醫(yī)學(xué)資料 DNA基因測(cè)序

毛細(xì)管凝膠電泳與DNA基因測(cè)序

趙志峰DNA是主要的遺傳物質(zhì)資料1：20世紀(jì)30年代，科學(xué)家認(rèn)識(shí)到：組成DNA分子的基本單位是

。脫氧核苷酸1分子磷酸1分子脫氧核糖1分子含氮堿基高中知識(shí)回顧1分子脫氧核苷酸=

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.【模型建構(gòu)1】:脫氧核苷酸堿基AGCT磷酸脫氧核糖ACT腺嘌呤脫氧核苷酸鳥(niǎo)嘌呤脫氧核苷酸胞嘧啶脫氧核苷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸G脫氧核苷酸的種類(lèi)1、DNA分子結(jié)構(gòu)主要特點(diǎn)DNA分子是有

條鏈組成，

盤(pán)旋成

結(jié)構(gòu)。

交替連接，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架；

排列在內(nèi)側(cè)。堿基通過(guò)

連接成堿基對(duì)，并遵循

原則。反向平行雙螺旋脫氧核糖和磷酸堿基對(duì)氫鍵堿基互補(bǔ)配對(duì)2AP脫氧核糖GP脫氧核糖CP脫氧核糖TP脫氧核糖脫氧核糖APGPCPTP脫氧核糖脫氧核糖脫氧核糖DNA分子的復(fù)制1.條件：

(1)模板：解旋的DNA兩條單鏈

(2)原料：脫氧核苷酸

(3)能量：ATP

(4)酶：解旋酶、DNA聚合酶2.特點(diǎn):

(1)邊解旋邊復(fù)制

(2)半保留復(fù)制3.“準(zhǔn)確”復(fù)制的原理：

（1）DNA分子獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)，為復(fù)制提供了精確的模板；

（2）堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，保證了復(fù)制能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行。

元素周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀(jì)物理、化學(xué)研究和發(fā)展的基礎(chǔ)元素周期表“基因組序列圖”將奠定二十一世紀(jì)生命科學(xué)研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)！

“基因組”----生命科學(xué)的“元素周期表”人體解剖圖奠定了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)生命的奧秘蘊(yùn)藏于“四字天書(shū)”之中…GCTTCTTCCTCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCATCATTTTCTCTTGCCGCCACCATGCTTCTTCCTCATTTTCTCTCCACCATGCCGCCACCACGCCACCATGCTTCTTCCTCATCTCGCTTTCTTGCCGCCACCATGCCGCCACCGCTTCTTCCtTCTCT…DNA測(cè)序的基本原理一、脫氧鏈終止法測(cè)序

基本原理：

利用DNA聚合酶，以待測(cè)單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系，在每個(gè)反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測(cè)序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對(duì)原則，每個(gè)反應(yīng)體系中合成一系列長(zhǎng)短不一的引物延伸鏈，通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測(cè)后，從凝膠底部到頂部按5′→3′方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列。用于終止反應(yīng)的雙脫氧核苷酸：將2’，3’–雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3’–羥基，因此不能與下一位核苷酸反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應(yīng)將中止。O堿基CPOH12345O堿基CPHH12345H2O脫氧核苷酸的連接O堿基CPHH12345O堿基CPOHH12345OHX雙脫氧核苷酸…?

在4組相互獨(dú)立的測(cè)序反應(yīng)體系中，分別加入四種不同ddNTP，其余成分相同。調(diào)整每個(gè)測(cè)序反應(yīng)中dNTP與ddNTP的比例，使引物的延伸在對(duì)應(yīng)于待測(cè)模板DNA每個(gè)可能摻入的位置都有可能發(fā)生終止。電泳電泳:帶電顆粒在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱(chēng)為電泳正極負(fù)極帶負(fù)電粒子帶正電粒子凝膠電泳定義：凝膠電泳利用凝膠的分子篩作用使分子大小不同的電解質(zhì)得到分離：相對(duì)分子質(zhì)量大的溶質(zhì)受凝膠阻滯作用大，泳動(dòng)速度較慢，小分子溶質(zhì)泳動(dòng)速度較快。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的電泳后，根據(jù)溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的不同，凝膠中形成數(shù)條含有不同溶質(zhì)的區(qū)帶，實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)之間的相互分離。毛細(xì)管凝膠電泳將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類(lèi)似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無(wú)關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。特點(diǎn)：抗對(duì)流性好，散熱性好，分離度極高。無(wú)膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線(xiàn)性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。毛細(xì)管

