生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院《APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制》項目申報

1項目申請書項目名稱APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長及指導(dǎo)教師起止年月21、申請書所列各項內(nèi)容均須實事求是填寫，表達(dá)明確嚴(yán)謹(jǐn)，簡明扼要。模板可網(wǎng)上下載、自行加頁。2、申請書首頁只填寫項目負(fù)責(zé)人。"項目編號"一欄可不填。3、項目負(fù)責(zé)人所在院系須認(rèn)真審核，簽署推薦意見并加蓋公章后3名稱APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制所屬學(xué)科學(xué)科一級門：理學(xué)生物科學(xué)申請金額起止年月2023年7月至2024年7月負(fù)責(zé)人姓名XX性別男民族漢出生年月2003年5月學(xué)號聯(lián)系電話指導(dǎo)教師XX聯(lián)系電話負(fù)責(zé)人曾經(jīng)參與1.參與基金項目"構(gòu)建3D工程化共培養(yǎng)模型探究乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展及藥效評估”中材料物理性能的檢測；指導(dǎo)教帥承擔(dān)科1.構(gòu)建3D工程化共培養(yǎng)模型探究乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展及藥效評估，國家自然科學(xué)基金(青年基金),在研，主持。2.山東省高等學(xué)校青創(chuàng)團隊課題“功能性生物材料開發(fā)與類器官構(gòu)建及應(yīng)用的研究",在研，主持。3.基于工程化腫瘤模型探究乳腺癌肺轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展機制，山東省4.基于脫細(xì)胞基質(zhì)肺轉(zhuǎn)移模型中細(xì)胞間及細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用的研究，濰坊醫(yī)學(xué)院博士基金，在研，主持。指導(dǎo)教師對本項目的支持情況1.指導(dǎo)教師對本項目中實驗設(shè)計進(jìn)行指導(dǎo)完善，對項目書的撰寫進(jìn)2.指導(dǎo)教師在本項目中多糖結(jié)構(gòu)分析、支架的制備、組織工程腫瘤模型的構(gòu)建及生物學(xué)檢測、藥物活性檢測等驗，可在整個項目的實施過程中進(jìn)行階段、任務(wù)、步驟的規(guī)范和確認(rèn)，保證項目的順利進(jìn)行。3.對本項目中前期預(yù)實驗需要的試劑及耗材的花費以及可能超過4項目組主要成員學(xué)號專業(yè)班級所在學(xué)院項目中的分工2021級生物制藥生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院多糖生物活性檢測及模型構(gòu)建2020級生物制藥生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物學(xué)實驗及數(shù)2022級生物技術(shù)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院支架性能檢測及3D模型構(gòu)建2022級生物技術(shù)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院多糖活性檢測肺癌的患病率和死亡率均居癌癥前位，臨床治療仍是一大挑戰(zhàn)耐藥性。從天然產(chǎn)物及中草藥中尋找毒性低且療效好的抗腫瘤活性成分成為研究熱轉(zhuǎn)移有抑制作用，對肺癌患者維持治療具有臨床可行性，使用APS協(xié)同順鉑可顯著改善臨床癥狀。作為腫瘤生物學(xué)研究的工具而言，三維(Three-dimen于此，本研究擬基于脫細(xì)胞豬肺基質(zhì)/明膠支架構(gòu)建體外3D肺癌模型，并進(jìn)一步探究APS協(xié)同順鉑抑制體外抗3D工程化肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作(1)考察APS和順鉑物理化學(xué)及結(jié)構(gòu)，結(jié)合已有文獻(xiàn)，確定其生物活性發(fā)揮的可能因素；(2)分別制備脫細(xì)胞豬肺基質(zhì)dECM及dECM/明膠復(fù)合支架，對支架表觀形貌、結(jié)構(gòu)及5察支架上細(xì)胞分布、滲透、生長增殖情況以評估構(gòu)建模型的可行性，考察3D模型相比(3)利用3D工程化腫瘤模型初步探究APS協(xié)同順鉑對肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制，為APS在動物體內(nèi)發(fā)揮減毒增效作用提供實驗依據(jù)，從而為APS臨床應(yīng)用于肺癌患者(a)查閱文獻(xiàn)及預(yù)實驗確定APS的最佳濃度范圍，通過SEM、活死染色、CCK及DAPI染色考察APS對肺癌細(xì)胞株是否具有直接的抑制活性；(b)考察APS聯(lián)合順鉑兩藥對肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用的關(guān)系，通過檢測考察APS變化，APS糖協(xié)同順鉑是否增強肺癌A549細(xì)胞的促凋亡作用及抑制細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)(a)經(jīng)過查閱文獻(xiàn)和前期預(yù)實驗，采用胰蛋白酶、TritonX-100和SDS結(jié)合對新鮮的豬肺組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，并使用0.1M鹽酸溶液與胃蛋白酶結(jié)合溶解脫細(xì)胞基質(zhì)，脫細(xì)胞優(yōu)的脫細(xì)胞組合方案。(b)根據(jù)豬肺基質(zhì)脫細(xì)胞過程膠原及糖胺聚糖的損失情況，確定加入脫細(xì)胞肺基質(zhì)、明膠兩者的質(zhì)量比。根據(jù)人體肺泡結(jié)構(gòu)、孔徑大小和肺臟機械強度(c)通過試驗設(shè)計探究不同預(yù)凍溫度、預(yù)凍速率、預(yù)凍時間對干燥dECM表觀形貌、孔dECM力學(xué)性能、熱穩(wěn)定性、孔隙率、交聯(lián)度及降解率等物理性能的影響，明確最佳的(d)系統(tǒng)檢測交聯(lián)后的dECM/明膠用于組織工程模型的理化性能(宏觀及微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率、孔尺寸、吸水率、生物力學(xué)性能);初步確定復(fù)合支6(3)APS協(xié)同順鉑抑制3D培養(yǎng)肺癌生長的作用及機制(a)通過試驗設(shè)計確定肺癌細(xì)胞-脫細(xì)胞基質(zhì)腫瘤模型用于研究藥物作用的適宜細(xì)胞密度及APS、順鉑體外作用肺癌細(xì)胞的適宜濃度；對比無APS干預(yù)組，從其對免疫細(xì)胞及其細(xì)胞周期的阻滯層面探究APS協(xié)同順鉑抑制肺癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制。