DB11-T 1397-2017 魚類口服抗菌藥物選用技術(shù)規(guī)程

ICS65.150

B50

備案號:54176-2017DB11

北京市地方標(biāo)準(zhǔn)

DB11/T1397—2017

魚類口服抗菌藥物選用技術(shù)規(guī)程

Thetechnicalprotocolofscreeningoralantibacterialsforfish

2017-03-22發(fā)布2017-07-01實施

北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布

DB11/T1397—2017

魚類口服抗菌藥物選用技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了魚類口服抗菌藥物選用原則、程序和操作流程。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于養(yǎng)殖魚類細(xì)菌感染判斷和治療時口服抗菌藥物選用。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T27623.1—2011漁用抗菌藥物藥效試驗技術(shù)規(guī)范第1部分：常量肉湯稀釋法藥物敏感性試驗

SC/T7014—2006水生動物檢疫實驗技術(shù)規(guī)范

SC/T7201.1—2006魚類細(xì)菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)

3藥物選用原則和程序

3.1原則

抗菌藥物使用應(yīng)遵循以下原則：

——藥物種類應(yīng)符合國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，藥品應(yīng)獲得國家批準(zhǔn)文號；

——選擇GMP認(rèn)證企業(yè)生產(chǎn)的抗菌藥物；

——使用的優(yōu)先順序是磺胺類＞四環(huán)素類＞氨基糖苷類＞氟喹諾酮類＞酰胺醇類。

3.2程序

魚類口服抗菌藥物的選用程序參見附錄A。

4操作流程

4.1病魚采集

病魚采集按SC/T7014—2006第6章的規(guī)定進(jìn)行。

4.2病原菌的分離

病原菌的分離參見附錄B。附錄B中的BHIA的培養(yǎng)基配方參見C.1。

4.3細(xì)菌感染判斷

任何一個劃線分離平板，線上有菌落或菌帶，則該樣品來源養(yǎng)殖池塘的魚類宜用口服抗菌藥物；反

之，則不必使用。

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4.4敏感藥物篩選

采取紙片擴(kuò)散法（參見D.3）篩選敏感藥物種類。依檢測結(jié)果選擇敏感藥物種類，原則如下：

——一個樣品僅獲得一株病原菌，選擇該菌的敏感藥物種類；

——一個樣品獲得多株病原菌，選擇共同的敏感藥物種類；

——一個樣品獲得多株病原菌，且無共同的敏感藥物種類，選擇內(nèi)臟器官分離菌的敏感藥物種類，

優(yōu)先選取肝、腎分離菌的敏感藥物種類。

4.5用藥劑量確定

4.5.1檢測病原菌的最小抑菌濃度（MinimumInhibitoryConcentration，MIC）

采用濃度梯度稀釋法（參見D.4）檢測其對樣品所有病原菌的MIC值。

4.5.2計算樣品每千克魚的日用藥劑量

按4.5.1檢測樣品所有病原菌的MIC值，同種藥物選取最大的MIC值。每種敏感藥物按公式（1）計算

樣品每千克魚的日用藥劑量，每千克魚的日用藥劑量不超過國家獸藥規(guī)定的使用許可值。

U=MIC?Sρ.....................................(1)

式中：

U——每千克魚的日藥物使用劑量（指有效成分劑量），單位為毫克每千克（mg/kg）；

MIC——抗菌藥物對病原菌的MIC值，單位為毫克每升（mg/L）；

S——系數(shù)，鯉科魚類為8.1，冷水魚類為9.4，養(yǎng)殖者可依經(jīng)驗微調(diào)該系數(shù)；

ρ——水的密度，數(shù)值約為1，單位為千克每升（kg/L）。

4.5.3計算樣品池塘的日藥物總使用劑量

每種敏感藥物按公式（2）計算樣品池塘的日總用藥劑量。

M=U?T1000....................................(2)

