蒙古櫟 SSR 分析技術(shù)規(guī)程

1DB21/TXXXX—2021蒙古櫟SSR分析技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了蒙古櫟SRR分析技術(shù)的定義和術(shù)語(yǔ)、儀器設(shè)備、溶液配制、引物和分析程序。本文件適用于遼寧地區(qū)蒙古櫟的SSR分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T28660馬鈴薯種薯真實(shí)性和純度鑒定SSR分子標(biāo)記LY/T2426棗品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR分子標(biāo)記法LY/T2756白蠟品種分子鑒定方法—SRAP分子標(biāo)記法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1簡(jiǎn)單重復(fù)序列又稱(chēng)微衛(wèi)星DNA，是一類(lèi)由1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位的長(zhǎng)達(dá)幾十至幾百個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。3.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在耐熱DNA聚合酶作用下，于體外快速大量特意擴(kuò)增待定DNA序列的方法。3.3一條互補(bǔ)結(jié)合在模板DNA鏈上的短的單鏈，提供3’-OH末端作為DNA合成的起點(diǎn)，延伸合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。3.4引物擴(kuò)增多態(tài)性一對(duì)引物在兩個(gè)或兩個(gè)以上不同材料基因組DNA之間擴(kuò)增，得到數(shù)目不同或長(zhǎng)度不同的DNA片段。2DB21/TXXXX—20214儀器設(shè)備及試劑儀器設(shè)備及試劑見(jiàn)附錄B。引物相關(guān)信息見(jiàn)附錄C。6溶液配制溶液配制方法見(jiàn)附錄D。7分析程序7.1分析材料采集蒙古櫟新鮮幼嫩葉片為材料提取基因組DNA。選取適量樣品裝入凍存管，液氮速凍后置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?.2DNA的提取a)采用CTAB法提取蒙古櫟基因組DNA。將干凈研缽、研杵、小匙、無(wú)水乙醇預(yù)先放入冰箱中-20℃預(yù)冷，用自來(lái)水、蒸餾水先后沖洗葉面，再用濾紙吸干水分。b)取5~10g葉片在液氮中迅速研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)至滅過(guò)菌的1.5mL離心管中，加入500μL預(yù)熱過(guò)（60℃)的CTAB提取液、5μL0.2%β-巰基乙醇和5μLRNaseA(10mg/mL)，充分混勻后放入65℃水浴30min。其間每隔10min輕輕搖動(dòng)混勻2次~3次。c)取出離心管加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻10min，再于臺(tái)式冷凍離心機(jī)上10000g離心10min。d)將上清液轉(zhuǎn)入另一新的1.5mL離心管中，重復(fù)c)步驟1~2次。e)移取上清液至另一已加入2倍體積預(yù)冷（0℃以下）無(wú)水乙醇的1.5mL離心管中，輕輕顛倒混勻，使DNA沉淀成絮狀，-20℃放置30min以上。f)用鉤狀玻璃棒輕輕挑出絮狀沉淀并置于新的1.5mL離心管中。如果樣品未出現(xiàn)云霧狀沉淀或看不清沉淀，10000g離心10min，再收集沉淀。g)加入1mL~1.5mL70%無(wú)水乙醇浸泡洗滌沉淀，輕搖幾分鐘，10000g離心10min，收集沉淀，重復(fù)1次。然后將離心管水平放置在清潔場(chǎng)所晾干或在超凈工作臺(tái)上吹干。h)風(fēng)干后加入100μL滅菌的TE緩沖液溶解沉淀。7.3DNA濃度的檢測(cè)和定量用TE緩沖液配制lμg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL和10μg/mL的λ-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取3μLλ-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)溶液和3μL步驟7.2中提取的未知濃度DNA溶液，在1%瓊脂糖凝膠上電泳15min~20min，穩(wěn)壓90V，電泳緩沖液為1×TBE，325nm紫外燈下觀察，照相，檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。