白血病融合基因檢測綜述

白血病相關(guān)融合基因的檢測及意義白血病是造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，由于造血干細(xì)胞受損，導(dǎo)致克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。白血病細(xì)胞具有自我更新增強(qiáng)、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等特點(diǎn)，患者會出現(xiàn)不同程度的貧血、出血、感染和浸潤的臨床癥狀，嚴(yán)重危害生命健康。近年來，隨著細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識到大部分的白血病中都存在著包括缺失、重復(fù)、易位等染色體畸變，導(dǎo)致原癌基因或抑癌基因結(jié)構(gòu)變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白?，F(xiàn)有報(bào)道的染色體畸變已有五十種以上，累及更多數(shù)目的融合基因，這些異常已經(jīng)逐漸成為不同類型白血病的分子生物學(xué)特異性標(biāo)志。白血病相關(guān)融合基因的種類多樣，常見的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RARα、E2A-PBX1、MLL-AF4、TEL-AML1、SIL-TAL1、DEK-CAN、CBFβ-MYH11等。BCR（breakpointclusterregion）基因是BCR-ABL融合基因的組成部分，與費(fèi)城染色體（PhiladelphiaChromosome）的形成有關(guān)，具有兩種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。正常的BCR基因編碼產(chǎn)物的功能還尚未清楚，它編碼的蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，是RAC1和CDC42的GTP酶激活蛋白。ABL1基因是編碼細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白酪氨酸激酶的原癌基因，與細(xì)胞分化、細(xì)胞分裂、細(xì)胞粘附、應(yīng)激反應(yīng)等生命活動相關(guān)?；罨腁BL1蛋白通過SH3結(jié)構(gòu)域受到負(fù)調(diào)控，SH3結(jié)構(gòu)域的缺失會導(dǎo)致ABL1基因轉(zhuǎn)化為癌基因。CDC2介導(dǎo)的磷酸化能夠調(diào)節(jié)ABL1酪氨酸激酶的DNA結(jié)合活化過程，表明ABL1可能在細(xì)胞周期中發(fā)揮作用。Nowell及Hungerford于1960年發(fā)現(xiàn)在慢性粒細(xì)胞性白血?。–ML）患者外周血中有一個(gè)比G組染色體還小的近端著絲粒染色體，由于首先在美國費(fèi)城（Philadelphia）發(fā)現(xiàn)，故命名為費(fèi)城染色體。1971年O`Riordon利用熒光顯帶法確認(rèn)費(fèi)城染色體是第22號染色體長臂缺失大段后剩余的部分。1973年Rowley發(fā)現(xiàn)缺失下來的那部分通常易位到9號染色體長臂的末端，形成t（9；22）（q34；q11）。1982年Deklein等在費(fèi)城染色體上首次發(fā)現(xiàn)了原來位于9號染色體長臂末端（9q34）的癌基因ABL1，證明費(fèi)城染色體上有來自9號染色體長臂末端的片端，是22號染色體與9號染色體相互易位的產(chǎn)物。易位使9號染色體長臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22號染色體（22q11）上的BCR基因重新組合成融合基因，因而稱為BCR-ABL融合基因。BCR-ABL融合基因編碼的融合蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，改變細(xì)胞多種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平和細(xì)胞微絲機(jī)動蛋白的功能，擾亂細(xì)胞內(nèi)正常的信號傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞失去了對周圍環(huán)境的反應(yīng)性，并抑制凋亡的發(fā)生，影響細(xì)胞周期調(diào)控，導(dǎo)致骨髓造血干細(xì)胞過度增殖。BCR-ABL融合基因在病人中常見有四種剪接體mRNA：編碼P210融合蛋白的b2a2和b3a2，編碼P190的e1a2，編碼P230的e19a2。其中b3a2和b2a2主要存在于CML，ela2主要在急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)中出現(xiàn)，而出現(xiàn)較少的e19a2根據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織（WHO）最新版的血液系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，也應(yīng)被診斷為CML。