病原生物與免疫學(xué)基礎(chǔ)（第5版）課件 第十四章 病原生物學(xué)實訓(xùn)項目

病原生物學(xué)實訓(xùn)項目

1．熟悉顯微鏡的結(jié)構(gòu)、功能和使用方法

2．掌握細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)

3．掌握細(xì)菌生長現(xiàn)象

4．初步學(xué)會細(xì)菌接種法及無菌操作

5．驗證微生物在自然界的分布

6．了解細(xì)菌涂片標(biāo)本的制作與革蘭染色實驗?zāi)康?.微生物實驗室規(guī)則介紹

2.顯微鏡的使用及保護(hù)方法

3.細(xì)菌形態(tài)觀察（基本形態(tài)觀察、特殊結(jié)構(gòu)觀察、革蘭染色示教培養(yǎng)基的制備過程）

4.常用培養(yǎng)基介紹

5.細(xì)菌的接種法及無菌操作

6.細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長現(xiàn)象觀察

7.細(xì)菌的分布檢查實驗內(nèi)容1．進(jìn)入實驗室前必須穿好白大衣，離室后脫下、反折。必要時配戴口罩。白大衣要勤洗換。

2．書包和衣物等不得帶入實驗室，必要的用具放在指定的位置。

3．實驗室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙、飲食，以免感染。

4．保持實驗室內(nèi)安靜，不得高聲談笑或隨便走動，以利集中精力完成實驗操作。

5．實驗操作時，若不慎將傳染標(biāo)本、菌液等污染桌面，污染衣物、書本、手指及地面等意外事故，應(yīng)立即報告帶教老師，及時作出處理。微生物實驗室規(guī)則介紹6．用過的吸管、滴管、試管和玻片等應(yīng)放在指定的污物缸或盛有消毒液的搪瓷缸內(nèi)，不得放在桌面上或水槽內(nèi)，不得隨便沖洗。

7．正確使用實驗儀器，不得隨意撥動電器開關(guān)等；節(jié)約實驗材料，如損傷儀器或器材，應(yīng)及時報告帶教老師進(jìn)行登記。

8．實驗完畢后清理桌面，將需要培養(yǎng)的物品放入指定的培養(yǎng)箱或溫室中。顯微鏡要擦干凈后方可歸還顯微鏡室，用過物品歸還原處，并清潔和消毒桌面；洗手離開實驗室，值日生要認(rèn)真清掃實驗室，關(guān)閉門、窗、水、電后方可離開實驗室。微生物實驗室規(guī)則介紹顯微鏡的使用及保護(hù)方法目鏡物鏡光源載物臺載物臺調(diào)節(jié)器細(xì)調(diào)節(jié)器粗調(diào)節(jié)器開關(guān)1、將顯微鏡放置在平整干凈的實驗臺面上，鏡座距離試驗臺面邊緣3-4cm。

2、調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，上旋載物臺至最高，低倍鏡觀察，邊觀察邊下旋，找到理想視野范圍，在標(biāo)本欲檢部位滴1滴香柏油，然后轉(zhuǎn)換成油鏡。從側(cè)面觀察，緩慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使油鏡頭浸沒在油滴內(nèi)，當(dāng)油鏡頭幾乎接觸玻片時停止轉(zhuǎn)動，用肉眼觀察接目鏡，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使鏡筒上升（只能上升，不能下降，以防壓碎標(biāo)本片和損壞油鏡），待看到模糊物像時，再調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)節(jié)器，直至清晰看到細(xì)菌等微生物形態(tài)。

顯微鏡的使用及保護(hù)方法（1）顯微鏡是精密的光學(xué)儀器，使用時應(yīng)注意愛護(hù)，各部分結(jié)構(gòu)不得隨意拆卸，以免損壞。

（2）取送搬移顯微鏡時，要一手持鏡臂，一手托鏡座，平端在胸前，輕拿輕放。

（3）鏡頭必須保持清潔，油鏡使用后應(yīng)立即用擦鏡紙拭去鏡油。若油鏡頭上的油跡未擦干凈，應(yīng)先將二甲苯滴在擦鏡紙上擦拭鏡頭，再用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上殘留的二甲苯。

（4）顯微鏡擦凈后，接物鏡轉(zhuǎn)成“八”字形并降低，下降聚光器，送至顯微鏡室，對號入座。顯微鏡的使用及保護(hù)方法細(xì)菌形態(tài)觀察基本形態(tài)

球菌

葡萄球菌（G+球形、堆積狀排列）鏈球菌（G+球菌、鏈狀排列）細(xì)菌形態(tài)觀察基本形態(tài)