按照GB/T28660要求的方法，計(jì)算提取DNA溶液的濃度。7.4PCR反應(yīng)7.4.1PCR反應(yīng)體系3DB21/TXXXX—2021在4℃條件下進(jìn)行操作。15μL反應(yīng)總體系中，含有10×PCR緩沖液1.5mmol/L，Mg2+1.5mmol/L，dNTPs0.3mmol/L，正向、反向引物各0.4μmol/L，TaqDNA聚合酶0.75U，模板DNA50ng/μL。7.4.2PCR反應(yīng)程序擴(kuò)增程序首先94℃預(yù)變性5min；隨后的35個(gè)循環(huán)為：94℃變性30s，復(fù)性30s(不同SSR引物所需的退火溫度見(jiàn)附錄C)，72℃延伸30s；最后72℃延伸8min，4℃保存。7.4.3PCR產(chǎn)物的處理PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，在15μL的反應(yīng)體系中加入5μL的上樣緩沖液，充分混勻后，備用。7.5PCR產(chǎn)物檢測(cè)7.5.1非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染檢測(cè)7.5.1.1玻璃板的清洗用洗滌劑清洗玻璃板（長(zhǎng)板和短板），自來(lái)水沖洗干凈，隨后將玻璃板用蒸餾水沖洗2次，再用無(wú)屑紙巾沾取無(wú)水乙醇擦拭2遍，置于通風(fēng)櫥內(nèi)垂直晾干待用。7.5.1.2膠槽裝配a)玻璃板的固定將長(zhǎng)板玻璃板平鋪于通風(fēng)櫥內(nèi)，邊條擦拭干凈后置于長(zhǎng)板玻璃板兩側(cè)，隨后用短板玻璃板整齊地壓蓋住，確認(rèn)邊條與兩玻璃板均對(duì)齊后，將其放入封膠框中并用夾子固定在制膠板上。b)封膠配制1%的瓊脂糖凝膠，煮沸后用膠頭滴管吸取，沿底邊從左至右緩緩灌注入封膠框中，避免出現(xiàn)氣泡，待瓊脂糖凝膠完全漫過(guò)玻璃板底部，停止灌注，放置于溫室下待其凝固后再進(jìn)行下一步操作。7.5.1.3丙烯酰胺膠的配制在30mL8%聚丙烯酰胺貯備液中加入100μL10%過(guò)硫酸銨和200μL四甲基乙二胺，迅速輕輕混勻。7.5.1.4灌膠按照LY/T2756要求的方法進(jìn)行灌膠。灌膠后，將梳子輕輕插入灌膠口中，室溫凝固30min。7.5.1.5上樣和電泳待凝膠完全凝固后，將裝有凝膠的玻璃板輕輕從制膠板上取下，灌膠口向內(nèi)用夾子固定在電泳槽上，使用1×TBE緩沖溶液灌注電泳儀的上下兩槽，使下槽溶液漫過(guò)封膠框，上槽溶液漫過(guò)灌膠孔。垂直緩慢將梳子從灌膠口中拔出，并用1×TBE緩沖溶液清洗和整理樣品槽。使用200μL移液器從左至右逐個(gè)對(duì)點(diǎn)樣孔進(jìn)行吹打，直至點(diǎn)樣孔內(nèi)無(wú)碎膠、氣泡以及其他雜質(zhì)。取5μL步驟7.4.3處理后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，并在膠板的一側(cè)或適當(dāng)位置的點(diǎn)樣孔中加入4μL的DNAMarker(DL2000Marker)作為對(duì)照，電泳在200V穩(wěn)壓，電流100mA條件下進(jìn)行，電泳時(shí)間約為1.5~2h。7.5.1.6卸膠4DB21/TXXXX—2021電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，將上槽中1×TBE緩沖液放出，取下固定的夾子，去掉下部瓊脂糖，取下玻璃板。將玻璃板水平放置，用起膠鏟沿灌膠口一側(cè)邊緣將玻璃板緩慢撬起，將緊貼有凝膠的玻璃板放入裝有雙蒸水的洗膠盤(pán)中輕輕搖晃，待凝膠與玻璃板完全分離后，取出玻璃板，放凈雙蒸水。7.5.1.7銀染按照LY/T2426要求的方法，對(duì)電泳樣品進(jìn)行銀染檢測(cè)。7.5.1.8譜帶記錄參照DNAMarker電泳結(jié)果或掃描結(jié)果，根據(jù)每對(duì)SSR引物從檢測(cè)樣品中擴(kuò)增出的條帶數(shù)以及分子量大小，按“有”帶記錄為“1”、“無(wú)”帶記錄為“0”的方法，仔細(xì)記錄每對(duì)SSR引物的PCR結(jié)果。建立SSR引物、檢測(cè)樣品及有無(wú)（1/0）對(duì)應(yīng)擴(kuò)增條帶數(shù)據(jù)庫(kù)。7.5.1.9SSR標(biāo)記結(jié)果分析利用相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析軟件，根據(jù)Nei（1973）的遺傳相似系數(shù)（GeneticSimilarity,GS）按式（1）計(jì)算檢測(cè)樣品間的遺傳相似性水平。