90%以上的CML患者血細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有費(fèi)城染色體的存在，主要為P210融合蛋白，因而費(fèi)城染色體和BCR-ABL融合基因可以作為區(qū)分典型CML和非典型CML的診斷指標(biāo)。同時(shí)在費(fèi)城染色體陽性的ALL患者中，65%的成人和80%的兒童能夠檢測到P190融合蛋白陽性。由于BCR-ABL融合蛋白能夠收到多種小分子化合物的抑制，臨床上第一代針對BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶小分子抑制劑（TKI）伊馬替尼就是是通過結(jié)合抑制BCR-ABL融合蛋白的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域來抑制其在細(xì)胞周期中的影響，從而發(fā)揮抗白血病作用的。第二代BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼和尼洛替尼也是在這個(gè)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，以以減少因伊馬替尼使用而帶來的抗藥性。對費(fèi)城染色體和BCR-ABL融合基因的檢測，對于正確區(qū)分CML類型，指導(dǎo)臨床治療和判斷預(yù)后情況具有重要的指導(dǎo)作用。RUNX1（Runt-relatedtranscriptionfactor1）基因也被稱為AML1（acutemyeloidleukemia1）基因或CBFA2（core-bindingfactorsubunitalpha-2）基因，RUNX1基因編碼的RUNX1蛋白是調(diào)控造血干細(xì)胞分化為成熟血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，是RUNX（Runt-relatedtranscriptionfactor）家族或CBFα（corebindingfactor-α）的成員，能夠與CBFβ蛋白形成異質(zhì)二聚體復(fù)合物，增強(qiáng)DNA結(jié)合和復(fù)合物的穩(wěn)定性。人的RUNX1基因全長260kb，在21號染色體（21q22.12）上，有兩個(gè)選擇性轉(zhuǎn)錄啟動子，能夠通過選擇性剪接形成多種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體。全長的RUNX1蛋白由12個(gè)外顯子編碼形成，在這些外顯子中，包含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別被命名為RHD（runthomologydomain）和TAD（transactivationsdomain），前者由2,、3、4號外顯子編碼形成，后者由6號外顯子編碼形成。RUNX1蛋白分別通過這些結(jié)構(gòu)域來介導(dǎo)DNA結(jié)合和蛋白間相互作用。RUNX1的轉(zhuǎn)錄過程受兩個(gè)增強(qiáng)子的調(diào)節(jié)，這些組織特異性的增強(qiáng)子能夠結(jié)合淋系或紅系調(diào)控蛋白，促進(jìn)RUNX1基因在造血系統(tǒng)中的高度活化。RUNX1在胚胎發(fā)育的造血過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在所有的造血部位都有表達(dá)，能促進(jìn)造血干細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的形成。在分子水平，RUNX1基因通過結(jié)合血小板生成素TPO（thrombopoietin）受體c-Mpl的啟動子，募集轉(zhuǎn)錄活化子或抑制子，進(jìn)而促進(jìn)造血干細(xì)胞的生成或向其他造血細(xì)胞方向分化。RUNX1還能夠通過上調(diào)Smad6的表達(dá)來促進(jìn)蛋白體降解。ETO基因又稱RUNX1T1基因，編碼的蛋白是一種鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子和癌蛋白。AML1-ETO融合基因主要見于急性髓系白血?。ˋML）患者中，t（8；21）（q22；q22）染色體易位導(dǎo)致21號染色體的原癌基因AML1基因和8號染色體的ETO基因融合，形成AML1-ETO和ETO-AML1融合基因。ETO-AML1不能通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測到，一般被認(rèn)為其表達(dá)量極低或由于降解導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定。