式中：

M——樣品池塘的日藥物總使用劑量（指有效成分劑量），單位為克（g）；

U——每千克魚的日藥物使用劑量（指有效成分劑量），單位為毫克每千克（mg/kg）；

T——樣品池塘養(yǎng)殖魚類的總重量，單位為千克（kg）。

4.6使用方法

將樣品魚來源池塘的餌料日投喂量減少一半。將4.5.3確定的日藥物總使用劑量溶解拌入餌料中，

充分混勻，一次性投喂使用。

4.7用藥效果評價

用藥后，按以下原則判斷用藥效果：

——如用藥后3d～5d，日死亡數(shù)量明顯下降或疾病的癥狀改善甚至消失，則認(rèn)定藥物治療有效；

——如用藥后3d～5d，魚的日死亡數(shù)量保持治療前的水平或者超過治療前的水平，則認(rèn)定藥物

治療無效。

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AA

附錄A

（資料性附錄）

魚類口服抗菌藥物選用程序

發(fā)病池病魚采集病原菌的分離

治

療平板線上是否有

及菌落或菌帶

否

用

藥是

病魚不用抗菌藥物

效

果

敏感藥物篩選

評

價

使用方法用藥劑量確定

圖A.1魚類口服抗菌藥物選用程序示意

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BB

附錄B

（資料性附錄）

病原菌的分離

B.1設(shè)備和材料

B.1.1普通天平：0g～210g，精確至0.01g。

B.1.2高壓滅菌鍋。

B.1.3微波爐。

B.1.4生物安全柜或超凈工作臺。

B.1.5生物顯微鏡：×10，×40，×100。

B.1.6培養(yǎng)皿：直徑90mm。

B.1.7酒精燈、解剖盤、解剖刀、剪子、鑷子、接種環(huán)（針）、三角燒瓶（500mL）等。

B.1.8試劑和培養(yǎng)基

B.1.9水：GB/T6682，二級。

B.1.10腦心浸液瓊脂（BrainHeartInfusionAgar,BHIA）：參見C.1。

B.2取樣部位

病灶、肝、腎、脾、性腺、腦。

B.3病原菌分離

B.3.1冷水魚病原菌分離

用接種環(huán)從取樣部位蘸取病料，無菌操作劃線接種于BHIA平板，22℃±2℃培養(yǎng)24h～48h，無

菌生長時繼續(xù)培養(yǎng)至5d。

B.3.2溫水魚病原菌分離

用接種環(huán)從取樣部位蘸取病料，無菌操作劃線接種于BHIA平板，28℃±2℃培養(yǎng)24h～48h，無

菌生長時繼續(xù)培養(yǎng)至5d。

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CC

附錄C

（資料性附錄）

培養(yǎng)基的配制方法

C.1腦心浸液瓊脂（BHIA）

C.1.1成分

牛腦浸粉12.5g

牛心浸粉5.0g

蛋白胨10.0g

葡萄糖2.0g

氯化鈉5.0g

磷酸氫二鈉2.5g

瓊脂10g

蒸餾水1000mL

C.1.2制法

將C.1.1中各成分混勻，加熱溶解，調(diào)pH至7.4±0.1，121℃高壓滅菌20min，冷至50℃左右，

傾制平板。

C.2水解酪蛋白瓊脂（MHA）

C.2.1成分

牛肉浸膏6.0g

酸水解酪蛋白胨17.5g

可溶性淀粉1.5g

瓊脂17.0g

蒸餾水1000mL

C.2.2制法

將C.2.1中各成分混勻，加熱溶解，調(diào)pH至7.3±0.1，121℃高壓滅菌15min，冷至50℃左右，傾

制平板。平板中的培養(yǎng)基厚度4mm。

C.3水解酪蛋白肉湯（MHB）

C.3.1成分

牛肉浸膏6.0g

酸水解酪蛋白胨17.5g

可溶性淀粉1.5g

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蒸餾水1000mL

C.3.2制法

將C.3.1中各成分混勻，加熱溶解，調(diào)pH至7.3±0.1，121℃高壓滅菌15min。如檢測鏈球菌，臨

用前加無菌血清0.5%。

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DD