球菌

肺炎雙球菌（G+球菌）腦膜炎奈瑟菌（G-球菌）細(xì)菌形態(tài)觀察基本形態(tài)

桿菌、弧菌

大腸埃希菌（G-桿菌）

水弧菌（G-弧菌）

細(xì)菌形態(tài)觀察特殊結(jié)構(gòu)

芽孢

破傷風(fēng)梭菌（芽孢位于頂端）

細(xì)菌形態(tài)觀察

特殊結(jié)構(gòu)

鞭毛

傷寒桿菌（周鞭毛）

細(xì)菌形態(tài)觀察特殊結(jié)構(gòu)

莢膜

產(chǎn)氣莢膜梭菌（負(fù)染法）

革蘭染色原理革蘭染色的原理目前存在三種假說：1．通透性學(xué)說

革蘭陽性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入；革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)疏松，肽聚糖層薄，含大量脂質(zhì)，乙醇易滲入。2．等電點(diǎn)學(xué)說

革蘭陽性菌等電點(diǎn)（pI2-3）比革蘭陰性菌（pI

4-5）低，在相同pH條件下，革蘭陽性菌所帶負(fù)電荷比革蘭陰性菌多，故與帶正電荷的結(jié)晶紫染料結(jié)合牢固，不易脫色。3．化學(xué)學(xué)說

革蘭陽性菌菌體含大量核糖核酸鎂鹽，可與碘、結(jié)晶紫牢固結(jié)合，使已著色的細(xì)菌不被乙醇脫色；革蘭陰性菌菌體含核糖核酸鎂鹽很少，故易被脫色。草酸銨結(jié)晶紫初染1min95%乙醇脫色0.5min碘液媒染1min稀釋石炭酸復(fù)紅復(fù)染0.5min涂片干燥固定鏡檢制片脫色媒染初染復(fù)染

革蘭染色操作鏡檢1、鑒別細(xì)菌；2、診斷疾病；3、選擇用藥。革蘭染色結(jié)果：G+菌為紫色；G-菌為紅色。革蘭染色臨床意義：

革蘭染色結(jié)果、臨床意義1．操作因素涂片太厚或太薄，固定時菌體過分受熱，以及脫色時間長短，都會影響染色結(jié)果。2．染色因素所有染液應(yīng)防止染液蒸發(fā)而改變濃度，特別是盧戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用；涂片積水過多會改變?nèi)疽簼舛?，影響染色效果，如脫色用的乙醇?5%為宜，濃度降低會增強(qiáng)其脫色能力。3．細(xì)菌因素細(xì)菌的菌齡不同，革蘭染色結(jié)果也有差異，一般以18-24h的培養(yǎng)物染色效果最好，菌齡過長影響細(xì)菌染色性。

革蘭染色結(jié)果影響因素準(zhǔn)確稱量－混合溶解－矯正pH值－分裝－滅菌－檢定－保存培養(yǎng)基的制備過程常用培養(yǎng)基·半固體培養(yǎng)基含0.5%凝固劑（瓊脂）·各類液體培養(yǎng)基不含凝固劑（瓊脂）·各類固體培養(yǎng)基含2%-3%凝固劑（瓊脂）的培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基各類液體培養(yǎng)基接種環(huán)液體培養(yǎng)基的接種·接種法：液體培養(yǎng)基

·生長現(xiàn)象：表面生長渾濁生長沉淀生長液體培養(yǎng)基中細(xì)菌生長現(xiàn)象接種針半固體培養(yǎng)基·接種法：·生長現(xiàn)象：擴(kuò)散生長無擴(kuò)散生長

動力陽性動力陰性半固體培養(yǎng)基穿刺接種法固體培養(yǎng)基·平板接種法：平行劃線法液體培養(yǎng)基中細(xì)菌生長現(xiàn)象固體培養(yǎng)基·平板接種法：四區(qū)分離劃線1區(qū)2區(qū)3區(qū)4區(qū)菌苔菌落常用培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基·斜面接種法：羽毛狀生長1.接種環(huán)伸入到斜面底部向上劃線2.接種環(huán)再伸入到底部“之”字形向上劃線細(xì)菌的分布檢查1.空氣中的細(xì)菌檢查根據(jù)空間特點(diǎn)計算采樣點(diǎn)布置布置采樣皿開蓋采樣一定時間恒溫培養(yǎng)結(jié)果計算細(xì)菌的分布檢查2.水中的細(xì)菌檢查水樣做一定稀釋后注入平皿中，恒溫培養(yǎng)清點(diǎn)菌落形成單位，計算后，