1裝置

毛細(xì)管數(shù)據(jù)處理電極檢測(cè)器電極試樣緩沖液高壓電源

（可高至30KV）

（二）新生鏈的熒光標(biāo)記原理多色熒光標(biāo)記法--熒光標(biāo)記終止底物法定義：將熒光染料標(biāo)記在作為終止底物的雙脫氧單核苷酸上反應(yīng)中將4種ddNTP分別用4種不同的熒光染料標(biāo)記，帶有熒光基團(tuán)的ddNTP在摻入DNA片段導(dǎo)致鏈延伸終止的同時(shí)，也使該片段端標(biāo)上了一種特定的熒光染料經(jīng)電泳后將各個(gè)熒光譜帶分開(kāi)，根據(jù)熒光顏色的不同來(lái)判斷所代表的不同堿基信息

（二）新生鏈的熒光標(biāo)記原理熒光標(biāo)記引物法熒光標(biāo)記引物法原理（二）新生鏈的熒光標(biāo)記原理模板：TCCATGAT產(chǎn)物：AAGAGGAGGTAGGTAAGGTACAGGTACTAGCTGGTTAAC

染料受測(cè)序儀氬離子激光激發(fā)而發(fā)射出特定光譜的四種不同顏色的熒光，同時(shí)，測(cè)序儀的專(zhuān)用激光掃描鏡頭實(shí)時(shí)掃描不同大小的DNA片段在相應(yīng)時(shí)間通過(guò)垂直電泳膠讀數(shù)區(qū)時(shí)發(fā)射的熒光，將不同大小DNA片段發(fā)射的熒光實(shí)時(shí)地傳遞給計(jì)算機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)收集軟件，將電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換成膠圖文件及原始數(shù)據(jù)信號(hào)。當(dāng)電泳完畢后，DNA序列分析軟件通過(guò)分析膠圖文件及原始數(shù)據(jù)信號(hào)，得到最終的測(cè)序結(jié)果。儀器的組成--PE310基因分析儀PE310基因分析儀的結(jié)構(gòu)凝膠塊區(qū)

自動(dòng)進(jìn)樣器區(qū)

檢測(cè)區(qū)

儀器的組成--PE310基因分析儀PE310基因分析儀的主機(jī)分區(qū)熱板毛細(xì)管雷射檢測(cè)器注射器驅(qū)動(dòng)桿毛細(xì)管和電極注射器正極緩沖液泵塊自動(dòng)進(jìn)樣器負(fù)極緩沖液PE310基因分析儀的基本結(jié)構(gòu)DNA的檢測(cè)原理測(cè)序反應(yīng)一般以單引物進(jìn)行DNA聚合酶延伸反應(yīng)，絕大多數(shù)產(chǎn)物均為單鏈反應(yīng)結(jié)束后，樣品經(jīng)簡(jiǎn)單純化處理就可以放置到自動(dòng)測(cè)序儀中開(kāi)始電泳兩極間極高的電勢(shì)差推動(dòng)著各個(gè)熒光DNA片段在凝膠高分子聚合物中從負(fù)極向正級(jí)泳動(dòng)并達(dá)到相互分離，且依次通過(guò)檢測(cè)窗口由激光器發(fā)出的極細(xì)光束，通過(guò)精密的光學(xué)系統(tǒng)被導(dǎo)向檢測(cè)區(qū)，在這里激光束以與凝膠垂直的角度激發(fā)熒光DNA片段

DNA的檢測(cè)原理DNA片段上的熒光發(fā)色基團(tuán)吸收了激光束提供的能量而發(fā)射出特征波長(zhǎng)的熒光代表不同堿基信息的不同顏色熒光經(jīng)過(guò)光柵分光后再投射到CCD攝像機(jī)上同步成像。收集的熒光信號(hào)再傳輸給計(jì)算機(jī)加以處理整個(gè)電泳過(guò)程結(jié)束時(shí)在檢測(cè)區(qū)