液相色譜基礎(chǔ)

第一部分色譜基礎(chǔ)知識色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒色素色譜組分色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)移動相：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體固定相：靜止不動的一相，色譜柱固定液色譜定義色譜是一種分離技術(shù).色譜的主要目的是對混合物中的目標(biāo)物分離和定量色譜分類HighPerformanceLiquidchromatography(HPLC)GasChromatography(GC)Thin-LayerChromatography(TLC)CapillaryElectrophoresis(CE)色譜優(yōu)點(diǎn)同時(shí)分析分離性能好靈敏度高

(ppm-ppb)進(jìn)樣量小

(1-100uL)液相色譜：以液體作為移動相的色譜分離方法適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析流動相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用HPLCvsGC氣相色譜：以氣體作為移動相的色譜分離方法適用于沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析流動相只起運(yùn)載樣品分子的能力

HPLC分類正相模式(NP)反相模式(RP)反相離子對色譜

(IPC)離子交換色譜(IC)尺寸排阻(GPC/GFC)手性分離（Chiralseparationmode）反相模式(RP)C18(ODS)C8(octyl)C4(butyl)苯基TMS氰基-Si-C18H37Si非極性相互作用力是什么?OHOHC18(ODS)強(qiáng)弱疏水性Si

疏水性如果樣品有CH3CH2CH2---:碳鏈

:芳香基如果樣品有-COOH :羧基-NH2 :氨基-OH :羥基作用力強(qiáng)作用力弱反相模式下流動相的選擇優(yōu)化水（緩沖液）和有機(jī)溶劑的比例是非常重要的甲醇，乙腈和

THF

是常用的有機(jī)溶劑在有緩沖液的情況下,緩沖液的濃度和PH是非常重要的溶劑極性變化對分離的影響

20%H2O

30%H2O

40%/H2O1:

對羥基苯甲酸甲酯2:

對羥基苯甲酸乙酯3:

對羥基苯甲酸丙酯4:

對羥基苯甲酸丁酯有機(jī)相:MeOH固定相極性變化對分離的影響C18(ODS)強(qiáng)樣品SiC8樣品一般Si樣品C4弱Si分析條件柱

:Shim-packCLC-ODS流動相

:MeOH:H2O=7:3流速

:1.0mL/min溫度

:40C進(jìn)樣體積

:10uL檢測器

:UV-254nm峰1.苯甲酸甲脂2.苯甲酸乙脂3.n-苯甲酸丙酯4.n-苯甲酸丁酯ODSC8

TMS固定相極性變化對分離的影響離子對試劑

陰離子化合物氫氧化四丁基銨(TBA)陽離子化合物四烷基磺酸鈉

(C4)五烷基磺酸鈉(C5)六烷基磺酸鈉

(C6)七烷基磺酸鈉

(C7)八烷基磺酸鈉

(C8)十烷基磺酸鈉

(C10)離子對色譜離子對色譜重點(diǎn)考慮離子對試劑的類型離子對試劑的濃度溶劑的

pH正相色譜硅膠

:

常用氰基

:常用氨基

:分析糖二醇基柱

:分析蛋白質(zhì)硅膠SiSi-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)修飾后的Si相互作用力是什么?OHHOSiOHSiOH強(qiáng)弱非常弱氫鍵

氫鍵力如果樣品有-COOH

:羧基-NH2 :氨基-OH :羥基氫鍵力強(qiáng).如果樣品沒有任何官能團(tuán)，象碳水化合物如果樣品有大的基團(tuán),由于空間障礙氫鍵力弱.正相模式下流動相的選擇主要試劑烷烴

(戊烷,己烷,庚烷,辛烷)芳香烴

(苯,甲苯,二甲苯)亞甲基氯化物氯仿四氯化碳輔助溶劑甲基-t-丁基

醚

(MTBE),二乙醚,四氫呋喃

(THF),二氧雜環(huán)乙烷,嘧啶,乙酸乙酯,乙腈,丙酮,異丙醇,乙醇,甲醇為了調(diào)整保留時(shí)間，可以選擇一種主要試劑然后再加入輔助試劑。沒有紫外吸收的溶劑更容易被檢測出來。增加溶劑極性0%MeOH

2%MeOH

5%/MeOH

1:

鄰苯二甲酸二辛酯

2:

鄰苯二甲酸二丁酯

3:

鄰苯二甲酸二乙酯

4:

