食品毒理學 外源化學物的致癌作用學習課件

PAGEPAGE12第九章外源化學物的致癌作用腫瘤毒理學的一部分。腫瘤在死因排位中穩(wěn)居前三位已逾40年,與此同時,死亡人數(shù)逐年攀升。（2007年出版）腫瘤尤其是惡性腫瘤是危害健康和生命的常見病之一，調(diào)查研究的結果顯示，在死因排位上，惡性腫瘤死亡占城市居民死亡原因之首，在農(nóng)村居民中位居第三。在死亡者的比例上每５個死亡者中有１個死于惡性腫瘤。2012年，全國腫瘤登記中心收到全國104個腫瘤登記處2009年腫瘤登記數(shù)據(jù)。通過對上報數(shù)據(jù)的綜合審核，有72個登記處的數(shù)據(jù)入選，以反映2009年我國腫瘤登記覆蓋地區(qū)惡性腫瘤的發(fā)病與死亡水平。入選資料覆蓋人口達8547萬，包括了31個城市地區(qū)（5749萬人）和41個農(nóng)村地區(qū)（2789萬人），登記結果令人震驚。全國登記地區(qū)發(fā)病率（粗率）285.91/10萬，中國人口標化率為146.87/10萬，累計率（0～74歲）為22.08%。全國登記地區(qū)惡性腫瘤死亡率（粗率）為180.54/10萬，中國人口標化率為85.06/10萬，累計率（0～74歲）為我國居民因癌死亡的幾率為12.94%。這讓也就意味著，約每5個人中就可能有一個人會罹患癌癥，約每8個人中就可能有一個人會死于癌癥！惡性腫瘤發(fā)病惡性腫瘤發(fā)病前十位主要是肺癌、消化系統(tǒng)癌（胃癌、結直腸癌、肝癌、食管癌、胰腺癌）、乳腺癌、淋巴瘤、膀胱癌、甲狀腺癌。這十類腫瘤占全部惡性腫瘤發(fā)病的76.39%。第一節(jié)化學致癌物質(zhì)一、人類化學致癌物附錄：IARC關于化學物質(zhì)致人類癌癥危險性分類只與一種化學物致癌性證據(jù)的充分性(證據(jù)權重)有關，而并不涉及其致癌活性大小及其機制。IARC將化學物對人類致癌性資料(流行病學調(diào)查和病例報告)和對實驗動物致癌性資料分為四級：致癌性證據(jù)充分、致癌性證據(jù)有限、致癌性證據(jù)不足及證據(jù)提示缺乏致癌性。對人致癌性證據(jù)充分是指在致癌物和人癌癥發(fā)生之間有因果關系。致癌性證據(jù)有限是指因果關系的解釋是可信的，但其他的解釋如偶然性、偏倚、混雜因素不能完全排除。致癌性證據(jù)不足是指資料的性質(zhì)、一致性或統(tǒng)計學把握度不足以判斷因果關系或沒有對人致癌性的資料。證據(jù)提示缺乏致癌性是指有幾個在已知人類充分暴露水平范圍內(nèi)的研究表明暴露水平與所研究的癌癥無關聯(lián)。分類為人致癌物(組1)必須要有流行病學證據(jù)的支持。流行病學研究(隊列研究和病例對照研究)試圖為化學品接觸與人群癌癥發(fā)生(或死亡)增加的因果關系提供證據(jù)。癌癥流行病學研究是比較困難的，一般是在人群接觸某種化學品多年之后進行，可能有很多混雜因素，并往往受到經(jīng)費和時間的限制。為治療目的給以化學品(藥品)和職業(yè)性接觸，較易控制接觸條件，但個體數(shù)和接觸期限也往往受到限制。因此，對于很多化學品需要由動物致癌試驗、短期試驗等為接觸此化學品的致癌危險性提供論據(jù)(主要用于危害鑒定)。化學致癌物為凡能引起動物和人類腫瘤、增加其發(fā)病率或死亡率的化合物，比如黃曲霉毒素、3,4一苯并（a）芘及苯等?；瘜W致癌作用是化學致癌物在人體內(nèi)引起腫瘤的過程。到20世紀90年代中期為止，國際癌癥研究中心（IARC)2002年共評述了878種化學物質(zhì)。根據(jù)證據(jù)的強度將已評述的化學物質(zhì)分為四組：(1)Ⅰ組對人類確是致癌物，是指在人類流行病學及動物致癌實驗中均有充分證據(jù)的致癌物，有87種；(2)II組對人類是很可能或可能是致癌物。又分為兩組，II組2A和II組2B。