CN201510226911.0 - 一種藤梨根提取物及其在制備治療膽管癌藥物中的應用配方專利技術

(21)申請?zhí)?01510226911.0(71)申請人中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院地址110004遼寧省沈陽市和平區(qū)三好街(72)發(fā)明人趙相軒盧再鳴郭啟勇(74)專利代理機構沈陽亞泰專利商標代理有限公司21107代理人史力伏A61KA61P(54)發(fā)明名稱一種藤梨根提取物及其在制備治療膽管癌藥物中的應用管癌細胞株QBC939和HCCC9810細胞作為研究對兩條途徑觀察藤梨根提取物對人膽管癌細胞的生長抑制作用和凋亡誘導作用，結果表明：該藤梨根提取物對人膽管癌細胞活性，生長具有顯著地抑制作用；能夠強烈誘導膽管癌細胞凋亡；能夠顯著抑制膽管癌裸鼠移植腫瘤生長，顯示出良好21.一種藤梨根提取物，是通過下述方法制備得到的：步驟1、取藤梨根片狀藥材，采用蒸餾水快速漂洗；然后采用70%酒精快速漂洗，風冷吹干蒸餾水和酒精；步驟2、采用高速粉碎機間歇式粉碎至特細顆粒，得藤梨根藥材干粉；步驟3、精確稱取藤梨根藥材干粉，用95%乙醇室溫浸泡24h,過濾，得藤梨根藥渣；步驟4、所述藤梨根藥渣采用75%乙醇室溫浸泡24h,過濾，棄掉藥渣，得藤梨根浸出步驟5、所述藤梨根浸出液采用水浴減壓蒸餾濃縮，得濃縮浸出液；步驟6、所述濃縮浸出液4℃靜置一周，待靜置的濃縮浸出液自然分層后，吸取上層黑褐色液體；步驟7、所述黑褐色液體進行高速離心，去除不溶解的沉淀物；步驟8、采用移液器吸取上清液；步驟9、采用針頭注射器使上清液通過0.22μm濾膜，然后分裝到無菌EP管中，放入冰箱4℃保存，備用；2.如權利要求1所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步驟2中高速粉碎機的轉數為3.如權利要求2所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步驟2中特細顆粒的粒度為300-500目。4.如權利要求3所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步驟2中間歇式粉碎為離心1min,停歇3-5min。5.如權利要求4所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步驟4中藤梨根浸出液4℃保6.如權利要求5所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步驟5中水浴溫度為50℃。7.如權利要求6所述的藤梨根提取物，其特征在于，所述步驟7中黑褐色液體12000rpm高速離心30min。8.權利要求1所述的藤梨根提取物在制備治療膽管癌藥物中的應用。3技術領域結構的藥物制劑技術領域，具體涉及雙子葉植物綱的藤梨根；本發(fā)明是利用特殊工藝得到的藤梨根提取物，并在制備治療膽管癌藥物中的應用。背景技術[0002]膽管癌是起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，近年來，其發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢。目前膽管癌的主要治療手段是早期發(fā)現(xiàn)，進行手術切除。然而由于其惡性程度高，發(fā)病隱匿，大多數患者在確診時已處于晚期，不適合手術切除。同時該膽管癌對目前現(xiàn)有的到對膽管癌更為有效的藥物。[0003]中藥是中華民族數千年來與疾病做斗爭過程中形成和積累的寶貴資源，目前世界各國對中藥抗腫瘤的機制進行了廣泛的研究，從中草藥得到提取物或者單體并開展腫瘤治療的應用越來越多，并開始得到國內外的承認和重視。中藥抗腫瘤機制有多方面，如抑制腫瘤血管形成、促進細胞凋亡、誘導細胞分化、調節(jié)機體免疫功能等。藤梨根為獼猴桃科植物風濕性關節(jié)炎、胃癌和乳腺癌等疾病的中草藥，尤其對消化道腫瘤療效較佳。近年來體內外實驗研究發(fā)現(xiàn)，藤梨根制劑對多種腫瘤(如胃癌、結腸癌、食管癌、肺癌腫瘤細胞)表現(xiàn)出較好的抑制作用，可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，其藥理研究和臨床驗證受到廣泛關注；而有關藤梨根提取物(RadixActinidiaExtractive,RAE)對膽管癌的作用研究尚未見報道。