鄰苯二甲酸二甲酯

溶劑

:己烷反相色譜

流動相極性大于固定相極性能溶于水/有機(jī)混合物的中性或非離子化合物正相色譜

流動相極性小于固定相極性不溶于水/有機(jī)混合液的親脂樣品、異構(gòu)體混合物和制備HPLC反相模式與正相模式的對比

反相保留時(shí)間重復(fù)性好固定相耐用正相對立體異構(gòu)體有很好的分離

(VitaminE等..)保留時(shí)間重復(fù)性稍差

反相模式與正相模式的對比離子交換色譜N+RRR樣品SO3-樣品+++++++++++++離子吸引力離子交換色譜應(yīng)用生物領(lǐng)域

(蛋白質(zhì),農(nóng)藥,氨基酸分析)離子分析陽離子交換劑強(qiáng)陽離子交換劑

(SCX) (R-SO3-)弱陽離子交換劑

(WCX) (R-COO-)陰離子交換劑強(qiáng)陰離子交換劑

(SAX) (R4N+)弱陰離子交換劑

(WAX)

(DEAE)第二部分一、柱填料二、柱子基本性能參數(shù)硅膠純度

填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度色譜柱尺寸填料床的長度和內(nèi)徑顆粒形狀

球型或不規(guī)則型粒徑

平均顆粒直徑,通常3-10μm表面積顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/g表示孔徑

顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300?

碳百分率

與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量封尾

用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來表征色譜柱的參數(shù)硅膠特性[無定型]

[球形]制備用

分析用硅膠性質(zhì)粒徑

5um5um的粒子是最常用的.然而,這是指平均粒徑為

5um，也存在

3um和10um的粒子.對于好的柱子，窄范圍的粒徑分布是非常重要的.粒徑硅膠性質(zhì)孔徑

:80-120A正常的硅膠表面有微孔.分析用的柱子,微孔大小80A-120A是最常用的.對于蛋白質(zhì)和聚合物等大分子,300A,500A和1000A(甚至更大)常被使用.在大量分析時(shí)無孔的硅膠也常使用.有孔和無孔硅膠性質(zhì)

表面積和碳百分率

表面積如果孔徑增加,表面積降低.100A:450m2/g150A:330m2/g300A:100m2/g碳百分率碳含量高,填充物保留能力強(qiáng).碳含量為12%-20%

是最常用的硅膠性質(zhì)硅羥基容易和硅烷化試劑發(fā)生反應(yīng)Cl-Si(CH3)2-RR=C18,C8,C4,Phenyl,C3H7CN,C3H7NH2,DiolSiSiO2SiSiSiSiSiOOOOOOOOOHOHOHOH硅羥基SiSiO2SiSiSiSiSiOOOOOOOOOSi(CH3)2-ROSi(CH3)2-ROSi(CH3)2-ROSi(CH3)2-R硅羥基硅膠性質(zhì)

殘留硅羥基殘留的硅羥基即使對于改良的硅膠

(e.g.ODS,C8),仍舊有硅羥基保留在表面.硅羥基對

胺類化合物有強(qiáng)的吸引力,因而會造成此類物質(zhì)的拖尾.C18C18C18C18silicagelOHOH殘留的硅羥基硅膠性質(zhì)

封尾為了降低硅羥基的影響,選擇

封尾

的柱子C18C18C18silicagelOHOHC18C18C18silicagelO-TMSO-TMSTMS處理TMS:三甲基硅烷[封尾][無封尾]C18C18封尾和未完全封尾的效果比較Peaks1.Propranolol2.Acenaphthene3.Ammitriptyline封尾未完全封尾如何消除拖尾流動相中加入輔助劑三乙胺高氯酸鈉

(NaClO4)在流動相中加入胺修飾劑和高氯酸鈉有助于減少拖尾，因?yàn)檫@些添加物可以對硅羥基產(chǎn)生屏蔽效應(yīng).表征色譜柱性能的參數(shù)容量因子理論塔板數(shù)理論塔板高度分離度拖尾因子容量因子,k’t1=

溶劑峰的保留時(shí)間t0=溶劑峰的柱死時(shí)間

(非保留時(shí)間)t0t1k’=t0t1-t0理論塔板數(shù),N方程

:

N=16x(Rt/W)2實(shí)際修飾方程

:N=5.54x(Rt/W1/2)2綜合修飾方程

:N=6.28x(RtxH/Area)2

WW1/2H1/2HRtArea分離度相鄰兩峰完全分離其分離度

Rs>1.5.完全分離時(shí)的分離度

Rs=1.0Rs=1.50峰形不是三角形

，而是高斯分布第三部分HPLC硬件基礎(chǔ)知識日常注意點(diǎn)液相色譜簡易流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器溶劑數(shù)據(jù)處理采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配流動相的選擇水的等級水的等級純化水蒸餾水去離子水波長(nm)純化水去離子水因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率HPLC用水可以通過以下幾個方法得到：