①Ⅱ組2A：對人類很可能是致癌物，是指對人類致癌性證據(jù)有限，對試驗動物致癌性證據(jù)充足，有63種；②Ⅱ組2B：對人類是可能致癌物，是指對人類致癌性證據(jù)有限，對試驗動物致癌性證據(jù)并不充分，或是指對人類致癌性證據(jù)不足，對試驗動物致癌性證據(jù)充分，有234種；(3)Ⅲ組可疑致癌物，現(xiàn)有的證據(jù)不能對人類致癌性進行分類，有493種；(4)Ⅳ組非致癌物，對人類可能是無致癌作用，有1種。IARC已確定的人類致癌物或生產(chǎn)方式及其靶器官見表9一1。根據(jù)化學致癌物對細胞成分作用及引起癌癥發(fā)生的機制不同可分為遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性致癌物。(1)遺傳毒性致癌物化學致癌物或其代謝物與DNA共價結合，引起基因突變或染色體結構和數(shù)量的改變導致癌變，稱為遺傳毒性致癌物。這類致癌物占化學致癌物的大多數(shù)，因其作用機制是損傷遺傳物質(zhì)，可利用遺傳毒理學試驗來檢測該類致癌物。①直接致癌物：本身直接具有致癌作用，在體內(nèi)不需要經(jīng)過代謝活化即可致癌。例如，各種烷化劑，大多數(shù)為親電子反應物。這類物質(zhì)絕大多數(shù)是合成的有機物。包括有內(nèi)酯類如β-丙烯內(nèi)酯等；烯化環(huán)氧化物如1，2，3，4-丁二烯環(huán)氧化物；亞胺類；硫酸酯類；芥子氣和氮芥；活性鹵代烴類等等。

②間接致癌物：本身并不直接致癌，必須在體內(nèi)經(jīng)代謝活化，其所形成的代謝產(chǎn)物才具致癌作用。例如，多環(huán)芳烴、芳香胺類化合物等。前致癌物分為天然和人工合成兩大類。人工合成的主要有：多環(huán)或雜環(huán)芳烴類如苯并（a）芘、3-甲基膽蒽等；單環(huán)芳香胺類如鄰甲苯胺等；雙環(huán)或多環(huán)芳香胺類如聯(lián)苯胺等；喹啉類；硝基呋喃類；硝基雜環(huán)類；烷基肼類等等。天然物質(zhì)主要有黃曲霉毒素、環(huán)孢素A、煙草和煙氣、檳榔及酒精性飲料。

③無機致癌物：有些可能是親電子劑，但有些是通過選擇性改變DNA復制保真性，導致DNA的改變，如金屬鎳、鉻。鈾、鐳、氡等可能由于其放射性致癌。鎳、鉻、鈦、錳等金屬及其鹽類可在一定條件下致癌。

在無機致癌物中，有些能損傷DNA，但有些可能通過改變DNA聚合酶而致癌。(2）非遺傳毒性致癌物化學致癌物或其代謝物不直接作用遺傳物質(zhì)，而作用于遺傳物質(zhì)以外的生物大分子，稱為非遺傳毒性致癌物。①促長劑：本身無致癌性，在給以遺傳毒性致癌物之后再給以促長劑可增強遺傳毒性致癌物的致癌作用，也可促進“自發(fā)性”轉(zhuǎn)化細胞發(fā)展成癌。例如，佛波脂（TPA及其衍生物）、苯巴比妥、二丁基羥基甲苯（BHT）、1,8,9一蒽三醇、DDT，ALkanes及膽鹽等。如TPA是小鼠皮膚癌誘發(fā)試驗的促癌劑；苯巴比妥對大鼠肝癌有促癌作用；色氨酸和糖精對膀胱癌有促癌作用；丁基羥甲苯、DDT、多鹵聯(lián)苯、氯丹、七氯和四氯二苯并對二惡英（TCDD）等。②內(nèi)分泌調(diào)控劑：主要改變內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡及細胞正常分化，常起促長劑作用。例如乙烯雌酚、雌二醇、硫脲等。如孕婦使用雌性激素（已烯雌酚）保胎可能使其女兒在青春期發(fā)生陰道透明細胞癌。有些物質(zhì)不是激素，但干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)而致癌，如3-氨基三唑誘發(fā)大鼠甲狀腺腫瘤與干擾甲狀腺素合成有關。③免疫抑制劑：主要對病毒誘導的惡性轉(zhuǎn)化起增強作用。例如，嘌呤同型物。如硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤等免疫抑制劑或免疫血清均能使動物和人發(fā)生白血病或淋巴瘤，但很少發(fā)生實體腫瘤。④細胞毒劑：可能引起細胞死亡，導致細胞增殖活躍及癌發(fā)展。例如，次氮基三乙酸及氯仿等。次氮基三乙酸使鋅進入腎臟，由于鋅的毒性，造成細胞死亡，結果引起增生和腎腫瘤。⑤過氧化物酶體增殖劑：過氧化物酶體增殖可導致細胞內(nèi)氧自由基過量生成。例如，祛脂乙酯、鄰苯二甲酸乙基己酯。能使嚙齒動物肝臟中的過氧化物酶體增生的各種物質(zhì)都可誘發(fā)肝腫瘤。如降血脂藥安妥明、降脂異丙酯、增塑劑二-苯二甲酸酯和有機溶劑1，1，2-三氯乙烯。

⑥固體物質(zhì)：物理狀態(tài)是關鍵性因素，可能涉及細胞毒性。例如，塑料、石棉等。動物皮下包埋塑料后，經(jīng)過較長的潛伏期，可導致肉瘤形成。石棉在人和動物的胸膜表面可引起胸膜間皮瘤。石棉和其他礦物粉塵，如鈾礦或赤鐵礦粉塵，可增強吸煙致肺癌的作用。二、化學致癌物的代謝活化與滅活致癌物通過不同途徑進入人體后，有些可直接與靶分子起作用，有些需經(jīng)過Ⅰ、Ⅱ相代謝，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物才有致癌活性（代謝活化）。各種有活性的致癌物再經(jīng)歷不同的代謝過程成為致癌性減弱、極性增高的產(chǎn)物排出體外（代謝滅活）。不同致癌物的代謝活化與代謝滅活的過程不一，但都受一系列I、II相酶所催化，代謝酶活性強弱直接左右代謝過程的強弱程度，最終影響到達靶子的有效劑量，此劑量被稱為生物有效劑量，它是體內(nèi)劑量中與致癌物作用強弱關系最為直接的劑量。不同組織中不同類型代謝酶的分布有明顯差異，這種分布的特點直接影響致癌物作用靶子的特異性。三、化學致癌物作用的靶子化學致癌物本身或它的活性代謝產(chǎn)物在體內(nèi)誘發(fā)腫瘤必先作用于有關靶子。就目前所知的這類靶子可分為兩大類：DNA靶子與非DNA靶子。(1)DNA靶子由于各種與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的基因都排列在DNA鏈上，各種類型的致癌物都可與DNA作用，產(chǎn)生堿基損傷、鏈斷裂、鏈交聯(lián)等不同形式的損傷。這在多種體內(nèi)、體外模型的觀察中都得到了充分的證實。但問題是這些損傷與腫瘤的發(fā)生是否有關？就目前所得觀察結果來看，回答是肯定的。人體內(nèi)細胞數(shù)共約為1014個，每個細胞內(nèi)的DNA每日可能出現(xiàn)的損傷數(shù)可達4000個之多。嚴重損傷可致細胞死亡，未致死亡的損傷可經(jīng)歷修復過程，少部分可能出現(xiàn)突變。突變的結局是多方面的，其中部分可發(fā)展成惡性轉(zhuǎn)化。因此，權衡DNA損傷與致癌關系時，這些因素需加以充分考慮。一般認為致癌物誘導生成DNA加合物的數(shù)量與致癌性有密切關系。DNA上的前癌基因很可能是化學致癌物的靶子。抑癌基因同樣可能是致癌物的主要靶子。以p53為例，突變主要在第5～8外顯子的保守區(qū)域，G一C堿基對出現(xiàn)轉(zhuǎn)換引起錯義突變。這類突變主要見于多種人類腫瘤，亦見于實驗用嚙齒類動物的同類腫瘤。(2）非DNA靶子主要有兩類：一是作用于紡錘絲系統(tǒng)，另一個是作用于與DNA修復或基因表達調(diào)控有關的酶系統(tǒng)。作用于紡錘絲的化學物質(zhì)本身不直接作用于遺傳物質(zhì)，傳統(tǒng)上認為它不是誘變劑，但實際上具有誘變作用。第二節(jié)化學致癌過程動物或人的正常細胞如何在化學致癌物的作用下，逐步轉(zhuǎn)化成惡性癌細胞？在體內(nèi)如何逐步發(fā)展成可見腫瘤，并轉(zhuǎn)移到機體其它部分組織？有哪些因素參與？