臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《臨床檢驗(yàn)擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》，制定本標(biāo)準(zhǔn)

一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則

（一）臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則

1、試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)

2、標(biāo)本制備區(qū)

3、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

4、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。

（二）各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。

（三）進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)—>標(biāo)本制備區(qū)—>擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)—>擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

（四）不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。

二、工作區(qū)域儀器設(shè)備配置標(biāo)準(zhǔn)

（一）試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)

1、2-8C和-15C冰箱

2、混勻器

3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）

4、移動紫外燈（近工作臺面）

5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）

6、專用工作服和工作鞋

7、專用辦公用品

（二）標(biāo)本制備區(qū)

1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱

2、高速臺式冷凍離心機(jī)

3、混允器

4、水浴箱或加熱模塊

5、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）

6、可移動紫外燈（近工作臺面）

7、超凈工作臺

8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）

9、專用工作服和工作鞋

10、專用辦公用品

如需處理大分子DNA，應(yīng)具有超聲波水浴儀。

（三）擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)

1、核酸擴(kuò)增儀

2、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）

3、可移動紫外燈（近工作臺面）

4、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）

5、專用工作服和工作鞋

6、專用辦公用品

(四)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)

視檢驗(yàn)方法不同而定?；緝x器設(shè)備如下：

1、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）

2、可移動紫外燈（近工作臺面）

3、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）

4、專用工作服和工作鞋

5、專用辦公用品

為了對以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR做重復(fù)檢測,需要三個(gè)不同的區(qū)域,每一個(gè)區(qū)域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細(xì)列出.

1、樣品準(zhǔn)備區(qū)

這個(gè)區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應(yīng)該采

取預(yù)防措施：

1）PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。

2）組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。

3）用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。

4）DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。

5）大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無菌一次性移液管吸取。

6）管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。

7）任何時(shí)候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。

2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR

RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報(bào)道。

3、前PCR區(qū)

必須有專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個(gè)區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。

4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作

1）所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。

2）所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。

3）在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。

4）所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。

5）所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。

6）新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。

7）樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時(shí)都應(yīng)該小心保存。

5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物

1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。

2）如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。

3）作為一個(gè)規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個(gè)已知的弱陽性樣品來驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。

4）陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。

5）當(dāng)做陽性對照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。

6）由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。

6、控制污染的方法

已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個(gè)數(shù)量級。