附錄D

（資料性附錄）

病原菌的藥物敏感性檢測

D.1設(shè)備和材料

D.1.1恒溫培養(yǎng)箱：0℃～60℃。

D.1.2精密天平：精確至0.0001g。

D.1.3高壓滅菌鍋。

D.1.4比濁儀。

D.1.5生物安全柜或超凈工作臺。

D.1.6生物顯微鏡：×10，×40，×100。

D.1.7微量移液器：100μL～1000μL，10μL～100μL。

D.1.8多通道移液器：50μL～300μL。

D.1.9培養(yǎng)皿：直徑90mm。

D.1.10試管、試管架：15mm×150mm，15mm×100mm。

D.1.11微孔板（≥500μL/孔）。

D.1.12一次性針頭過濾器（≤0.22μm）、注射器（5mL）。

D.2試劑和培養(yǎng)基

D.2.1水：GB/T6682，二級。

D.2.20.45%氯化鈉緩沖液。

D.2.3二甲基甲酰胺：分析純。

D.2.4氫氧化鈉：分析純。

D.2.575%酒精。

D.2.6藥敏紙片。-20℃保存，藥物種類及其溶解試劑見表D.1。藥敏紙片可從可靠的供應(yīng)商采購或自

行制備。

D.2.7抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品?？咕幬锓N類參見表D.1，標(biāo)準(zhǔn)品由獸藥管理部門指定單位提供。

D.2.8水解酪蛋白瓊脂（Mueller-HintonAgar,MHA）：參見C.2。

D.2.9水解酪蛋白肉湯（Mueller-HintonBroth,MHB）：參見C.3。

D.3紙片擴(kuò)散法

D.3.1制備菌懸液

從培養(yǎng)16h～24h的BHIA斜面上挑取純培養(yǎng)菌，用0.45%氯化鈉緩沖液配制成1.0×108CFU/mL～2.0

×108CFU/mL的菌懸液。

D.3.2接種平板

制好的菌懸液應(yīng)在15min內(nèi)使用。用微量移液器取100μL到MHA平板上，滅菌玻璃涂布棒涂勻。

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D.3.3貼藥敏紙片

用滅菌的鑷子取藥敏紙片貼到D.3.2接種好的MHA平板上，鑷子輕按藥敏紙片，使藥敏紙片與培養(yǎng)基

緊密相貼。每個培養(yǎng)皿均勻貼四片，標(biāo)記藥物名稱、菌株名稱和培養(yǎng)時間等。于28℃±2℃(殺鮭氣單

胞菌為22℃±2℃)孵育15min。

D.3.4測抑菌圈直徑

將D.3.3孵育后的平板倒置于28℃±2℃(殺鮭氣單胞菌為22℃±2℃)生化培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h

±2h后，觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺或直尺測量抑菌圈直徑（mm）。

D.3.5結(jié)果解釋

按照表D.1的標(biāo)準(zhǔn)對抑菌圈大小作出解釋，判斷病原菌對抗菌藥物敏感或耐藥。

表D.1魚類病原菌的抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)和相對應(yīng)的最低抑菌濃度值（MIC）

藥敏片含量MIC（mg/L）抑菌圈直徑（mm）

藥物種類藥名配制母液的溶劑

（μg/片）敏感耐藥耐藥敏感

磺胺類藥物磺胺甲噁唑1mol/LNaOH300≤100≥350≤14≥17

磺胺類藥物磺胺嘧啶1mol/LNaOH300≤100≥350≤14≥17

磺胺類藥物磺胺二甲嘧啶1mol/LNaOH300≤100≥350≤14≥17

磺胺類藥物磺胺間甲氧嘧啶1mol/LNaOH300≤100≥350≤13≥17

四環(huán)素類鹽酸多西環(huán)素蒸餾水30≤4≥16≤13≥16

氨基糖苷類硫酸新霉素蒸餾水10≤4≥16≤12≥16

酰胺醇類氟苯尼考0.1mol/L二甲基甲酰胺30≤4≥16≤13≥18

酰胺醇類甲砜霉素0.1mol/L二甲基甲酰胺30≤4≥16