AML1-ETO融合基因表達(dá)的蛋白全長含有752個(gè)氨基酸，其N端為RUNX1（runt-relatedtranscriptionfactor1），也稱AML1區(qū)；C端是8號染色體編碼的RUNX1T1[runt-relatedtranscriptionfactor1;translocatedto,1(cyclinD-related)]，也稱ETO。AML1-ETO融合基因主要發(fā)生在M2型AML患者中（約40%），在M2b的陽性率達(dá)90%，因而可以作為M2b分型診斷的重要分子標(biāo)志，少見于M4和M1，極少數(shù)骨髓增生異常綜合癥（myelodysplasticsyndrome,MDS）患者中也有AML1-ETO融合基因的存在。臨床上將AML1-ETO融合基因作為分子分型診斷和預(yù)后觀察的一個(gè)重要依據(jù)，AML1-ETO融合基因陽性的患者預(yù)后較好。AML1-ETO陽性的白血病細(xì)胞有一定程度的分化能力，能分化為較成熟的嗜中性粒細(xì)胞核嗜酸性粒細(xì)胞，對化療反應(yīng)較為敏感，因而AML1-ETO融合基因陽性的患者采用大劑量的阿糖胞苷治療，完全緩解率高達(dá)98%，5年存活率達(dá)到67%，預(yù)后較除M3外的其他亞型好。因而對初診患者的AML1-ETO融合基因檢測，對預(yù)后判斷和治療方案的制定具有重要意義。PML（Promyelocyticleukemia）基因編碼的PML蛋白，屬于TRIM（tripartitemotif）家族的成員，定位在核小體上，具有轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤抑制蛋白的功能。PML的表達(dá)與細(xì)胞周期有關(guān)，能夠調(diào)節(jié)p53對致癌信號的反應(yīng)。RARα（Retinoicacidreceptoralpha，維甲酸α受體）也叫NR1B1（nuclearreceptorsubfamily1，groupB，member1）基因，能編碼細(xì)胞核受體蛋白。維甲酸信號由兩種細(xì)胞核受體家族轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別是RAR（retinoicacidreceptor）和RXR(retinoidXreceptor)，兩者能夠結(jié)合形成RXR/RAR異質(zhì)二聚體。在沒有配體存在的情況下，DNA結(jié)合的RXR/RAR復(fù)合物通過募集共阻遏物NCOR1、NCOR2（SMRT）和組蛋白脫乙?；竵硪种妻D(zhuǎn)錄過程的進(jìn)行；當(dāng)配體結(jié)合到復(fù)合物時(shí)，就能夠誘導(dǎo)構(gòu)像發(fā)生改變，允許募集共活化物、組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶，使轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行下去。PML-RARα融合基因是急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cutepromyelocyticleukemia，APL）的特異性分子標(biāo)志，見于98%的APL患者中。APL患者的特異性細(xì)胞遺傳學(xué)異常t（15；17）（q22；q21），導(dǎo)致15號染色體上的早幼粒細(xì)胞白血病基因（PML）和17號染色體上的維甲成融合基因或有伙伴染色體基因的參與是白血病發(fā)生的必需條件。MLL-AF10融合基因由t(10;11)(p13;q23)易位形成，主要見于兒童AML-M5患者中，預(yù)后不良，且變異復(fù)雜易位更常見。MLL-ELL融合基因由t(11;19)(q23;p13.1)易位形成，在AML患者中的發(fā)生率較低，已有報(bào)道顯示其主要在M5a分型中出現(xiàn)，以成年人為主，預(yù)后不良，2年無病生存率50%。MLL-ENL融合基因由t(11;19)(q23;p13.3)易位形成的，可見于前B-ALL、前T-ALL、M4、M5、M1、M2多種白血病中，以嬰幼兒患者為主，發(fā)生率較低。因此對MLL重排形成的這些融合基因的檢測，對臨床的分型診斷、治療及預(yù)后判斷都具有重要價(jià)值。TEL基因又稱為ETV6基因，定位在12號染色體短臂上，能夠編碼ETS家族轉(zhuǎn)錄因子，編碼的蛋白包含兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：能夠與其他蛋白相結(jié)合的PNT結(jié)構(gòu)域和C末端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對小鼠的TEL基因進(jìn)行Knockout實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因?qū)υ煅芰脱芫W(wǎng)絡(luò)發(fā)生的維持必不可少。TEL-AML1融合基因是兒童白血病常見的融合基因，由t（12；21）（p13；q22）易位，導(dǎo)致12號染色體上的TEL基因與21號染色體上的AML1基因融合形成，見于25%的前體B細(xì)胞ALL，在兒童的普通ALL中也有較高的表達(dá)（10~20%），未見于成熟的B-ALL和T-ALL中。