養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞生長的影響，并考察其抑制機制。(c)探究APS協(xié)同化順鉑抑制體外3D培養(yǎng)工程化模型中肺癌細(xì)胞生長的作用及機制，主要包括干擾細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方面。觀察APS聯(lián)合順鉑對肺癌A549細(xì)胞細(xì)(四)國、內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展動態(tài)肺癌所有病例的80%至85%,近二十年肺癌的發(fā)病率每年以11%左右的速度遞增1]。由藥物治療肺癌已迫在眉睫2。越來越多的科學(xué)研究表明，來自天然資源(植物、動物和真菌)的多糖在預(yù)防或治療癌癥方面具有廣闊的前景。目前最具代表性的多糖是香菇多糖的抗腫瘤生物活性是通過直接殺傷腫瘤、增強免疫功能和協(xié)同化療實現(xiàn)的3。副作用、改善患者身體狀況及延長生存時間等polysaccharides,APS)應(yīng)用于臨床且療效顯著,但是大多作為輔助抗癌藥物使用，其抗論依據(jù)，使黃芪多糖更好的在臨床治療中發(fā)揮作用。APS是從黃生物活性成分(圖1A-B),可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹B淋巴細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，并誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。黃芪多糖的7免疫調(diào)節(jié)作用使其有望用于治療多種疾病，包括癌癥、感染、I型糖尿病、哮喘和自身免疫性疾病。其中，抗癌作用最為突出5。AACacD種藥理作用。目前，黃芪多糖具有開發(fā)改善或治療不同疾病的藥物的巨大潛力。更重順鉑(圖1C)是多種惡性腫瘤的臨床常用鉑類化療藥物，能破與各種生物分子相互作用。根據(jù)軟硬酸堿(HSAB)理論，PtII是一種軟酸。與HS甘肽等含硫親核試劑以及蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基7。然而，它們反應(yīng)，特別是含氮的供體，如DNA和RNA中的核堿基，蛋白質(zhì)和多肽中的組氨酸殘8性的化療藥物-順鉑，具有普遍的癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)，但是仍然難免有部分肺癌患者仍會的耐受性及依從性。據(jù)報道，65-95%的順鉑可在給藥后24小時內(nèi)與血漿蛋白結(jié)合。剩與順鉑攝取。順鉑引起CRT1濃度的降解，導(dǎo)致癌細(xì)胞順鉑積累降低。CTR1表達(dá)越高的細(xì)胞順鉑積累量越高，對順鉑的敏感性越高，同時順鉑也可誘導(dǎo)細(xì)胞膜細(xì)胞凋亡0。前為修復(fù)受損DNA提供了時間。順鉑激活檢查點激酶Chk1和Chk2,阻滯。取消這些抑制可能導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，迫使癌細(xì)胞在未修復(fù)的DNA損傷面前過早地重新進(jìn)入細(xì)胞周期，從而通過NER途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。腫瘤抑制蛋白p53是一種短保持穩(wěn)定性，因此它也被稱為“基因組的守護(hù)者”[。敏感性用于腫瘤的治療。在體外實驗中，雖有少部分研究發(fā)現(xiàn)APS可以直接抑制癌細(xì)抑制三維培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移的可能作用機制，為黃芪多糖通過發(fā)揮其抗細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞14]。腫瘤微環(huán)境的特點是低氧、低營養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用是通過整合素調(diào)節(jié)的，從而產(chǎn)生了對腫瘤的反饋回路。整合素直接與ECM成分相互作用，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲提供必要的牽引力。9圖2.原發(fā)性腫瘤進(jìn)展和TME內(nèi)復(fù)雜的相互作用[13目前研究癌癥進(jìn)展和抗癌藥物篩選的主要工具是腫瘤模型，現(xiàn)有模型大致分為三類：2D細(xì)胞模型、3D模型和動物培養(yǎng)模型。截止到目前為止，2D細(xì)胞培養(yǎng)仍然是大多數(shù)腫瘤研究的主要方式，但2D培養(yǎng)缺乏腫瘤在體內(nèi)的微環(huán)境，無法真實反映腫瘤在養(yǎng)系統(tǒng)不能反映腫瘤組織的高復(fù)雜性和生物學(xué)特征。因此，細(xì)胞在2D培養(yǎng)環(huán)境中對藥|篩選和療效研究中最常用的動物模型是皮下移植瘤，它允許復(fù)雜的腫瘤-基質(zhì)細(xì)胞相互立的，腫瘤細(xì)胞被注射到皮膚下6。然而，一個完整功能免疫系統(tǒng)的缺陷也可能影響腫導(dǎo)，在癌癥相關(guān)研究中是必不可少的。傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)和動物模型已被證明在解釋癌細(xì)胞行為和解釋可能機制的假說方面是有效的。然而，一種定義良好的3D診斷和治療應(yīng)用中獲得了濃厚的興趣。生物學(xué)研究表明，細(xì)胞在3D建模環(huán)境中可能具和活性[17]。典模式依賴于生物材料支架、細(xì)胞和生物活性分子的組合來協(xié)調(diào)組織的形成和在宿主環(huán)境中的整合。組織工程的一個重要途徑是開發(fā)生物材料，通過有效地運輸細(xì)胞群體和治療劑，以及提供賦予組織足夠機械性能的結(jié)構(gòu)支架來促進(jìn)再生過程。隨著組織工程學(xué)的快速發(fā)展，運用同樣理念產(chǎn)生的3D組織工程腫瘤技術(shù)受到了眾多關(guān)注，呈現(xiàn)出多樣化發(fā)展趨勢?；谥Ъ苄纬赡[瘤球的模型中支架材料的使用提高了3D培養(yǎng)模型的多樣性，增加了基質(zhì)的剛度和孔隙率等因素，以模擬某些腫瘤的微環(huán)境，這些物理因素的加入可以改變基因表達(dá)和細(xì)胞信號傳遞[18。A圖3.細(xì)胞外基質(zhì)主要成分示意圖[19近年來，組織工程學(xué)的概念逐漸深入到生命科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，其傳統(tǒng)設(shè)計方案中基于支架或基質(zhì)材料的3D組織培養(yǎng)系統(tǒng)，能夠盡可能地接近天然ECM的生物、物理及生化環(huán)境，并通過各類的模塊化組織工程技術(shù)，促進(jìn)其在替代或修復(fù)臨床組織缺損之外的非治療醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。