[0004]現(xiàn)有的提取工藝一般是采用水或有機溶劑進行浸提，然后通過乙酸乙酯和正丁醇萃取，再利用石油醚-丙酮，氯仿-甲醇或者聚酰胺進行洗脫，最后得到藤梨根提取物。這樣的提取工藝的缺點是工藝繁雜，極易導致提取物中活性成分丟失或者失活而大大降低藥發(fā)明內容[0005]本發(fā)明就是針對上述問題，彌補現(xiàn)有技術的不足，提供一種藤梨根提取物及其在制備治療膽管癌藥物中的應用。該藤梨根提取物對人膽管癌細胞活性，生長具有顯著地抑制作用；能夠強烈誘導膽管癌細胞凋亡；能夠顯著抑制膽管癌裸鼠移植腫瘤生長，顯示出良好的抗膽管癌活性。[0006]為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案，即本發(fā)明提供的藤梨根提取物是通過下述方法制備得到的。冷吹干蒸餾水和酒精。[0008]步驟2、采用高速粉碎機間歇式粉碎至特細顆粒，得藤梨根藥材干粉；所述間歇式粉碎為離心1min,停歇3-5min,使得粉碎機轉頭恢復至室溫，方可再次啟動進行粉碎；所述4高速粉碎機的轉數為20000rpm-30000rpm,所述特細顆粒的粒度為300-500目。[0009]步驟3、精確稱取藤梨根藥材干粉，用95%乙醇室溫浸泡24h,過濾，得藤梨根藥渣。[0010]步驟4、所述藤梨根藥渣采用75%乙醇室溫浸泡24h,過濾，棄掉藥渣，得藤梨根浸出液；所述藤梨根浸出液4℃保存。[0012]步驟6、所述濃縮浸出液4℃靜置一周，待靜置的濃縮浸出液自然分層后，吸取上層黑褐色液體。[0015]步驟9、采用針頭注射器使上清液通過0.22μm濾膜，然后分裝到無菌EP管中，放[0017]本發(fā)明還提供所述藤梨根提取物在制備治療膽管癌藥物中的應用。[0018]與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明的有益效果。賴性；(2)RAE可以強烈誘導兩種膽管癌細胞凋亡，有效激活細胞內的凋亡蛋白激酶，如Caspase3,Caspase8和PARP;(3)RAE能夠顯著抑制膽管癌抑制瘤在動物體內生長。綜上所述，本發(fā)明制備的藤梨根提取物能夠在體內、外顯著抑制膽管癌細胞生長，并誘導其細胞凋亡，為治療膽管癌臨床藥物的開發(fā)提供了新的方向。[0020]圖1為本發(fā)明藤梨根提取物制備方法的流程圖。抑制作用呈濃度梯度依賴性示意圖。種抑制作用呈濃度梯度依賴性示意圖。[0023]圖4為RAE對QBC939膽管癌細胞具有強烈凋亡誘導作用的可見光顯微鏡細胞形態(tài)學變化圖。[0024]圖5為RAE對HCCC9810膽管癌細胞具有強烈凋亡誘導作用的可見光顯微鏡細胞形態(tài)學變化圖。[0025]圖6為RAE對QBC939膽管癌細胞具有強烈凋亡誘導作用的熒光顯微鏡細胞核染[0026]圖7為RAE對HCCC9810膽管癌細胞具有強烈凋亡誘導作用的熒光顯微鏡細胞核染色圖。[0027]圖8為RAE對QBC939膽管癌細胞具有強烈的凋亡誘導作用的流式細胞儀定量檢5[0028]圖9為RAE對HCCC9810膽管癌細胞具有強烈的凋亡誘導作用的流式細胞儀定量[0030]圖11為RAE對HCCC9810膽管癌細胞具有強烈的凋亡誘導作用的三次實驗統(tǒng)計結[0031]圖12為RAE對膽管癌細胞具有強烈的凋亡誘導作用的蛋白酶切割圖。[0032]圖13為RAE對膽管癌細胞裸鼠移植腫瘤具有明顯的生長抑制作用的大鼠模型對[0033]圖14為RAE對膽管癌細胞裸鼠移植腫瘤具有明顯的生長抑制作用的移植腫瘤大[0034]圖15為RAE對膽管癌細胞裸鼠移植腫瘤具有明顯的生長抑制作用的腫瘤質量平均值對照圖。具體實施方式[0035]請參閱圖1,本實施例提供的藤梨根提取物是通過下述方法制備得到的。[0036]步驟1、取藤梨根片狀藥材，采用蒸餾水快速漂洗，去除藥材表面灰塵和其他附著物；然后采用70%酒精快速漂洗，去除藥材表面附著細菌及其他有害生物；風冷吹干蒸餾水[0037]步驟2、采用25000rpm高速粉碎機粉碎至300目顆粒，得藤梨根藥材干粉；所述粉碎為間歇式粉碎，即離心1min,停歇3min,以避免溫度高于50℃;使得粉碎機轉頭恢復至室溫(25℃左右),方可再次啟動進行粉碎。