TEL和AML1編碼對正常造血功能具有關(guān)鍵作用的核酸轉(zhuǎn)錄因子，融合基因的形成擾亂了TEL的正常功能，并形成轉(zhuǎn)錄抑制子抑制AML1靶基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致白血病的發(fā)生。目前已報(bào)道的轉(zhuǎn)錄亞型有兩種：較多的是TEL的5號外顯子與AML1的2號外顯子結(jié)合（90%），較少的是TEL的5號外顯子與AML1的3號外顯子結(jié)合（10%）。對于TEL-AML1陽性的ALL患者的預(yù)后情況現(xiàn)在仍然存有爭議，但是有報(bào)道認(rèn)為TEL-AML1融合基因?qū)颊叩?年無病生存率相關(guān)，是預(yù)后良好的重要指標(biāo)。因而臨床中對TEL-AML1的檢測，主要用于對輔助ALL分型，監(jiān)測MRD和預(yù)后情況。目前，臨床或?qū)嶒?yàn)室用于白血病相關(guān)融合基因檢測的方法有多種，常見的包括如熒光原位雜交（FISH）、巢式RT-PCR、實(shí)時(shí)定量RT-PCR、多重RT-PCR+寡核苷酸芯片等。熒光原位雜交（FISH）技術(shù)是通過標(biāo)記熒光素的單鏈DNA（特異性探針）和與其互補(bǔ)的DNA（標(biāo)本）雜交，通過熒光信號的數(shù)量和位置反應(yīng)標(biāo)本相應(yīng)特異性基因的情況。用于白血病相關(guān)融合基因的檢測中，F(xiàn)ISH定量準(zhǔn)確、形象直觀、特異性較強(qiáng)，但是對操作要求較高，成本較高，靈敏度最高達(dá)10-2，不能滿足臨床對于白血病和MRD檢測水平的要求，應(yīng)用受到限制。實(shí)時(shí)定量RT-PCR（Real-timereversetranscriptionquantitativepolymerasechainreaction）技術(shù)檢測白血病融合基因的方法，是在實(shí)時(shí)定量PCR的基礎(chǔ)上，增加逆轉(zhuǎn)錄過程，可用來檢測融合基因的mRNA水平。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)中加入能與PCR產(chǎn)物結(jié)合的熒光探針或熒光染料，并使它們發(fā)出的熒光信號隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而成比例增長，通過熒光探測儀實(shí)時(shí)檢測每一個(gè)循環(huán)結(jié)束后的熒光強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比得出定量結(jié)果，可以直接檢測目的基因的起始數(shù)量。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)中SYBRGreen法和Taqman探針法兩種最為常用：前者采用SYBRGreen染料來監(jiān)測擴(kuò)增過程，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，游離狀態(tài)不發(fā)熒光的SYBRGreen染料非特異性結(jié)合到DNA雙鏈中產(chǎn)生熒光；后者采用Taqman探針，該探針能被Taq酶水解，探針的5’端帶有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端帶有熒光淬滅基團(tuán)，當(dāng)兩個(gè)基團(tuán)靠近的時(shí)候報(bào)告基團(tuán)不發(fā)出熒光，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，5’端的報(bào)告基因由于探針被水解而脫離下來而產(chǎn)生熒光。SYBRGreen法價(jià)格便宜，能夠和任意的模板引物搭配，但容易受到非特異性擴(kuò)增的影響；Taqman探針法更為準(zhǔn)確，但是必須設(shè)計(jì)特異性的探針與引物模板配合，價(jià)格較貴。實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)將逆轉(zhuǎn)錄過程和PCR過程結(jié)合起來，無需開蓋，一步法操作，減少污染機(jī)會；操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高；擴(kuò)增過程中閉管操作，實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)監(jiān)測，降低了污染機(jī)會，減少假陽性結(jié)果；無需電泳，大大縮短了操作時(shí)間，減少了操作的繁瑣；通過定量內(nèi)參基因來評價(jià)操作質(zhì)量，減少了假陰性結(jié)果。該方法成本也較低，適合在臨床應(yīng)用中開展。巢式RT-PCR是一種變異PCR，使用兩對PCR引物擴(kuò)增同一個(gè)片段。第一對PCR引物擴(kuò)增和普通PCR相似，第二對引物稱為巢式引物，引物它們結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增片段。