組織工程支架的制備已成為科學(xué)研究熱點，各種各樣的生物材料和一系列的技術(shù)用于制備組織工程支架，用于身體中不同組織和器官的再生。無論組織的類型，支架在設(shè)計和應(yīng)用時一些關(guān)鍵的因素是必須被考慮的。細(xì)胞外基質(zhì)不僅在確定肺的三維結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)方面起著重要作用，而且在包括細(xì)胞黏附、分化、生長和增殖在內(nèi)的各種細(xì)胞活動中也起著重要作用。該基質(zhì)由多種結(jié)構(gòu)和功能成分組成，如膠原、層粘連蛋白、彈性蛋白和纖維連接蛋白(圖3)。天然ECM中存在的一些關(guān)鍵分子，包括蛋白質(zhì)和生長因子，也是信號傳遞所必需的19。成功的脫細(xì)胞手術(shù)將消除細(xì)胞成分，同時保留由膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白組成的肺ECM,并將準(zhǔn)確保留呼吸道和血管復(fù)雜分級分支結(jié)構(gòu)。隨著脫細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，脫細(xì)胞基質(zhì)廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域并取得重大進(jìn)展(圖4)。與此同時，科學(xué)家們也積極開發(fā)利用脫細(xì)胞基質(zhì)的新的應(yīng)用領(lǐng)域，目前的是，每種支架都有其特定的生化和機械信號，進(jìn)而產(chǎn)生不同的細(xì)胞Temperature/Force/PrMesenchymalStemCelMesenchymalStemCel ChemicalNon-lonic/BasesHypCombined&NovelDecellularizationMethods Postprocessing&RecellularizationMe圖4.脫細(xì)胞ECM的制備及其在組織工程的應(yīng)用[20]多糖保護(hù)重要器官免受毒性，還通過改變自噬或觸發(fā)凋綜上所述，研究APS抗癌機制有助于為其臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。APS具有抗腫瘤的作用，其機制復(fù)雜，既往的實驗研究表明，APS對腫瘤細(xì)胞G1期具有阻滯作用，為APS抗腫瘤及協(xié)同化療藥物抗腫瘤研究提供了實驗依據(jù)，APS協(xié)同順鉑抑制了體外3D工程化肺癌細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移，對于抗腫瘤的體外研究而言，3D組織工程腫瘤模型可有效彌補傳統(tǒng)2D培養(yǎng)及體內(nèi)動物模型的不足，為研究腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)所具有的生化及機械性能。目前，組織/器官脫細(xì)胞基質(zhì)可極大程度保留原胞外基質(zhì)成分，其優(yōu)越的生物相容性、3D拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及生物力學(xué)性能進(jìn)一步改善腫瘤細(xì)胞生長微環(huán)境，為后續(xù)組織工程腫瘤構(gòu)建提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。基于脫細(xì)胞基質(zhì)/明膠構(gòu)建的腫瘤模型更加模擬體內(nèi)腫瘤生長，使得APS聯(lián)合鉑類藥物對體外抗癌結(jié)果更加具有[1]周彩存，王潔，王寶成，等.中國非小細(xì)胞肺癌免疫檢查點抑制劑治療專家共識(2020年版)[J].中國肺癌雜志，2021,24(4):217.[2]NagasakaM,GadgeelSnon-smallcelllungcancer[J].Expertreviewofantican[3]RenY,LiS,SongZ,etal.Theregulatoryrolesphytochemicalsinliverdiseases[J].Nutrients,2022,14(11):2303.[4]PandyaU,DhuldhajU,SahayNS.Bioactivemushroompolysaccharidesasantitumor:anoverview[J].Naturalproductresearch,2019,33(18):2668-2680.[5]LiW,SongK,WangS,etal.AnC,2019,98:685-695.[6]ZhengY,RenW,ZhangL,etal.AreviewofthepharmacologicalactionofAstragaluspolysaccharide[J].FrontiersinPharmacology,2020,11:349.[7]SunCY,ZhangQY,ZhengGJ,cancercellstocisplatin[J].Biomedic[8]QiL,LuoQ,ZhangY,etal.Advancesintoxicologicalresearchofthcisplatin[J].Chemicalresearchintoxicology,2019,32(8):1469-1486.[9]WangL,ZhaoX,FuJ,etal.TheroleoftumourmetabolismFrontiersinmolecularbiosciences,2021,8:691795.[10]曲萌.自噬性細(xì)胞死亡在順鉑與ATR抑制劑聯(lián)合所致有絲分裂災(zāi)難中的作用研[11]liYangY,wenLinZ,tingHeP,etal.InhibitoryeffectofAstragalusPolysacchari[J].BiologicalandPharmaceuticalBu[12]方星辰，?？〔吵夸h.基于天然多糖構(gòu)建納米藥物遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].中[13]deVisserKE,JoyceJA.Theevolvingtumormicroenvironment:Frtometastaticoutgrowth[J].CancerCell,2023,41(3):374-403.[15]KechagiaJZ,IvaskaJ,Roca-CusachsP.Integrinsasmicroenvironment[J].NatureReviewsMolecula[16]JungJ,SeolHS,ChangS.Thegenerationandapplicationofpatient-derivedxmodelforcancerresearch[J].Cancerresearchandtreatment:officialjournalofKoreanCancerAssociation,2018,50(1):1-10.[17]張寧.仿生細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境的構(gòu)建及對細(xì)胞行為的調(diào)控和應(yīng)用[D].