液相色譜法(共34張課件)

液相色譜法第1頁，共34頁。1月6日(星期日)補1月3日（星期四）的課程第2頁，共34頁。第十章高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC一、HPLC概述二、高效液相色譜儀三、高效液相色譜法的類型第3頁，共34頁。一、高效液相色譜法概述氣相色譜：流動相為氣體液相色譜：流動相為液體，70年代以后，在高壓下輸送流動相，稱之為高效液相色譜（高壓液相色譜），簡稱為HPLC。HPLC與GC主要差別：分析對象差別

GC（20％）：能氣化、熱穩(wěn)定性好且沸點較低的樣品，

HPLC（80％）：溶解后能制成溶液的樣品，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測流動相差別GC：流動相為惰性氣體；組分與流動相無作用力，只與固定相作用HPLC：流動相為液體（種類多，另可選用不同比例的多種液體作為流動相）；流動相與組分間有親合作用力，柱選擇性好、分離效果佳操作條件差別GC：加溫操作HPLC：室溫；高壓第4頁，共34頁。二、高效液相色譜儀高效液相色譜儀簡單流程圖第5頁，共34頁。2.1高壓輸液系統(tǒng)貯液器：貯存流動相，由玻璃、不銹鋼或氟塑料作成（0.5~2L）高壓泵：作用：將貯液器中的流動相以高壓（150～350×105Pa）形式連續(xù)不斷地送入柱系統(tǒng)性能：高壓、恒流、壓力變化小、流量范圍可調(diào)、耐腐蝕、密封性好主要類型：往復(fù)式柱塞泵（恒流）當(dāng)柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進(jìn)入的單向閥（下部）關(guān)閉，這時就輸出少量的流體。反之，當(dāng)柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關(guān)閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。第6頁，共34頁。（內(nèi)梯度）（外梯度）梯度洗脫置（程序升溫裝置）：概念：在分離過程中使用兩種或兩種以上的不同極性的溶液為流動相，通過不斷改變它們之間的比例，從而使流動相的強度、極性、pH或離子強度相應(yīng)的改變，從而使各組分以它們的最佳k’值通過色譜柱，達(dá)到高的分離效果。分類：內(nèi)梯度和外梯度第7頁，共34頁。LC梯度洗脫與GC程序升溫的比較a、弱溶劑時，k’大的組分未流出；b、強溶劑時，k’小的組分分不開；c、中等強度溶劑時，k’小的組分1，2分不開；d、梯度洗脫，各組分得到良好的分離第8頁，共34頁。2.2進(jìn)樣系統(tǒng)作用：把分析試樣有效地送入色譜柱進(jìn)樣方式：微量注射器；進(jìn)樣閥（耐高壓的六通閥：自動化進(jìn)樣、重現(xiàn)性好）第9頁，共34頁。2.3分離系統(tǒng)（色譜柱）作用：實現(xiàn)組分的分離性能：直形（由不銹鋼制成）；內(nèi)徑：2~6mm；長度：10~50cm2.3檢測系統(tǒng)作用：檢測并收集各組分類型：溶質(zhì)型檢測器和總體檢測器兩種溶質(zhì)型檢測器：對被分離組分的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，例：紫外、DAD、熒光、電化學(xué)檢測器等總體檢測器：對試樣和洗脫液總的物理或物理化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，例：示差折光、介電常數(shù)檢測器等第10頁，共34頁。紫外檢測器：應(yīng)用最廣，可用于梯度洗脫，對大部分有機化合物有響應(yīng)光源：低壓汞燈，254或280nm（固定波長）；氫燈、氘燈，200-400nm（可調(diào)波長）檢測池：很小，（1mm×10mm，容積小于10μL）；接收元件：光電倍增管二極管陣列檢測器（DAD)：可得到所有波長上的色譜信號第11頁，共34頁。