采用非加權(quán)組平均法（unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans,UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析；繪制聚類(lèi)分析結(jié)果圖，顯示SSR標(biāo)記的直觀結(jié)果?！街校篏S——遺傳相似系數(shù)，%；Ni——第i個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶數(shù)；Nj——第j個(gè)樣品的擴(kuò)增條帶數(shù)；Nij——第i個(gè)樣品和第j個(gè)樣品共有的擴(kuò)增條帶數(shù)。7.5.2毛細(xì)管電泳熒光檢測(cè)7.5.2.1樣品準(zhǔn)備對(duì)6-FAM和HEX熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物用超純水稀釋30倍（注：不同熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物他的最適稀釋度通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）。分別取等體積的上述2種稀釋液混合，從中吸取1μL加入到基因分析儀專(zhuān)用96孔板中，在各孔分別加入0.5μL的ROX-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)和8.5μL去離子甲酰胺，置于離心機(jī)中1000g下離心10s。將樣品在PCR儀上95℃變性3min后上機(jī)測(cè)序。7.5.2.2收集數(shù)據(jù)啟動(dòng)基因分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)后更換緩沖液。將裝有樣品的96孔板置于樣品架基座上，打開(kāi)數(shù)據(jù)收集軟件。將電泳板信息等錄入后，啟動(dòng)運(yùn)行程序，基因分析儀自動(dòng)收集毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)。將檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入到分析軟件GeneMapper3.2中進(jìn)行自動(dòng)分析。8分析和鑒定用多對(duì)SSR引物組合進(jìn)行檢測(cè)，將不同種源或家系待測(cè)樣品的電泳結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，據(jù)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，從而分析不同種源或家系間的遺傳組成差異。5DB21/TXXXX—2021（資料性）原理A.1原理SSR廣泛分布于蒙古櫟基因組中，不同蒙古櫟種源或家系間每個(gè)SSR位點(diǎn)重復(fù)單位的數(shù)量可能不同。針對(duì)兩側(cè)序列高度保守的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物。利用PCR技術(shù)對(duì)重復(fù)序列進(jìn)行擴(kuò)增。在電泳過(guò)程中，由于SSR位點(diǎn)重復(fù)單位的數(shù)量不同引起的不同長(zhǎng)度PCR擴(kuò)增片段在電場(chǎng)作用下得到分離，經(jīng)硝酸銀染色或者熒光染料標(biāo)記加以區(qū)分。因此，根據(jù)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，利用PCR擴(kuò)增和電泳技術(shù)，可以對(duì)蒙古櫟種源或家系間遺傳組成差異進(jìn)行分析。6DB21/TXXXX—2021（資料性）儀器設(shè)備及試劑B.1主要儀器設(shè)備PCR儀、基因分析儀、凝膠成像系統(tǒng)、水平電泳槽及配套的制膠配件、垂直電泳槽及配套的制膠配件、臺(tái)式低溫高速冷凍離心機(jī)、超微量紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)、高壓滅菌鍋、液氮罐、超低溫冰箱、高壓電泳儀、移液器、超純水系統(tǒng)、水平搖床、電子天平、制冰機(jī)。