[0038]步驟3、精確稱取500.00g藤梨根藥材干粉，用2L95%乙醇室溫浸泡24h,過濾，得藤梨根藥渣。[0039]步驟4、所述藤梨根藥渣采用75%乙醇室溫浸泡24h,過濾，棄掉藥渣，得藤梨根浸出液；所述藤梨根浸出液4℃保存。[0040]步驟5、所述藤梨根浸出液采用50℃水浴減壓蒸餾，濃縮至50ml,得濃縮浸出液。[0041]步驟6、所述濃縮浸出液4℃靜置一周，待靜置的濃縮浸出液自然分層后，吸取上層黑褐色液體。[0042]步驟7、所述黑褐色液體進行12000rpm高速離心30min,去除不溶解的沉淀物。[0044]步驟9、采用針頭注射器使上清液通過0.22μm濾膜，去除不溶解的微細顆粒和細菌等；然后分裝到1.5ml無菌EP管中，放入冰箱4℃保存，備用。長期放置可導致白色析出[0045]步驟10、使用前恢復到室溫25℃,即得藤梨根提取物。使用前恢復到室溫25℃,可使長期放置導致的白色析出物重新溶解。[0046]本實施例還提供所述藤梨根提取物在制備治療膽管癌藥物中的應用。[0047]為進一步說明本發(fā)明的有益效果，以下提供臨床前應用報告中的試驗案例。6[0049]1.1細胞株：人膽管癌細胞株購于南京凱基生物公司。[0050]1.2主要藥品及試劑：藤梨根片狀藥材(購于沈陽恒秋醫(yī)藥公司)。采用本實施例制備方法得到藤梨根提取物，使用時用DMEM培養(yǎng)基稀釋成低濃度組(1.25mg/ml),中濃度組(2.5mg/ml)和高濃度組(5mg/ml);DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(Gibco公司);0.25%胰蛋白酶(HyClone公司);PBS(HyClone公司);DMSO(Sigma公司);MTS(Promega公司);Hoechst33342(碧云天生物科技公司);AnnexinV-FITC/PI(凱基生物公司);Caspase-3,Caspase-8,PARP(購自cellsignaling公司);ECL顯色液(Thermo);脫脂奶粉(伊利);BSA(Promega);吐溫緩沖液(Thermo);PVDF膜(Millipore)。[0051]1.3主要儀器及設備：超凈工作臺(江蘇安泰空氣技術有限公司，型號SW-CJ-2FD);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國熱電ThermoSci,型號371);低溫離心機(德國Eppendorf,型號5340R);酶標儀(美國Biotek,型號SynergyH1);流式細胞儀(BD公司，型號ACurriC6);熒光顯微鏡(日本尼康，型號：TS100-F);紫外分光光度儀(德國Implen公司，型號P-330-31-10),電子天平(瑞士普利賽斯，型號EP220A)。[0052]1.4數據使用SPSS13.0進行處理，采用均數±標準差形式表示數據，組間比較采用單因素方差分析，*p<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。[0054]2.1QBC939和HCCC9810兩種[0056]①復蘇：從液氮罐中取出凍存的QBC939膽管癌細胞，37℃水浴鍋中晃動溶解后，將凍存管中的膽管癌細胞移至含5mlDMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，吹打混勻，觀察細胞懸浮均[0057]②傳代：當細胞單層鋪滿瓶底時，將細胞從培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內的培養(yǎng)液，加入3ml無菌磷酸鹽緩沖液沖洗，加2ml0.25%胰酶消化3min,在倒置顯微鏡下觀察被消化的細胞，待細胞變圓、脫落時，加入10ml培養(yǎng)液，吹打混勻成細胞懸液，胞懸液分裝于兩瓶培養(yǎng)瓶中，送回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。實驗時選用對數生長期細胞。[0058](2)HCCC9810膽管癌細胞的培養(yǎng)，具體步驟與上述QBC939膽管癌細胞的培養(yǎng)類[0059]2.2MTS法檢測RAE對膽管癌細胞的增殖抑制作用。