東南大學(xué)，2018,19(6):1764-1782.engineeringtissueandorgan-specificmicroenvironmentstrendsandemergingstrategiesintissueen[21]ChakrabortyJ,RoyS,GhoshS.Regulationofdecellularizedmaresponse[J].Biomaterialsscience,2020,8(5):1194-1215.[22]DeshpandeNU,JayakannanM.Cisplatin-stitchedpolysasynergisticcancertherapyoftripleantagonisticdrugs[J].Biomacromolecules,2017,18(1sensitivity/resistancetocisplatinchemotherapy:roleofmicro[J].Cellularsignalling,2021,78:109871.(五)創(chuàng)新點與項目特色(1)通過體外考察APS協(xié)同順鉑對肺癌細(xì)胞株的抑制作用，APS可以多靶點作用，參與整體調(diào)控，具有改善或逆轉(zhuǎn)耐藥的優(yōu)勢，通過使用中草藥APS來減輕順鉑造成的各類毒性，提高抗癌活性。(3)著眼于基礎(chǔ)到轉(zhuǎn)化研究，通過體外3D肺癌肺轉(zhuǎn)移工程化模型評估APS協(xié)同順鉑抑制肺癌生長的作用及機制，為APS用于臨床化療輔助治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本項目總體技術(shù)路線如圖5所示：APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制細(xì)胞是否有抑制作用結(jié)構(gòu)成分分析材料投入比例巨噬細(xì)<脫細(xì)胞肺基質(zhì)dECM/明膠復(fù)合支架的制備dECM/明膠溶液交聯(lián)后凍干成型性是否滿足要求生長作用機制APS抑制肺癌細(xì)胞生長的作用機制肺癌細(xì)胞接種質(zhì)結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能確定最優(yōu)比例的dECM/明膠復(fù)合支架養(yǎng)肺癌細(xì)胞生長作用3D工程化肺癌模型構(gòu)建及細(xì)胞行為分析順鉑APS協(xié)同順鉑抑制體外三維工程化肺癌發(fā)(定植生長及遷移)的作用及機制蛋白的調(diào)節(jié)機制分析圖5.本項目總體技術(shù)路線之一。3D肺癌組織工程模型探究APS聯(lián)合化療藥物減毒增效的抗腫效果及其作用機制，為APS輔助肺癌臨床治療提供實驗基礎(chǔ)是本項目要解決的另一關(guān)鍵問題。(3)預(yù)期成果代物。同時，我們希望利用此3D工程化腫瘤模型探究APS協(xié)同順鉑體外抑制肺癌生長轉(zhuǎn)移的作用及機制，為APS臨床用于肺癌輔助治療提供更多實驗依據(jù)；為APS在肺癌們也希望此模型用于評估其它臨床前抗肺癌藥物的治療效果。具體成果預(yù)期有如下幾末，減少批次差異性，最大限度降低因APS結(jié)構(gòu)及組成的不同對后續(xù)其生物活性的影(2)保證高脫細(xì)胞效率前提下，減小豬源性肺組織基質(zhì)成分的損失，制備盡可能保行為及對化療藥物敏感性等證明組織工程3D腫瘤模型用于研究肺癌生物學(xué)行為及作為(4)通過3D腫瘤模型探究APS協(xié)同順鉑抑制肺癌生長及轉(zhuǎn)移作用及機制，明確APS提高化療藥物療效，為APS輔助肺癌臨床治療提供更多實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。期刊或核心期刊發(fā)表論文1篇，申請國家發(fā)明專利1項。(七)項目研究進(jìn)度安排量、純度、微觀結(jié)構(gòu)、分子量及單糖組成等理化性質(zhì)的檢測手段；熟悉APS在抗腫瘤用效果，確定合適的脫細(xì)胞方案，制備脫細(xì)胞肺基質(zhì)/明膠支架并對其微觀結(jié)構(gòu)、支架孔徑、孔隙率、吸水率、機械性能等進(jìn)行多種物理性能檢測解順鉑耐藥和多器官毒性背后的分子機制，聯(lián)合中藥成分APS減輕其毒性，充分發(fā)揮死活染色、CCK、免疫熒光等檢測手段考察細(xì)胞在支架粘附、滲透、活性、生長增殖情況，評估復(fù)合支架的生物相容性及構(gòu)建的腫瘤模型作為藥物篩選平臺的可行性，總?cè)旧?、常?guī)組織學(xué)檢測等手段考察APS協(xié)同順鉑對三維培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移的影響，并考察其抑制機制。探究APS協(xié)同化療藥物抑制體外3D培養(yǎng)工程化模型中(八)已有基礎(chǔ)項目成員由1名指導(dǎo)教師、1名大三、1名大二及2名大一學(xué)生組成，均從屬于生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，涉及生物技術(shù)、生物制藥及生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)。(1)學(xué)生方面：學(xué)開具備一定的專業(yè)基礎(chǔ)知識和科學(xué)思維能力。同時，自入學(xué)析問題和解決問題的能力，以上均為本項目(2)指導(dǎo)教師方面：指導(dǎo)教師近年來從事干細(xì)胞與組織工程、生物材料和抗腫瘤等目指導(dǎo)教師主持國家自然科學(xué)基金青年基金1項，主持山東省青創(chuàng)團隊項目1項和山東省青年基金1項，主持濰坊醫(yī)學(xué)院博士基金項目1項，參與2項國家科學(xué)自然基金面上|前期實驗中已經(jīng)制備過豬源性脫細(xì)胞肺基質(zhì)dECM且考察單純肺基質(zhì)的生物相容性及細(xì)胞在支架的分布及滲透情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞在dECM培養(yǎng)第3天，細(xì)胞之間相互連接且增殖形成腫瘤球。第7天，支架表面及內(nèi)部腫瘤球隨處可見。第14天，腫瘤球尺寸明顯增大，且與周圍腫瘤球進(jìn)一步相連。培養(yǎng)至21天，由于與相鄰集落的相孔壁(橙色箭頭)及骨架(藍(lán)色箭頭)上的粘附和伸展(圖6B)。構(gòu)建物的Hoechst染色像進(jìn)行不同程度旋轉(zhuǎn)呈現(xiàn)了細(xì)胞在支架的分布(圖6B,I-II)。A標(biāo)記死細(xì)胞數(shù)逐漸增多且呈劑量和時間依賴性。1FU作用后細(xì)胞內(nèi)5-FU處理組腫瘤球數(shù)量和尺寸低于未加藥組。加藥5天后，CM實驗組仍能觀察到很多胞活率分別是83.46±2.6%和79.04±2.43%。然而，5-FU作用3天后細(xì)胞活率明顯降低。加藥5天后，盡管CM進(jìn)一步抑制細(xì)胞生長，但是其作用效果明顯低于5-FU組(圖7B)。05-A5A5給藥后細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高。