哺乳動物物種鑒定方法 測序法

1哺乳動物物種鑒定方法測序法本文件描述了哺乳動物物種成分雙脫氧法(Sanger)和高通量測序鑒定方法。本方法適用于哺乳動物的毛、皮、肉、血、骨、體液等單一或混合來源的動物及動物制品物種成分定性檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，住日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法30989-2014高通量基因測序技術(shù)規(guī)程35918-2018動物制品中動物源性檢測基因條碼技術(shù)Sanger測序法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。序列相似性sequencesimilarly反映序列間相似程度的數(shù)值，是判定同源性關(guān)系的依據(jù)。序列比對scquencealigmnent將待測序列與DNA序列庫進(jìn)行比較。Sanger測序法siangersequencing雙脫氧鏈終止法，以單鏈或雙鏈DNA為模版，在DNA聚合酶的催化下延伸結(jié)合在模板上的引物，直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每個反應(yīng)含有4種dNTP,并混入用同位素或熒光標(biāo)記的ddNTP,使延長的寡聚核苷酸選擇性終止，通過高分辨率變性毛細(xì)管電泳分離片段獲得堿基順序的方法。高通量測序high-throughputgenesequencing區(qū)別于傳統(tǒng)Sanger(雙脫氧法)測序，能一次并行對大量核酸分子進(jìn)行平行序列測定的技術(shù)。4縮略語下列縮略語適用于本文件：2BLAST:基于局部比對算法的搜索工具(basiclocaDNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid);EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraNCBI:美國生物技術(shù)信息中心(Nationalcenterforbiotechnologyinformation);SDS:十二烷基硫酸鈉(sodiumd5.1DNA提取試劑5.1.4三氯甲烷與異戊醇混合液(按24:1的比例混合)。5.1.675%乙醇。5.2.3用去離子水將每條引物配制成100gmol/L儲存液，置-20℃以下凍存；使用時取適量配制成5.3.3核酸標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker:推薦使用可以判定350bp左右片段大小的DNAmarker。36.8凝膠成像分析系統(tǒng)。液體樣品，如血液、精液、組織勻漿液等應(yīng)7.1.2加入600pL裂解液(見A.1)和20μL蛋白酶K溶液(見A.2),混勻，置56C水浴1h(期間每7.1.4使用4℃,12000r/min(約13400g)離心10min,上清液轉(zhuǎn)移至另一個1.5mL離心管中，于4℃.12000r/min(約13400g)離心10min,取上清液至另一個潔凈1.5mL離心管中，加等體積三氯甲烷與異戊醇混合液，輕輕搖勻，4℃放置15min。7.1.54℃12000r/min(約13400g)離心10min沉淀DNA;棄上清，加1mL75%乙醇，輕輕混勻，于4℃12000r/min(約13400g)離心5min,棄上清，晾干；干燥后加人50pL去離子水溶解：DNA樣品置冰上備用，若需長期保存應(yīng)置于≤-20℃保存。吸取DNA提取液1yL,以去離子水作為空白對照，使用微量核酸蛋白測定儀測定DNA模板的質(zhì)DNA的質(zhì)量濃度(ng/pL)=A×50×稀釋倍數(shù)…………(1)提取的DNA質(zhì)量濃度要求大于或等于5ng/L,Am/Am的比值在1.7~1.9之間。不達(dá)標(biāo)應(yīng)重檢測過程中分別設(shè)置陽性對照、陰性對照、空白對照。用已知含哺乳動物成分的樣品作陽性對在冰上配置50μL反應(yīng)體系，見表1。一將已加樣的PCR反應(yīng)管短暫離心后放入PCR儀，擴增反應(yīng)條件設(shè)定：95℃預(yù)變性2min;95℃變性30s,55℃退火308,72℃延伸30s,40個循環(huán)；72℃5min;4℃保存。用1×TAE電泳緩沖液配制含0,1pL/mLGelRed的2%瓊脂糖凝膠。取5=L擴增產(chǎn)物點樣后進(jìn)行電泳檢測，設(shè)DNAMarker進(jìn)行同步電泳：采用120V電壓，電泳30min,用凝膠成像儀或紫外透射2018進(jìn)行。7.7.3針對混合物種樣品使用高通量測序技術(shù)對擴增產(chǎn)物序列遺傳信息進(jìn)行同時采集。具體試驗參Sanger測序和高通量測序采集的序列信息，使用BLAST程序與NCBI數(shù)據(jù)庫中的物種序列信息0.5mol/L.EDTA(資料性)Sanger測序結(jié)果序列分析比對步驟Sanger測序數(shù)據(jù)直接與NCBI的序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，具體操作如下。a)首先打開https://blast,/Blast.cgi網(wǎng)頁，選擇紅框中的NucleotideBLAST。blastxNucleotideBLASTb)