紫外檢測器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測器：計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。第12頁，共34頁。脲的取代物與氨基甲酸酯的高速分離降低背景電導(dǎo)(淋洗液)：減少噪音化學(xué)鍵合相色譜（CBPC)化學(xué)鍵合相色譜（CBPC)聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相C18（簡稱ODS）、C8粘度小，以此提高柱效硝基苯胺異構(gòu)體在10m氧化鋁上的LSC分離淋洗液：9mmol/LNa2CO3

流速：1mL/min

進(jìn)樣量：25μLHPLC與GC主要差別：HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC電導(dǎo)檢測器：檢測具有電導(dǎo)性化合物的通用型檢測器，最常用。主要測定高氯物質(zhì)中的NO2-，NO3-等離子惠普公司—1100型液相色譜儀第13頁，共34頁。三、HPLC的主要類型及分離原理流動相要求：流動相純度高不使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑能溶解樣品，但不與樣品發(fā)生反應(yīng)粘度小，以此提高柱效與所選用的檢測器匹配固定相分類：承受壓力：剛性固體（可承受高壓，以二氧化硅為基質(zhì)，表面鍵合各種官能團(tuán)，成化學(xué)鍵合固定相）；硬膠（承受壓力低，由聚苯乙烯和二乙基苯交連而成）孔隙深度：表面多孔型和全多孔型第14頁，共34頁。液固色譜（LSC,liquid-solidadsorptionchromatography）固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑?；驹恚航M分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；

第15頁，共34頁。應(yīng)用：用于分離相對分子量中等的油溶性物質(zhì)，另用于分離不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體。缺點：非線性等溫吸附常引起峰的拖尾現(xiàn)象（2）應(yīng)用和缺點脲的取代物與氨基甲酸酯的高速分離第16頁，共34頁。硝基苯胺異構(gòu)體在10

m氧化鋁上的LSC分離第17頁，共34頁。液液分配色譜（LLPC)固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。第18頁，共34頁。固定相：將固定液化學(xué)鍵合于載體（硅膠）表面形成固定相固定相類型：極性固定相：正相色譜以極性有機基團(tuán)如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等鍵合在硅膠表面制成的非極性固定相：反相色譜反相色譜法最常用的固定相是C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）和苯基鍵合相的填料?；瘜W(xué)鍵合相色譜（CBPC)固定相使用條件：為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值，但需要注意的是，C18使用的pH值通常為2.5~7.5。太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。第19頁，共34頁。正相色譜法反相色譜法1.極性固定相聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對非極性流動相正已烷、環(huán)已烷3.極性調(diào)節(jié)劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強化合物.

酚類、胺類、羰基類及氨基酸類5.組分流出順序極性小先洗出1.非極性固定相C18（簡稱ODS）、C82.極性流動相水或緩沖液3.極性調(diào)節(jié)劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物占整個HPLC應(yīng)用的80%左右5.組分流出順序極性大先洗出第20頁，共34頁。IC是HPLC的一種，是分析水溶液中陰離子的最佳方法。固定相是離子交換樹脂，流動相是淋洗液(強電解質(zhì))；電導(dǎo)檢測器。常用的淋洗劑是Na2CO3-NaHCO3混合液。只要改變兩種物質(zhì)的濃度比，就可以得到不同淋洗能力和pH值的流動相。為消除淋洗液中強電解質(zhì)背景離子對電導(dǎo)檢測器的干擾，設(shè)置了抑制柱或抑制器。離子色譜法（IC）第21頁，共34頁。ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＣＯ３２－ＳＯ４２－ＨＣＯ３－Ｃｌ－ＳＯ４２－Ｃｌ－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－臨時過程ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＣＯ３２－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋ＨＣＯ３－ＳＯ４２－ＣＯ３２－ＣＯ３２－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－ＨＣＯ３－Ｃｌ－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋（1）原理：離子交換（離子價態(tài)和離子半徑）第22頁，共34頁。淋洗液瓶Pump保護(hù)柱分析柱抑制器裝置電導(dǎo)池色譜工作站淋洗液輸送離子交換分離抑制電導(dǎo)檢測數(shù)據(jù)采集和儀器控制樣品注射（2）離子色譜結(jié)構(gòu)第23頁，共34頁。電導(dǎo)檢測器：檢測具有電導(dǎo)性化合物的通用型檢測器，最常用。溶液至檢測池電極檢測池抑制器：安裝在電導(dǎo)池之前提高待測離子的電導(dǎo)率：提高靈敏度Na+,Cl-H+,Cl-