巢式PCR特異性強(qiáng)，如果第一次擴(kuò)增出錯(cuò)，則第二次繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)增的概率極低，但是最后的結(jié)果需要用電泳實(shí)驗(yàn)觀察，總體流程繁瑣，無法準(zhǔn)確定量檢測白血病融合基因。多重巢式RT-PCR+寡核苷酸芯片檢測方法，是在巢式RT-PCR的基礎(chǔ)上，在兩輪PCR中都平行設(shè)置針對多組融合基因的引物，同時(shí)檢測多種融合基因的剪接體，所有基因的第二輪上游引物在合成時(shí)用熒光素在5’端進(jìn)行熒光標(biāo)記，所有分型探針再3’端進(jìn)行氨基修士。這樣經(jīng)過多重巢式PCR，一次可以擴(kuò)增出多種可能存在的融合基因，再與所有分型探針在芯片上雜交，鑒定具體的融合基因類型。該方法靈敏度較高，能夠同時(shí)檢測多種融合基因，但成本較高，操作較為復(fù)雜。2008年WHO關(guān)于白血病分型的標(biāo)準(zhǔn)中將BCR-ABL、PML-RARα、AML1-ETO融合基因等一些常見的染色體異常歸納入白血病基本診斷標(biāo)準(zhǔn)，更說明了對這些融合基因的檢測，對于白血病的診斷和治療具有重要的意義：檢測結(jié)果不僅可以為白血病診斷分型和預(yù)后判斷提供重要依據(jù)，減少人為主觀的判斷，使白血病的診斷分型更加科學(xué)化和規(guī)范化，同時(shí)也是白血病微小殘留病變（MRD）檢測的基礎(chǔ)，對白血病的臨床個(gè)性化治療的開展具有重要的推動作用。參考文獻(xiàn)JGabert,EBeillard,VHJvanderVelden,etal.Standardizationandqualitycontrolstudiesof‘real-time’quantitativereversetranscriptasepolymerasechainreactionoffusiongenetranscriptsforresidualdiseasedetectioninleukemia–AEuropeAgainstCancerProgram.Leukemia,2003,17:2318–2357.JJMvanDongen,EAMacintyre,JAGabert,etal.StandardizedRT-PCRanalysisoffusiongenetranscriptsfromchromosomeaberrationsinacuteleukemiafordetectionofminimalresidualdisease.Leukemia,1999,13:1901–1928.YoonsooHahn,TapanKumarBera,KristenGehlhaus,etal.Findingfusiongenesresultingfromchromosomerearrangementbyanalyzingtheexpressedsequencedatabases.PNAS,2004,101(36):13257–13261.李家增，王鴻利，韓忠朝.血液實(shí)驗(yàn)學(xué).上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997.JScore,MJCalasanz,OOttman,etal.Analysisofgenomicbreakpointsinp190andp210BCR–ABLindicatedistinctmechanismsofformation.Leukemia,2010,24:1742–1750.陽成波，印遇龍，黃瑞林等.實(shí)時(shí)定量RT-PCR的原理及方法.免疫學(xué)雜志，2003,19(3):S145-S150.BrianV.Balgobind,SusanaC,etal.Novelprognosticsubgroupsinchildhood11q23/MLL-rearrangedacutemyeloidleukemia:resultsofaninternationalretrospectivestudy.Blood,2009,114(12):2489-2496.LamK,ZhangDE.RUNX1andRUNX1-ETO:rolesinhematopoiesisandleukemogenesis.FrontBiosci.2012,1(17):1120–1139.EBeillard,NPallisgaard,VHJvanderVelden,etal.Evaluationofcandidatecontrolgenesfordiagnosisandresidualdiseasedetectioninleukemicpatientsusing‘real-time’quantitativereverse-transcriptasepolymerasechainreaction(RQ-PCR)–aEuropeagainstcancerprogram.Leukemia,2003,17:2474–2486.JamesW.Vardiman,JüergenThiele,DanielA.Arber,etal.The200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