專門的純水機(jī)或超純水機(jī):理想的HPLC用水應(yīng)為18.2Ω

的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無機(jī)離子及空氣等。

去離子水重蒸；

二次或三次重蒸水；

不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水。水的等級

未注入樣品時(shí)空白梯度的色譜圖水中不純物的出峰水中的不純物保留在柱中，隨之被乙腈洗脫.水的等級有機(jī)溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)微量分析、梯度洗脫有機(jī)溶劑的等級甲醇乙腈正己烷分析純級和

HPLC級溶劑的吸光度比較圖有機(jī)溶劑的等級選擇緩沖液的步驟

1.確定最佳分離狀態(tài)時(shí)的流動相pH

2.選擇具有與流動相的pH相近的pKa

的緩沖液（即使?jié)舛认∫簿哂休^強(qiáng)能力的緩沖液）3.確認(rèn)檢測波長下緩沖液是否有大的吸收（在波長210nm附近進(jìn)行檢測時(shí)，不能用醋酸和檸檬酸的緩沖液）緩沖鹽pK1pK2pK3醋酸4.87檸檬酸3.134.766.40磷酸2.167.2112.32緩沖鹽常用代表性的弱酸的pKa值緩沖液的使用

使用前必須過濾

使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:

用純水沖洗30-60min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min易受到細(xì)菌和霉菌的影響

不能直接用有機(jī)溶劑沖洗緩沖鹽溶液緩沖鹽-黏度低

在相同流速時(shí)有較低的柱壓當(dāng)和水混合時(shí)黏度有變化柱壓也相應(yīng)有變化

乙腈和甲醇

…黏度溶劑的黏度Water/methanolWater/methanolWater/acetonitrileWater/acetonitrilePressure(MPa)Water(100%)Organicsolvent(100%)Water/Organicsolvent1:1過濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。濾膜類型：

聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。

醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水基溶劑。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于二甲基甲酰胺。

再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑溶劑前處理-過濾氧氣在混合溶劑中的溶解度0

50

100

乙醇體積(%)100200氧的飽和容量(uL)氧氣在1ml水-乙醇混合溶劑中的溶解度脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡

氣泡對測定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時(shí)間和峰面積

2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形

3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動

溶劑前處理-脫氣常用脫氣方法超聲脫氣減壓脫氣在線脫氣目的單元流速范圍

特性和應(yīng)用

LC-20AD0.0001-10ml/min無脈動，適于半微量LC

和

LC-MS分析

LC-20AT0.001-10ml/min非凡的耐用性，適于常量分析

LC-20AB 0.0001-10ml/min無脈動，適于半微量LC

和LC-MS分析分析

LC-10ATvp

LC-10ADvp

島津LC-20A系列輸液泵LC-20AT串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵LC-20AD

并聯(lián)式微體積柱塞往復(fù)泵柱塞泵的基本結(jié)構(gòu)

LC-10ATvp

LC-10ADvp

單向閥單向閥單向閥LC-20ATLC-20ATLC-20ADLC-20ABLC-20AD/20AT/20AB的概要SpecificationsLC-20AD（228-45000-XX）LC-20AT（228-45001-XX）LC-20AB（228-45002-XX）PumptypeParalleldoubleplungersSerialdoubleplungersParalleldoubleplungers(twopump)Strokevolume10μLFront:47μL,rear:23

μL10μLMaximumoperatingpressure40MPaProgrammableflowrate0.0001mL/minto10.0000mL/min0.001mL/minto10.000mL/min0.0001mL/minto10.0000mL/minFlowaccuracy±1%or±0.5μL/min,whicheverislarger(0.01mL/min–2.00mL/min)±2%or±2μL/min,whicheverislarger(0.01mL/min–5mL/min)±1%or±0.5μL/min,whicheverislarger(0.01mL/min–2.00mL/min)Flowprecision0.3%(0.1%RSD)orlessCheckvalvesPumpheads(inparallel)DrainvalvePressuresensorDumperLC-20ADPumpheads(inseries)DrainvalvePressuresensorDumperCheckvalvesLC-20ATPumpheads(inparallel)forPumpBDrainvalvePressuresensorDumperCheckvalvesforPumpBPumpheads(inparallel)forPumpBCheckvalvesforPumpALC-20ABLowpressureGEunitInstalledinside單向閥馬達(dá)和凸輪柱塞桿柱塞桿密封圈泵頭腔體柱塞往復(fù)泵結(jié)構(gòu)示意圖單向閥結(jié)構(gòu)拋光面球座寶石球單向閥工作原理吸液沖程排液沖程出口單向閥進(jìn)口單向閥泵頭單向閥工作原理輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑等度洗脫

A泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測器B泵AB時(shí)間B

濃度梯度洗脫梯度洗脫裝置：高壓梯度：用兩臺高壓輸液泵將兩種溶劑輸入低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動相輸入到色譜柱中。HPGE梯度混合器低壓梯度比例閥LPGE高壓常壓高壓/低壓梯度系統(tǒng)分析時(shí)間長分離度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODS)使用梯度洗脫的原因當(dāng)?shù)榷认疵摃r(shí)：95%30%甲醇濃度在最短時(shí)間內(nèi)獲得最佳的分離使用梯度洗脫的原因當(dāng)采用梯度洗脫時(shí)：梯度洗脫形式：線性梯度：在梯度洗脫時(shí)，流動相強(qiáng)度的變化和時(shí)間成線性比例指數(shù)梯度：在梯度洗脫時(shí)，流動相強(qiáng)度隨時(shí)間的變化呈指數(shù)關(guān)系折線梯度：梯度洗脫方式梯度洗脫形式的選擇梯度洗脫：優(yōu)點(diǎn)：可提高分離度、縮短分離時(shí)間、降低最小檢測量和提高分離精度注意事項(xiàng)：溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）查看空白實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)遵守分析周期。（最初的分析數(shù)據(jù)不采用）梯度洗脫要點(diǎn)1.使用流動相溶解樣品

--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)由為重要

--保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀

2.進(jìn)樣前最好使用0.45um的膜進(jìn)行過濾

如果樣品很臟，要使用0.2um的膜進(jìn)行過濾3.對于含有復(fù)雜基質(zhì)的樣品，最好過前處理小柱后再進(jìn)樣。樣品前處理進(jìn)樣器自動進(jìn)樣器手動進(jìn)樣器原理：（六通閥）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入手動進(jìn)樣器的原理圖load位置inject位置

柱

泵

泵

柱

定量環(huán)進(jìn)樣量和檢測器響應(yīng)的關(guān)系示意圖進(jìn)樣體積

檢測器響應(yīng)值定量環(huán)體積的一半3倍定量環(huán)體積全量注入部分注入手動進(jìn)樣器的進(jìn)樣體積部分注入：一般要求進(jìn)樣量最多為定量環(huán)體積的一半，如20μl的定量環(huán)最多進(jìn)樣10μl的樣品，并且要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同全量注入：進(jìn)樣量最少為定量環(huán)體積的3至5倍，即20μl的定量環(huán)最少進(jìn)樣60至100μl的樣品，這樣才能完全置換樣品定量環(huán)內(nèi)殘留的溶液，達(dá)到所要求的精密度及重現(xiàn)性。部分注入和全量注入交叉污染的原因微量注射器

紅色表示殘留樣品手動進(jìn)樣方法一般的方法

1.在進(jìn)樣狀態(tài)下清洗針口

2.在裝填狀態(tài)下插入微量注射器

3.注入樣品

4.切到進(jìn)樣狀態(tài)便捷的方法（不需清洗）

1.進(jìn)樣狀態(tài)下插入微量注射器

2.切到裝填狀態(tài)

3.注入樣品

4.切回到進(jìn)樣狀態(tài)手動進(jìn)樣方法柱溫箱分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測穩(wěn)定性

柱壓低于150kgf/cm2柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃緩沖液PH使用范圍為2～7.5流動相有機(jī)溶劑比例過低,柱效下降快ODS柱的使用注意點(diǎn)硅膠在PH為3～4時(shí)穩(wěn)定性最好堿濃度越低，流動相含水量越低，硅膠越穩(wěn)定。色譜柱的類型及適用范圍硅膠基底聚合物基底pH范圍2-7.5寬范圍有機(jī)溶劑所有有限制壓力〈250kgf/cm2低壓溫度寬范圍〈60C分析柱的維護(hù)在使用新柱之前，最好用強(qiáng)溶劑在低流量下

(0.2-0.3ml/min)沖洗

30mins，長時(shí)間未用的分析柱也要同樣處理定期使用強(qiáng)溶劑沖洗柱子3、使用緩沖鹽時(shí)，要先用水沖洗，再用有機(jī)溶劑沖洗4、凈化樣品5、分離條件6、不使用時(shí)，要蓋上