相比未處理組，實驗組細(xì)胞F-actin表達(dá)并沒有明顯區(qū)別，但是5-FU給藥后F-actin熒光強度顯著下調(diào)。此外，DAPI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)CM(1000μg/mLAPS)和5-FU給藥3天后，部分細(xì)胞出現(xiàn)從支架脫落的現(xiàn)象。APS(1000μg/mL)介導(dǎo)CM組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)略微下調(diào)，但是5-Bcl-2表達(dá)顯著下降(P<0.05)。CM和5-FU干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)明顯升高(圖8C)。統(tǒng)計學(xué)分析表明，給藥處理2天時，CM組雖然提高Bax/Bcl-2的并無顯著性差異。加藥處理4天后，CM組Bax/Bcl-2的比值顯著提高(P<0.05),但其比值仍明顯低于5-FU作用組(圖8D)。CC22圖8.APS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞上清促進(jìn)細(xì)胞凋亡機制備，已裝備倒置和正置熒光顯微鏡、CCD攝像裝置以及Imageplus圖象分析軟件、紅流式細(xì)胞儀、動物活體化學(xué)發(fā)光和熒光成像系統(tǒng)、DNA/RNA合成儀、數(shù)碼凝膠圖器。另外，學(xué)校具有豐富的國內(nèi)外紙質(zhì)版和電子版文獻(xiàn)資料，方便項目成員進(jìn)行查閱，無。開支科目預(yù)算經(jīng)費(元)主要用途階段下達(dá)經(jīng)費計劃(元)前半階段用于項目所需試劑、1.業(yè)務(wù)費測試費和版面費(1)計算、分析、測試費用于激光共聚焦顯微鏡和SEM測試費(2)能源動力費(3)會議、差旅費(4)文獻(xiàn)檢索費(5)論文出版費論文版面費2.儀器設(shè)備購置費3.實驗裝置試制費4.材料費模型及生物學(xué)檢測所需的耗材及試劑學(xué)校批準(zhǔn)經(jīng)費本項目利用體外3D工程化肺癌模型探究黃芪多糖協(xié)同化療藥物順鉑發(fā)揮抗導(dǎo)和支持，確保項目的順利完成。導(dǎo)師(簽章):203年5月了日同意年月日山東省高等學(xué)校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目項目編號項目名稱APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用XX項目級別國家級(√)按計劃進(jìn)行、()進(jìn)度提前、()進(jìn)度滯后(起止時間)項目研究成果(已取得的成果)項目成果名稱中藥單體抗腫瘤應(yīng)用基礎(chǔ)與臨床前景論文(在投)2論文(在投)二、項目季度報告(項目執(zhí)行的進(jìn)展情況，取得了哪些成績，是否達(dá)到預(yù)期效果，以及在項目的開展過程中還存在哪些問題。)本項目執(zhí)行開始日期為2023年7月，項目持續(xù)時間為2023.07-2024.0過去3個月，目前在進(jìn)行支架的制備以及對支架形態(tài)進(jìn)復(fù)合支架的制備材料。具體的技術(shù)路線圖呈現(xiàn)如下：APS20請的p.德是兩有同卜四成分分析E加的基即JECW30工程化弱焰橫型構(gòu)調(diào)盟交聯(lián)及各No(定植生長及遷移)的作用及機制滿APS協(xié)同睡的制體外30工程化所事生長及轉(zhuǎn)移的作用及機AP5的高及那船細(xì)田(定植生長及遷移)的作用及機否結(jié)束制腳應(yīng)婦的是否有和制用e2長的作性長作用前期預(yù)實驗嘗試過脫細(xì)胞肺基質(zhì)/明膠復(fù)合支架的制備，實驗結(jié)果并不理想，因而對實驗方案及技術(shù)路線進(jìn)行了調(diào)整。目前正在進(jìn)行的部分具體過程及結(jié)果如下：第一批支架的制備：使用聚乙二醇、絲膠蛋白、殼聚糖三種材料進(jìn)行復(fù)合支架的制備：殼聚糖(CS)聚乙二醇(PEG)絲膠蛋白(SS)總濃度按照上述濃度配置50ml體系的溶液，分別稱取相應(yīng)質(zhì)量的藥品，先將稱取好的絲膠蛋白、后充分?jǐn)嚢枞芙狻嚢枞芙夂?，取出轉(zhuǎn)子，進(jìn)行超聲除泡，該步驟循環(huán)兩到三次，待氣泡充分從溶液中揮發(fā)出來后，用小藥匙或者移液槍將氣泡除去。最后將溶液進(jìn)行加板，分別在24孔板上做好標(biāo)記，將除泡后的混合溶液加入到孔板中，注意加入過程中不能出現(xiàn)氣泡。加板完成干燥后所得支架如圖3A所示，第一組支架從孔板中取出時發(fā)現(xiàn)支架出現(xiàn)明顯的掉屑的現(xiàn)象(圖3B),說明該組支架的藥品濃度或配比不適宜。對三組支架切下上下表面加入交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)浴鍋中貼上封口膜進(jìn)行攪拌溶解所得混合溶液為交聯(lián)劑。隨后將支架加入交聯(lián)劑后室溫交聯(lián)12h。交聯(lián)12h后對支架進(jìn)行水洗，將三組支架分別放入水中后，觀察到前兩組的支架出現(xiàn)部分溶解的現(xiàn)象(圖3C)。說明這兩組支架配比或濃度不適宜。第三組支架形態(tài)完好，因而對其進(jìn)行水洗(圖3D),將該組支架放置于調(diào)速多用振蕩器上，將轉(zhuǎn)速設(shè)置為130并在此轉(zhuǎn)速下震蕩30min,以便充分洗去支架中的交聯(lián)劑。之后將支架再次預(yù)凍12h后，冷凍干燥24h,得到最終的支架。第二批支架的制備：使用明膠和絲膠蛋白進(jìn)行支架的制備：絲膠蛋白(SS)明膠(Gel)通過上述步驟對支架進(jìn)行制備。一次冷凍干燥后，5%和6%復(fù)合支架均出現(xiàn)中空現(xiàn)象，4%復(fù)合支架部分出現(xiàn)中空，部分形態(tài)保持良好，因而只對4%復(fù)合支架中形態(tài)完好的支架進(jìn)行后續(xù)處理。用刀片小心切除支架上表面后使用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，結(jié)果觀察到支架形態(tài)發(fā)生明顯變結(jié)果可觀察到支架部分凹陷且斷裂嚴(yán)重，經(jīng)過查找文獻(xiàn)得知，明膠和絲膠蛋白具有強親水性，支架材料中缺少非親水性的材料且原本的交聯(lián)試劑作用效果并不理想，從而導(dǎo)致支架形態(tài)無法維持，出現(xiàn)中部裂開的現(xiàn)象。第三批支架的制備：通過總結(jié)前兩批支架出現(xiàn)的問題結(jié)合文獻(xiàn)的查閱，改用海藻酸鈉、明膠、絲膠蛋白作為復(fù)合支架的制備材料。明膠(Gel)海藻酸鈉(SA)絲膠蛋白(SS)按照上述濃度配置50ml體系的混合溶液，分別稱取相應(yīng)的藥品(圖7A),將稱取好的藥品加入37℃水浴鍋中攪拌溶解。待藥品完全溶解后對混合溶液進(jìn)行超聲除泡(圖7B)。由于混合溶液過于粘稠，將液體除泡之后放在37℃水浴鍋中進(jìn)行慢速旋轉(zhuǎn)過夜處理(圖7C),以便使混合溶液中的氣泡充分排出。溶液氣泡完全排出后將混合溶液進(jìn)行加板，加入24孔板后，進(jìn)行預(yù)凍和冷凍干燥處理，最終得到支架如圖8。