[0060]MTS實驗是一種用比色法來檢測細胞增殖的實驗方法，MTS可被細胞生物還原成為一種有色的甲攢產物，可直接溶解于培養(yǎng)基中。這種轉化很可能是在代謝活躍的細胞中中的活細胞數成正比。因此MTS能夠客觀評價活細胞的生存和增殖的狀況，是抗腫瘤藥物篩選的重要檢測途徑。[0061]本實施例采用MTS法檢測RAE對QBC939膽管癌細胞的增殖抑制作用，具體步驟如[0062](1)收集對數生長期細胞，調整細胞懸液濃度為5×10?個/ml種入96孔板，每孔加入100μ1。[0063](2)培養(yǎng)24h使細胞貼壁。更換培養(yǎng)液后濃度梯度組分別加入1.25mg/ml、2.5mg/7ml、5mg/ml濃度的RAE處理細胞48h,同時設立對照組，每組設置3個復孔。[0064](3)處理結束后，取出96孔板，每孔加入20μ1MTS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2h。[0065](4)取出后用酶標儀在490nm處測量各孔的吸光度值(OD值)。增殖存活率(100%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。該實驗重復三次。[0066]本實施例采用MTS法檢測RAE對HCCC9810膽管癌細胞的增殖抑制作用，具體步驟與上述膽管癌QBC939細胞類似，因此不再贅述。對膽管癌細胞增殖的抑制情況，發(fā)現(xiàn)各濃度組的RAE均可明顯抑制QBC939和HCCC9810細[0068]2.3凋亡細胞形態(tài)學觀察。[0069]取對數生長期膽管癌QBC939細胞，消化重懸為1×10?個/ml的單細胞懸液，每孔2ml接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h待細胞貼壁。濃度梯度組分別加入含1.25mg/ml、[0070]本實施例中膽管癌HCCC9810細胞凋亡處理過程與上述膽管癌QBC939細胞類似，因此不再贅述。[0071]請參閱圖4和圖5,處理完畢后，先在可見光顯微鏡下分別進行兩種膽管癌細胞形態(tài)觀察，并分別拍攝照片。對照組細胞在可見光顯微鏡觀察下，表現(xiàn)生長旺盛，貼壁伸展良好，細胞透光度好，無懸浮細胞。隨著RAE濃度增加及作用時間延長，貼壁細胞密度逐漸箱內繼續(xù)孵育15min后取出，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化及細胞核染色情況并拍照。請參閱圖6和圖7,Hoechst33342染色后在熒光顯微鏡下觀察正常細胞核呈彌散均勻熒光，濃度梯度組細胞則表現(xiàn)為濃染致密的顆粒塊狀熒光，可見細胞凋亡的特征性形態(tài)改變出現(xiàn)(凋亡細胞的細胞核出現(xiàn)染色質凝集和片段化斷裂)。[0072]綜上，由圖4-圖7可見，RAE對QBC939和HCCC9810膽管癌細胞均具有強烈凋亡[0073]2.4流式細胞術檢測細胞凋亡。[0074]細胞凋亡指為維持內環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。細胞凋亡及增殖異常是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，誘導腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑之一。流式細胞術是常用來檢測細胞凋亡的實驗方法，它可以鑒定細胞凋亡生化分子事件，以準確的進行凋亡細胞的計數并特異的定性分析和定量分析。[0075]本實施例采用流式細胞術檢測膽管癌QBC939細胞凋亡，具體步驟如下。[0076](1)細胞分組：取對數生長期膽管癌QBC939細胞，消化重懸為1×10?個/ml的單細胞懸液，每孔2ml接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h待細胞貼壁。濃度梯度組分別加入1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml濃度的RAE處理細胞48h,同時設立對照組，每組設置3個重[0077](2)收集細胞：收集所有細胞，2000轉/min,4℃離心5min;棄上清留沉淀，加入1ml冷的PBS,輕輕震蕩使細胞懸濁；2000轉/min,4℃離心5min,棄上清；將細胞重懸于8500μ1BindingBuffer中；加入5μ1AnnexinV-FIFC,輕輕混勻，避光室溫反應15min;加入5μ1PI,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。