shí)，應(yīng)注明最低檢測(cè)限水平。注意低于最低檢測(cè)限的成果不能排除HIV感染。應(yīng)附上儀器打印的數(shù)據(jù)。28

RocheBayer(前Chiron)Organon技術(shù)RT-PCRbDNANuclisensHIV-1QT結(jié)果比較約2xbDNA2.02.0版結(jié)果約為RT-PCR的50%，3.0版結(jié)果與Roche基本相同與Roche基本相同優(yōu)點(diǎn)通過(guò)了FDA認(rèn)證假陽(yáng)性結(jié)果較bDNA少1.5版對(duì)A-G亞型有較好的反應(yīng)性操作時(shí)間較少對(duì)A-G亞型有較好的反應(yīng)性通過(guò)了FDA認(rèn)證可使用多種組織，如生殖道分泌液對(duì)A-G亞型有較好的反應(yīng)性檢測(cè)范圍大缺點(diǎn)操作容易污染測(cè)定范圍較?。ㄏ鄬?duì)于NASBA）少數(shù)生物樣品反應(yīng)受抑制，如精液、乳汁和唾液早期版本對(duì)部分亞型反應(yīng)性較差，1.0版對(duì)非B亞型的樣品反應(yīng)性普遍較差，（5）版通過(guò)改進(jìn)對(duì)O亞型檢測(cè)能力較差對(duì)低值樣品檢測(cè)的特異性較差。無(wú)內(nèi)部質(zhì)量控制，尤其在3.0版中為單孔檢測(cè)時(shí)，無(wú)法控制由于提取或加樣操作的失誤。不同版本間差異較大，2.0版約為RT-PCR50%，3.0版結(jié)果與Roche基本相同表明兩個(gè)版本間差異可能達(dá)到50%。對(duì)除血漿、血清外的大部分體液樣品無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)抗凝劑敏感，只能使用EDTA。早期版本（NASBA）對(duì)部分亞型（G亞型）反應(yīng)性差。操作復(fù)雜，樣品提取(不使用自動(dòng)提取儀時(shí))和測(cè)定反應(yīng)時(shí)需要進(jìn)行大量的手工操作。不適合一次大量檢測(cè)，ECL讀數(shù)儀每次只能進(jìn)行12個(gè)樣品的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)、外誤差相對(duì)較大。檢測(cè)范圍標(biāo)準(zhǔn)版(Amplicor1.0及1.5)

400-750,000c/mL超敏版(Ultra-Direct1.0and1.5):

50-75,000c/mLbDNA3.0版:100-500,000c/mLNuclisensHIV-1QT:40-10,000,000

c/mL(取決于樣品量)多種HIV定量檢測(cè)措施的比較有關(guān)不一樣HIV定量檢測(cè)措施的選擇目前用于統(tǒng)一不一樣定量措施檢測(cè)值的原則品還沒(méi)有問(wèn)世不一樣定量措施成果之間還無(wú)法直接比較同一病人治療前后提議用同一措施進(jìn)行HIV定量檢測(cè)艾滋病免疫指標(biāo)的檢測(cè)

伴隨政府加速對(duì)國(guó)產(chǎn)抗艾滋病藥物上市的同意，我國(guó)艾滋病人的治療已經(jīng)出現(xiàn)了曙光。艾滋病臨床治療中多種免疫指標(biāo)(CD4+、CD8+T細(xì)胞等)對(duì)于確定感染狀態(tài)、預(yù)測(cè)發(fā)病、評(píng)價(jià)藥物療效及新藥開(kāi)發(fā)具有重要的作用。CD4T淋巴細(xì)胞：（流式細(xì)胞術(shù)） CD4T細(xì)胞是HIV的重要靶細(xì)胞,感染后伴隨病程進(jìn)展，CD4T細(xì)胞不停下降 <500/mm3——有臨床診斷意義 <200/mm3——AIDS[CDC]病程進(jìn)展，AIDS診斷和療效觀測(cè)的指標(biāo)HIV感染幾周內(nèi)，出現(xiàn)類流感癥狀，也稱為血清陽(yáng)轉(zhuǎn)期，CD4細(xì)胞的數(shù)量減少。隨之出現(xiàn)的免疫應(yīng)答可以控制急性癥狀，恢復(fù)CD4細(xì)胞的數(shù)量，但并不能清除病毒。伴隨CD4細(xì)胞不停下降，當(dāng)降至500/ul左右時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)機(jī)會(huì)性感染或其他疾病，進(jìn)入癥狀期。當(dāng)CD4低于200/ul時(shí)，即進(jìn)入艾滋病期。CD4+T淋巴細(xì)胞不不小于350/ul（結(jié)合病毒載量，確定治療時(shí)機(jī)）有效治療8周后CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加50/ulHAART無(wú)效CD4+T細(xì)胞數(shù)量下降CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能逐漸喪失C