由圖可以看出，所制備的海藻酸鈉/明膠/絲膠蛋白支架為微黃色多孔結(jié)構(gòu)，三個比例的支架宏觀無明顯區(qū)別。之后將加入氯化鈣和EDCNHS進(jìn)行交聯(lián)及二次凍干處理，考察此次制備的復(fù)合支架方案是否可行。如果滿足實驗需求，將進(jìn)一步對復(fù)合支架進(jìn)行孔隙率、吸水率、微觀結(jié)構(gòu)、紅外、機械強度等物理性能的考察。同時，對復(fù)合支架進(jìn)行體內(nèi)外生物相容性的檢測。圖8.Gel/SA/SS復(fù)合支架一次凍干后形貌已使用項目研究經(jīng)費：2500元已報銷金額：1500_元未報銷金額：1000元項目經(jīng)費開支情況備注論文版面費專利申請費調(diào)研、差旅費打印、復(fù)印費相關(guān)文件打印資料費試劑等耗材費其它五、指導(dǎo)教師意見：(包括項目的組織實施、進(jìn)度、預(yù)期效果、經(jīng)費使用等情況)2023年11月28日季度檢查結(jié)果類別限期整改不合格濰坊醫(yī)學(xué)院項目編APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制XX項目級別國家級項目進(jìn)展情況(√)按計劃進(jìn)行、()進(jìn)度提前、()進(jìn)度滯后主要研究階段(起止時間)研究內(nèi)容完成情況制備工程化肺癌模型中ECM替代物完成項目研究成果(已取得的成果)序號項目成果名稱成果形式1中藥單體抗腫瘤應(yīng)用基礎(chǔ)與臨床前景論文(在投)2論文(在投)二、項目中期報告(項目執(zhí)行的進(jìn)展情況，取得了哪些成績，是否達(dá)到預(yù)期效果，以及在項目的開展過程中還存在哪些問題，3000字以內(nèi))本項目執(zhí)行開始日期為2023.07,項目持續(xù)時間為2023.07-2024.07,為期1年，目前過去一半時間，已經(jīng)完成了前期復(fù)合支架的制備、支架相關(guān)的物理性能檢測以及HE染色評估A549結(jié)構(gòu)明膠/海藻明膠/海藻養(yǎng)肺癌細(xì)胞生長作用細(xì)胞上清CM細(xì)胞是否有抑制作用肺癌細(xì)胞生長作用機制用機制巨噬細(xì)的制備及EQ\*jc3\*hps14\o\al(\s\up3(接),癌)EQ\*jc3\*hps14\o\al(\s\up3(種),細(xì))EQ\*jc3\*hps14\o\al(\s\up3(肺),胞) 材料投入比例 明膠/海藻酸鈉/絲膠蛋白溶液交聯(lián)后凍干比例的明膠/海藻酸鈉/是否滿意Yes結(jié)束圖1.本項目總體技術(shù)路線及已完成部分通過總結(jié)前期對支架制備過程中出現(xiàn)的問題以及查閱文獻(xiàn)，最后選取了海藻酸鈉、明膠、和力學(xué)性能檢測等。具體過程及結(jié)果如下：1.復(fù)合支架的制備稱取三組質(zhì)量分別為0.25g、0.5g、0.75g的絲膠蛋白，三組質(zhì)量為0質(zhì)量為1g的海藻酸鈉，加入到50mL純水中，加入轉(zhuǎn)子，放入40℃水浴鍋中并持續(xù)攪拌，使其完全溶解，制備成絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉混合溶液。取出轉(zhuǎn)子，將混合溶液置于超聲機中超聲3次，每次20min,以便使混合溶液中的氣泡溢出。每次超聲后用移液槍吸去混合溶液中漂浮在表面的氣泡，超聲后在攪拌器上慢速攪拌過夜保證去除所有氣24孔板中并置于-20℃冰箱中預(yù)凍過夜后，將其放入冷凍干燥機(冷井溫度：-80℃)中干燥28h,獲得總濃度為3.5%、4%、4.5%的絲膠蛋白-明膠-海藻酸鈉復(fù)合支架。經(jīng)過干燥后的復(fù)合支架肉眼觀察為淡黃色多孔結(jié)構(gòu)，且隨著濃度增大，孔愈發(fā)致密。將孔板內(nèi)的支架取出，用刀片盡量薄的切去比較粗糙的兩面。先向每個的氯化鈣(氯化鈣與海藻酸鈉濃度比為1:1)溶液靜置交聯(lián)3h后，吸去每個孔內(nèi)的氯化鈣溶液，然后根據(jù)支架數(shù)量確定所需交聯(lián)劑的總體積，配置100mL乙醇濃度為80%的交聯(lián)劑。取一個燒杯，加入乙醇和水，將稱量好的EDC、NHS、MES依次緩慢加入，加入轉(zhuǎn)子，放入攪拌器中在37℃的條件下攪拌均勻。混勻后，向每個孔中加入2mL80%乙醇溶解的EDC(1-(3-二藥品物質(zhì)的量濃度c為50mmol/L,m=n*M=c*v*M。靜置交聯(lián)12h,吸去交聯(lián)劑。隨后對復(fù)合支架進(jìn)行水洗。分別將三組濃度的復(fù)合支架轉(zhuǎn)移至300mL燒杯中，放入震蕩機中，用純水清洗30min。將清洗后的復(fù)合支架放入4℃的冰箱中預(yù)凍12h后，再放入冷凍干C2.復(fù)合支架的物理性能檢測將干燥后絲膠蛋白濃度分別為0.5%、1%和1.5%復(fù)合支架切成薄片(6*6*1mm),置于倒置顯微鏡下觀察支架的微觀形貌。進(jìn)一步地利用ImageJ軟件對每組支架進(jìn)行孔徑分度為1%時，支架孔徑在201.1±7.1lμm左右，絲膠蛋白濃度為2%時，支架孔徑約為 0圖3.復(fù)合支架的孔徑檢測2.2.絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架吸水率檢測將干燥的復(fù)合支架切成長方體結(jié)構(gòu)，盡量使各試支架的干重，用m1表示，置于24孔板中，加入PBS溶液室溫浸泡3h后紙將支架表面的水進(jìn)行擦拭，稱取其重量記錄為m2。每種材料測試多組取角平整。稱量復(fù)合邊,平均值作為實驗結(jié) 0圖4.復(fù)合支架的吸水率檢測支架的吸水能力對細(xì)胞輸送營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物至關(guān)重要。圖4為不同濃是由于復(fù)合支架中2.3.絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架力學(xué)性能檢測將干燥后的支架切成長方體，確保表面高度整齊，使用萬能材料試驗機對復(fù)合支架的力學(xué)架變形量與總長度的比值，ε=(l-x)/l;其中y為壓力負(fù)荷，單位為N;a,b,1分別為支架的長、 0圖5.復(fù)合支架力學(xué)性能檢測3.HE染色評估A549細(xì)胞增殖及其形態(tài)待復(fù)蘇后的A549細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中達(dá)到90%的融合后，加入胰酶進(jìn)行消化后，1000rpm離心5min,倒掉上清液，加入1mL完全培養(yǎng)基吹打混勻后，進(jìn)行血球計數(shù)板計數(shù)，經(jīng)過適當(dāng)濃度稀釋后，取50μL細(xì)胞懸浮液(2×103個)加入24孔板中培養(yǎng)5天，通過HE染色考察細(xì)HE分析：待A549細(xì)胞在孔板分別培養(yǎng)1d,3d和5d后，將培養(yǎng)基吸出，加入4%多聚甲醛固定15min后，用PBS沖洗2次。之后，加入200μL蘇木精染液染色20min,PBS洗去浮色。加入分化液分化10s,PBS浸洗2次。