B.2試劑三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）、RNaseA、氯仿、異戊醇、β-巰基乙醇、硼酸、氫氧化鈉、濃鹽酸、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖、SSR引物、TaqDNA聚合酶、四種脫氧核苷酸（dNTPs）、10×PCR緩沖液（含Mg2+）、λ-DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)液、DNAMarker、丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED)、甲醛、硝酸銀、冰乙酸、無(wú)水乙醇、甲叉雙丙烯酰胺、ROX-500分子量?jī)?nèi)標(biāo)、離子甲酰胺、溴酚藍(lán)、二甲苯青、DNA分析用光譜校準(zhǔn)基質(zhì)（包括FAX、HEX熒光標(biāo)記DNA片段）、DNA分析儀專(zhuān)用電泳緩沖液。7DB21/TXXXX—2021（資料性）SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）標(biāo)記引物序列表C.1SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）標(biāo)記引物序列F:AGACTCTCCGGATGCTCF:GCCAATGTTGCTGAATTF:TCTTCTTCCAAACCTCGF:GTTCTGTACGAAGGCCGF:TTAGGAGGCGTGATCGTF:GACACGTCACGACCACTF:AGGGACACGTGCTCATTF:AGCACAAGCCAATGTAF:CCAGCTAAGACGCTCAA8DB21/TXXXX—2021（資料性）主要試劑的配制D.1常用貯備液D.1.10.5mol/LEDTA-二鈉（pH8.0）溶液將18.61g乙二胺四乙酸二鈉溶于80mLH2O中，加入氫氧化鈉（NaOH）調(diào)節(jié)pH至8.0，用超純水定容至100mL，高壓滅菌，4℃保存。D.1.21mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液將24.22g三羥甲基氨基甲烷溶解于160mL水中，用濃鹽酸（HCl）調(diào)節(jié)pH至8.0，用超純水定容至200mL，高壓滅菌，4℃保存。D.1.35mol/LNaCl溶液將58.44g氯化鈉（NaCl）溶于160mL水中，定容至200mL，高壓滅菌，4℃保存。D.1.4CTAB提取緩沖液緩沖液成分為2%（質(zhì)量濃度）溴代十六烷基三甲胺、100mmol/LTris-HCl（1mol/LpH8.0）、20mmol/LEDTA（0.5mol/L，pH8.0）和1.4mol/LNaCl（5mol/L）。在500mL超純水中加入20gCTAB，攪動(dòng)溶解后，加入100mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）、40mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）和280mL5mol/LNaCl，定容至1L，高壓滅菌，4℃保存。D.1.5TE（pH8.0）緩沖液取1mol/LTris-HCl（pH8.0）1mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）0.2mL，用水定容至100mL，高壓滅菌，4℃保存。D.1.610mol/LNaOH溶液稱(chēng)取80g氫氧化鈉（NaOH），先用160mL水溶解后，在加水定容至200mL，高壓滅菌，室溫保存。D.1.7EB（1mg/mL）溶液取0.05g溴化乙錠（EB）用50mL水溶解，用鋁箔或黑紙包裹容器，室溫保存，工作濃度為1mg/mL。D.1.86×DNA上樣電泳緩沖液(DNALordingBuffer)6×DNALordingBuffer，其中含0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）溴酚藍(lán)、0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）二甲苯青、30mmol/LEDTA、36%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）甘油和ddH2O。使用時(shí)按照每5μLDNA樣品加入1μLDNA上樣緩沖液的比例，混勻DNA樣品和DNA上樣緩沖液后，直接加到點(diǎn)樣孔即可。D.2瓊脂糖凝膠電泳溶液的配制稱(chēng)取1g電泳級(jí)瓊脂糖置于200mL三角瓶中，加入100mL1×TBE電泳緩沖液，在微波爐中熔化至溶液透明（確保所有瓊脂糖顆粒均完全熔化），冷卻至50℃~60℃,加入EB（1mg/mL）溶液使其終濃度為0.5μg/mL，混勻后倒入放好梳子（距