[0078]本實施例采用流式細胞術檢測膽管癌HCCC9810細胞凋亡，具體步驟與上述膽管[0079]請參閱圖8、圖9、圖10及圖11,本實施例采用不同濃度的RAE分別作用于QBC939<0.05)。由此可見，RAE可顯著誘導QBC939和HCCC9810膽管癌細胞發(fā)生凋亡。[0081]細胞凋亡是一個多基因參與的復雜的生命過程，Caspase8和Caspase3是凋亡信號傳導中的關鍵效應分子。正常細胞中Caspase8和Caspase3以酶原形式存在于胞漿，細胞凋亡早期Caspase8被上游信號激活后可以激活下游的Caspase3,活化的Caspase3進而裂解下游蛋白底物PARP,將PARP剪切為2個片段，導致其失去DNA修復功能，誘發(fā)細胞凋[0082]本實施例采用免疫印跡法檢測凋亡相關蛋白，具體步驟如下。[0083](1)收集蛋白樣品。[0084]取對數生長期混懸均勻的QBC939細胞于培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h待細胞貼壁。棄舊培養(yǎng)液，濃度梯度組分別加入1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml濃度的RAE處理[0085]細胞刷刮取處理好的細胞，1000rpm離心5min后棄上清，PBS(磷酸鹽緩沖液)清洗后加入細胞裂解液裂50μ1,冰上放置30min,12000r/min,4℃離心10min,收集上清(蛋[0086]考馬斯亮藍1:1000染色，分光光度儀測595nm的吸光值，根據測得結果配平蛋白[0087](2)電泳(Electrophoresis)。[0088]①SDS凝膠配制：層積膠及分離膠參考《分子克隆實驗指南》相關章節(jié)進行[0089]②樣品處理：在收集的蛋白樣品中加入30μ16×loadingbuffer,100℃煮沸[0090]③上樣與電泳：樣品冷卻到室溫后，把蛋白樣品上樣到SDS膠加樣孔內，每孔20μ1。[0091]樣本在上層膠時使用60V電泳，進入下層膠時使用100V電泳。溴酚藍到達膠的底端附近停止電泳。[0093]⑤洗膜：吐溫緩沖液漂洗PVDF膜10min。[0094]⑥一抗孵育：參考一抗的說明書，按照適當比例稀釋一抗。將PVDF膜置于相應稀釋好的一抗，室溫搖床上緩慢搖動孵育4h,或者4℃緩慢搖動孵育過夜。處理后加入吐溫緩沖液，在搖床上緩慢搖動洗滌10min。[0095]⑦二抗孵育：參考二抗的說明書，用5%牛奶按照適當比例稀釋二抗。將洗好的9PVDF膜置于相應稀釋好的二抗，室溫搖床上緩慢搖動孵育2h。處理完畢后加吐溫緩沖液，在搖床上緩慢搖動洗滌20min。專用的壓片暗盒壓片，用顯影液和定影液進行手工洗片。[0097]請參閱圖12,隨著RAE藥物濃度增加，活化型Caspase-3、Caspase-8及剪切的PARP顯著增加。本實施例的免疫印跡實驗觀察到活化型Caspase-3和剪切的PARP的表是細胞凋亡的外源性通路中的關鍵效應分子，活化的Caspase-8可激活下游Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白。免疫印跡實驗結果中實驗組活化型Caspase-8表達上調，由此推斷RAE對QBC939細胞的凋亡誘導作用可能與外源性凋亡誘導通路有關。[0098]2.6體內實驗。[0099]收集對數生長期的QBC939細胞，制成細胞懸液，每只鼠給予106個/100μ1細胞接予腹腔注射50mg/ml的RAE200μ1,對照組給予等量生理鹽水。作用2周后，小鼠二氧化碳麻醉處死，體外觀察腫瘤體積大小(肉眼直接觀察皮下腫瘤大小),如圖13所示。結果顯示，RAE處理組腫瘤體積明顯小于對照組。[0100]裸鼠腋下接種QBC939細胞，成瘤后隨機分為兩組，測量腫瘤大小差異無統(tǒng)計學意義。分別給與生理鹽水和含RAE的生理鹽水2周后，小鼠二氧化碳麻醉處死，腫瘤分別被取出后測量腫瘤大小，如圖14所示，結果表明RAE處