加入200μL伊紅染液染色2min,PBS清洗2次后，由HE染色結(jié)果可知，培養(yǎng)一天后，細(xì)胞均已粘附于孔板底部，細(xì)胞良好伸展，多數(shù)細(xì)胞為鱗狀，細(xì)胞方向各異(圖6)。放大倍數(shù)下，HE的細(xì)胞核清晰可見，細(xì)胞呈現(xiàn)良好的鋪展。角形或多角形。隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞不斷增殖，細(xì)胞密度增多，待細(xì)胞培養(yǎng)5天后，細(xì)胞之間相互連接，此時細(xì)胞已經(jīng)在孔板達(dá)到90%以上融合，HE染色顯示有些區(qū)域細(xì)胞方向錯以上結(jié)果明確了1%復(fù)合支架可以作為后期體外三維肺癌模型的支架材料，其在成分、孔作用。目前實驗開展順利，較好的達(dá)到了預(yù)的多種細(xì)胞生物學(xué)行為(粘附、分布、形態(tài)、滲透、活性、增殖等)并利用3D工程化腫瘤模型初步探究APS協(xié)同順鉑對肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制。已使用項目研究經(jīng)費：4800元項目經(jīng)費開支情況用途金額備注論文版面費專利申請費調(diào)研、差旅費打印、復(fù)印費資料費試劑等耗材費用于購買細(xì)胞、支架材料及生物學(xué)檢測所需的耗材及試劑硬件購置費其它肺癌細(xì)胞在復(fù)合支架中多種細(xì)胞行為的檢測(粘附、分布、形態(tài)、滲透、活性、增殖等),復(fù)合支架生物相容性實驗研究及利用3D工程化腫瘤模型初步探究APS協(xié)同順鉑對肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制。該項目實施方案設(shè)計合理，實驗進(jìn)度按照前期安排穩(wěn)定進(jìn)行，且取得了較好經(jīng)費使用合理，項目組成員團隊合作能力較好，實驗同意√限期整改山東第二醫(yī)科大學(xué)APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制XX項目級別國家級項目進(jìn)展情況主要研究階段(起止時間)研究內(nèi)容完成情況構(gòu)建體外肺癌模型并考察肺癌細(xì)胞多種生物學(xué)行為完成項目研究成果(已取得的成果)序號項目成果名稱成果形式1山東省大學(xué)生醫(yī)藥生物技術(shù)技能大賽(創(chuàng)新大賽)-山東省一等獎競賽獲獎2競賽獲獎的開展過程中還存在哪些問題。)本項目執(zhí)行開始日期為2023.07,項目持續(xù)時間為2023.07-2024.07,為期1年，目前已經(jīng)制備了絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架，并對其進(jìn)行了多項物理性能，進(jìn)一步地接種肺癌細(xì)胞構(gòu)建3D肺癌模型并確定其可行后，加入APS和順鉑考察藥物抑制肺癌細(xì)胞的作用。具體這幾個月的實驗及其結(jié)果展開如下：將復(fù)合支架切成薄片后浸于75%乙醇溶液中并放置在紫外燈下滅菌過夜。將滅菌好的支架從六孔板中取出，用PBS清洗兩遍以洗去殘留的酒精，隨后將支架放入24孔板內(nèi)，并將24孔板置于超凈臺內(nèi)開啟吹風(fēng)至支架三分之二干燥。將肺癌細(xì)胞A549用PBS清洗2次后，加入2mL胰酶進(jìn)行消化，之后加入4mL完全培養(yǎng)基終止消化，將消化下的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，1000rpm離心5min。對離心后的細(xì)胞進(jìn)行重懸，將細(xì)胞懸浮液加入到2mLEP管中，吹打均勻后，吸取100μL滴入血球計數(shù)板中，用顯微鏡對計數(shù)板計數(shù)區(qū)進(jìn)行計數(shù)。計數(shù)完成補加100μL培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱孵育4h后，每孔補加1mL培養(yǎng)基至液體基本覆蓋每孔的底將A549細(xì)胞接種到1%的絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架上培養(yǎng)1d、3d、5d和7d后，使用Calcein-AM染色和HE組織學(xué)分析評估細(xì)胞在支架的增殖。將A549細(xì)胞接種到1%絲膠箱中孵育30min后，置于激光共聚焦下拍照，使用激光共聚焦序列掃描考察肺癌細(xì)胞在復(fù)合多個腫瘤球后，加入以上不同濃度的藥物進(jìn)行處理，待培養(yǎng)2天后，移去原培養(yǎng)基和藥物，每入37℃培養(yǎng)箱中孵育30min后，使用PBS溶液沖洗2次后，置于激光共聚焦下拍照，考察不同給藥處理對3D肺癌細(xì)胞生長的抑制效果。待肺癌模型構(gòu)建成功，加入上述不同給藥組進(jìn)行孵育48h后，PBS沖洗3次，2.5%戊二醛固定3h,加入梯度酒精(50%,70%,90%,100%)逐級脫水，每次脫水30min,室溫下自然干燥后，用導(dǎo)電膠將細(xì)胞-支架構(gòu)建物粘于載物臺進(jìn)行噴金60s,置于鎢燈絲掃描電鏡下拍照，通過給藥后細(xì)胞形態(tài)的變化考察APS-CM及每孔加入20μLCCK-8和200μL基培混合液，在培養(yǎng)箱孵育3h后，使用移液槍吹打細(xì)胞-支架復(fù)合物，每孔吸取100μL混合液至96孔板中，于酶標(biāo)儀450nm處檢測每個孔的吸光度OD值，通過每組的OD值和存活率評估不同給藥處理對3D肺癌細(xì)胞生長的抑制效果。2.實驗結(jié)果2.1肺癌細(xì)胞在絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架的生長增殖鈣黃綠素和HE切片結(jié)果顯示細(xì)胞接種1天后，絕大部分細(xì)胞在復(fù)合支架骨架及表面貼壁且鋪展；培養(yǎng)3天后，細(xì)胞沿支架骨架及孔隙呈良好伸展，支架結(jié)構(gòu)清晰可見，隨著培養(yǎng)時間延長，到第5天的時候，大部分細(xì)胞開始收縮且細(xì)胞間堆疊形成大小不一的集落，細(xì)胞間連接非常緊密；培養(yǎng)7天后，細(xì)胞集落進(jìn)一步增大，遍布整個復(fù)合支架(圖1)。隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞逐漸生長增殖且絕大多數(shù)活細(xì)胞被鈣黃綠素染色呈現(xiàn)強綠色熒光均表明支架良好的生物相容性，且支架具有較好的多孔結(jié)構(gòu)，利于營養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物傳質(zhì)的進(jìn)行，為細(xì)胞生長提供了良好的增殖空間。2.2APS協(xié)同順鉑對三維肺癌細(xì)胞的抑制作用死活染色結(jié)果如圖2所示，空白對照組在支架形成了多個細(xì)胞集落且連接成片，絕大部分活在支架的分布。經(jīng)給藥處理肝癌細(xì)胞2d后，不同給藥組均表現(xiàn)出不同程度的殺傷作用，鈣黃綠素?zé)晒鈽?biāo)記的活細(xì)胞數(shù)逐漸減少，被PI染成紅色的壞死細(xì)胞數(shù)逐漸增多。