降低背景電導(dǎo)(淋洗液)：減少噪音Na+,HCO3-H2CO3Na+,OH-H2O第24頁，共34頁。極限摩爾電導(dǎo)值

陽離子

＋－陰離子

Ｈ＋Ｌｉ＋Ｎａ＋Ｋ＋ＮＨ４＋Ｍｇ２＋Ｃａ２＋ＯＨ－Ｆ－Ｃｌ－Ｂｒ－ＮＯ３－ＰＯ４３－ＳＯ４２－198554678718080（單位：μS/m當(dāng)量）350395074735360第25頁，共34頁。抑制器的作用背景：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～保留時間電導(dǎo)NaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4背景：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～保留時間電導(dǎo)HFHClHNO3H3PO4H2SO4保留時間背景：H2CO3(15μS)電導(dǎo)第26頁，共34頁。免試劑離子色譜（Reagent-Free?）：傳統(tǒng)離子色譜的問題——手工配制淋洗液和再生液（3）離子色譜的最新發(fā)展離子色譜樣品前處理常規(guī)樣品離子分析痕量離子分析大體積進(jìn)樣在線濃縮復(fù)雜基體中離子的處理預(yù)處理小柱第27頁，共34頁。分離原理：基于分子尺寸的大小進(jìn)行分離，樣品組分與固定液間不存在相互作用現(xiàn)象溴離子 25

7.分離非極性和極性較弱化合物固定相的排阻極限：因分子量過大而不能部分地進(jìn)入某一給定固定相孔內(nèi)的最小的樣品粒子的分子量脲的取代物與氨基甲酸酯的高速分離C18預(yù)處理小柱、On-GuardRP\P柱——去除有機分子貯液器：貯存流動相，由玻璃、不銹鋼或氟塑料作成（0.應(yīng)用：用于分離相對分子量中等的油溶性物質(zhì)，另用于分離不同官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體。電導(dǎo)檢測器：檢測具有電導(dǎo)性化合物的通用型檢測器，最常用。4.降低背景電導(dǎo)(淋洗液)：減少噪音電導(dǎo)檢測器：檢測具有電導(dǎo)性化合物的通用型檢測器，最常用。二極管陣列檢測器（DAD)：可得到所有波長上的色譜信號Na2HPO4,Na2SO4Na2HPO4,Na2SO4液液分配色譜（LLPC)SPE小柱過濾：樣品中有顆粒狀物質(zhì)基體消除：*去除樣品中所包含的，有可能損壞儀器或者影響色譜柱/抑制器性能的成分——重金屬離子、有機大分子*去除樣品中所包含的，有可能干擾目標(biāo)離子測定的成分——高離子強度基體0.22，0.45um濾膜——去除顆粒狀雜質(zhì)C18預(yù)處理小柱、On-GuardRP\P柱——去除有機分子On-GuardH柱——去除溶液中的金屬離子On-GuardAg柱——去除溶液中的Cl-離子主要測定高氯物質(zhì)中的NO2-，NO3-等離子On-GuardBa柱——去除溶液中的硫酸根第28頁，共34頁。水中陰陽離子測定的樣品前處理第29頁，共34頁。（4）應(yīng)用：在IonPacAS9-HC上分離消毒副產(chǎn)物色譜柱：IonPacAG9-HC,AS9-HC淋洗液：9mmol/LNa2CO3

流速：1mL/min

進(jìn)樣量：25μL色譜峰：1.氟離子3 mg/L2.亞氯酸根 103.溴酸