另外，從Hoechst染色也可看出APS和順鉑單獨作用組的細(xì)胞毒性作用弱于兩者的協(xié)同效果，聯(lián)合給藥組多數(shù)細(xì)胞集落逐漸松散且外層細(xì)胞逐漸溶解，細(xì)胞集落數(shù)量明顯減少，多數(shù)細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)，被PI著色，僅有少量狀態(tài)不佳的小細(xì)胞集落及細(xì)胞殘片。以上結(jié)果表明APS和順鉑均具有細(xì)胞毒作用，兩者協(xié)同ControlSEM觀察APS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞上清CM和順鉑對3D肝癌細(xì)胞生長的抑制作用(圖3A)。給藥第2天，空白對照組能清楚看到緊密堆疊密的細(xì)胞集落，集落之間相互連接成片，細(xì)胞狀態(tài)良好。單獨的APS和順鉑組的外層細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生一定改變，部分出現(xiàn)凋亡小體現(xiàn)象(藍(lán)色箭頭),且相比未處理組細(xì)胞集落尺寸明顯減小(橙色虛框)。聯(lián)合給藥組細(xì)胞集落逐漸分CCK-8定量考察單獨APS、順鉑及兩者聯(lián)合給藥對3D肝癌細(xì)胞的作用效果(圖2B-C)。給藥處理一天后，APS單獨給藥和順鉑組細(xì)胞活性區(qū)別并不顯著,細(xì)胞活率均高于85%以上。給藥2天后，給藥組細(xì)胞毒作用增強，細(xì)胞活率明顯下降。加藥3天后，盡管單獨給藥進(jìn)一步抑制細(xì)胞生長，但是其作用效果明顯低于聯(lián)合給藥組(p<0.001)。以上結(jié)果表明，APS介導(dǎo)AAControlAPS-100B圖3.APS和順鉑對三維肺癌細(xì)胞形態(tài)及生長的影響(C)APS和順鉑對肺癌細(xì)胞活率的影響已使用項目研究經(jīng)費：21000元已報銷金額：21000元項目經(jīng)費開支情況用途備注論文版面費專利申請費調(diào)研、差旅費打印、復(fù)印費資料費試劑等耗材費其它四、項目后期具體工作計劃項目已完成同意季度檢查結(jié)果類別限期整改生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院APS協(xié)同順鉑抑制體外3D工程化肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制項目級別國家級項目起始時間：2023年7月計劃完成時間：2024年6月實際完成時間：2024年6月項目負(fù)責(zé)人及成員姓名學(xué)號XX多糖生物活性檢測及姚偉杰生物學(xué)實驗及數(shù)據(jù)分析馮子慧支架性能檢測及3D模型構(gòu)建高曉晨多糖活性檢測姓名XX副教授項目指導(dǎo)與資助講師項目指導(dǎo)一、項目實施情況(請就研究目標(biāo)、研究過程、研究成果、研以內(nèi)):(1)考察APS和順鉑物理化學(xué)及結(jié)構(gòu)，結(jié)合已有文獻(xiàn)，確定其生物活性發(fā)揮的可能因素；考察APS是否具有直接抗肺癌活性。(2)分別制備脫細(xì)胞豬肺基質(zhì)dECM及dECM/明膠復(fù)合支架，對支架表觀形貌、結(jié)構(gòu)及組成、孔隙率、吸水率、機械性能及熱穩(wěn)定性等物理性能進(jìn)行表征；接種肺癌細(xì)胞并考察支架上細(xì)胞分布、滲透、生長增殖情況以評估構(gòu)建模型的可行性，考察3D模型相比2D腫瘤模型藥物篩選的準(zhǔn)確性。(3)利用3D工程化腫瘤模型初步探究APS協(xié)同順鉑對肺癌生長及轉(zhuǎn)移的作用及機制，為APS在動物體內(nèi)發(fā)揮減毒增效作用提供實驗依據(jù)，從而為APS臨床應(yīng)用于肺癌患者(1)APS協(xié)同順鉑對2D肺癌細(xì)胞生長的影響(a)查閱文獻(xiàn)及預(yù)實驗確定APS的最佳濃度范圍，通過SEM、活死染色、CCK及DAPI(b)考察APS聯(lián)合順鉑兩藥對肺癌A549細(xì)胞的增殖抑制作用的關(guān)系，通過檢測考察APS作用后細(xì)胞周期的變化，順鉑作用后細(xì)胞周期的變化，還有兩藥的聯(lián)合出現(xiàn)細(xì)胞周期的變并對支架形態(tài)進(jìn)行觀察、對支架進(jìn)行機械強度測試。但制備出的復(fù)合支架在用鑷子夾取時后改用明膠和絲膠蛋白，但由于這兩種支架材料的親水性過強，導(dǎo)致原本選用的交聯(lián)試劑達(dá)不到理想的交聯(lián)效果，制備出的支架凍干成型性和機械強度都不理想；經(jīng)過查閱文獻(xiàn)和多次實驗，確定制備方案為：使用絲膠蛋白(0.5%、1%、1.5%)、海藻酸鈉(2%)、明膠(1%)作為復(fù)合支架的制備材料。.孔徑大小、吸水率等的影響，界定最優(yōu)的冷凍干燥參數(shù)。通過探究不同交聯(lián)劑對復(fù)合支架生物力學(xué)性能);初步確定復(fù)合支架的細(xì)胞及組織生物相容性，具體包括肺癌細(xì)胞在復(fù)合(3)APS協(xié)同順鉑抑制3D培養(yǎng)肺癌生長的作用及機制(a)通過試驗設(shè)計確定肺癌細(xì)胞-脫細(xì)胞基質(zhì)腫瘤模型用于研究藥物作用的適宜細(xì)胞密度及APS、順鉑體外作用肺癌細(xì)胞的適宜濃度；對比無APS干預(yù)組，從其對免疫細(xì)胞及其細(xì)胞周期的阻滯層面探究APS協(xié)同順鉑抑制肺癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制。(b)明確APS、順鉑濃度及細(xì)胞合適的接種量后，構(gòu)建腫瘤模型。通過活死染色、CCK、SEM、DAPI染色、AV/PI試劑盒、常規(guī)組織學(xué)檢測等手段考察APS聯(lián)合順鉑對三維培養(yǎng)的肺癌A549細(xì)胞生長的影響，并考察其抑包括干擾細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡等方面。觀察APS聯(lián)合順鉑對肺癌A549細(xì)胞細(xì)采用氯化鈣離子交聯(lián)和EDC/NHS共價交聯(lián)并二次冷凍干燥后得鈉/明膠復(fù)合支架呈現(xiàn)多孔聯(lián)通結(jié)構(gòu)，0.5%和1%復(fù)合支架大孔套小孔復(fù)合支架的孔(圖1A)。隨著絲膠蛋白濃度的提高，復(fù)合支架孔徑逐漸減少，支架總體的孔徑均在170-280μm之間(圖1B)。支架的吸水能力對細(xì)胞輸送營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物至關(guān)重復(fù)合支架的壓縮模量逐漸增大，且各組均具有顯著性差異(圖1D)。所制備的絲膠蛋白/明膠/海藻酸鈉復(fù)合支架具有良好的力學(xué)性能，能夠支持后續(xù)細(xì)胞的生長增CBD圖1.絲膠蛋白/海藻酸鈉/明膠復(fù)合支架的物理性能分析(A)通過SEM考察復(fù)合支架的微觀結(jié)構(gòu)；(B)復(fù)合支架的孔徑分析；(C)復(fù)合支架的吸水率檢測；(D鈣黃綠素和HE切片結(jié)果顯示