通過哪些機制獲得不同階段的發(fā)展？這過程一旦開始是否有可能加以阻止或使之逆轉(zhuǎn)？癌變早期可能出現(xiàn)哪些可以加以識別和利用的特異性標記？這些都是需要解決的問題。一、化學致癌作用——一個多因素、多基因參與的多階段過程腫瘤的形成與發(fā)展需要有原癌基因的激活與腫瘤抑制癌基因的滅活，二者同時存在。一些細胞生長因子、生長信號傳遞系統(tǒng)等一系列與生命重要功能有密切關系的基因出現(xiàn)突變，才使腫瘤細胞得以形成和發(fā)展。近年對于多基因、多因素參與人類致癌過程問題，大致有以下幾個方面認識：（1）致癌過程有多個與癌腫有關的基因參與。就目前所知有關的基因可分為四類：第一類是前癌基因，包括生長與增殖基因、各種轉(zhuǎn)錄因子或信號傳遞功能的基因；第二類是腫瘤抑制基因；第三類是程序性死亡有關的基因；第四類是新近發(fā)現(xiàn)的如腫瘤易感基因，見于乳腺癌患者家屬。這幾類基因是相互作用的。增加細胞的生長與增殖固然可能是腫瘤形成的途徑，減少細胞死亡亦可造成細胞的過度擴增。在50多種前癌基因中，研究得最深入的是ras基因族。它在多種人類腫瘤或化學致癌物誘導的動物腫瘤均見出現(xiàn)活化。主要活化型或是在第12、13、16、117與146密碼出現(xiàn)點突變。（2）不同器官來源、不同組織類型、臨床階段以至同一種腫瘤在不同地區(qū)所見的遺傳變化是不同的。例如K-ras突變常見于胰腺癌、結腸癌，但是乳腺癌及肝癌則少見。胃的腸型腺癌見c一erbB一2擴增，但在硬化型則見不到這種變化。K-ras癌基因（編碼酪氨酸激酶受體）在硬化型胃腺癌、圖章戒指型胃癌出現(xiàn)擴增，而在腸型腺癌則不見有。在50%食管癌與15%乳腺癌見HSTI與INT2基因擴增。在胃癌從未見有。同屬肝癌在AFB1高度污染區(qū)與低度污染區(qū)所見p53基因突變類型不一。（3)多種環(huán)境致癌物、致癌因子或條件可協(xié)同作用。人類接觸致癌物、致癌因子或條件都不可能是單一的。例如，接受環(huán)境致癌物的同時會接受到內(nèi)源性致癌因素的作用。又如體內(nèi)氧化過程產(chǎn)生的各種活性氧可導致DNA損傷并引起突變。這些遺傳改變亦可能參與致癌過程。感染亦在某些腫瘤發(fā)展中起著重要作用。以肝炎C型病毒（HCV）感染為例，它一方面使肝細胞死亡，繼而使之出現(xiàn)代償性再生。肝細胞通過多次細胞分裂，可使已有遺傳改變逐漸積累擴大，同時形成局部老化。正常成人肝細胞很少分裂，可能最多是一年一次。若HCV感染后出現(xiàn)30次分裂，這就意味著比正常人老化速度快30倍。(4）個體的不同遺傳背景對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要影響。高癌家族現(xiàn)象已為人所熟知。近年對于著色性干皮?。╔P）、家族性多發(fā)性腸道息肉、Wilm瘤以及視網(wǎng)膜母細胞瘤的遺傳學及有關基因已基本弄清楚。DNA正確修復能力與突變發(fā)生有直接關系，而DNA修復能力缺陷者往往對腫瘤有易感傾向。因此，多種DNA修復缺陷與腫瘤敏感性關系已越來越受到重視。二、細胞增殖與致癌作用細胞增殖（CP）可通過多種途徑影響致癌過程。從啟動、促癌、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移各個過程，往往都有CP參與。啟動過程導致啟動細胞的出現(xiàn)。正常細胞DNA受損經(jīng)錯誤修復出現(xiàn)突變需要通過固定過程才能形成啟動細胞。細胞必須經(jīng)過DNA合成、細胞分裂才可能出現(xiàn)各種形式基因突變、染色體畸變或基因擴增，可見細胞增殖是一個影響致癌過程的重要因素。若細胞暫時停止進入細胞分裂周期，細胞DNA就會有較充分的時間進行修復，突變就可能不出現(xiàn)。即使有啟動細胞出現(xiàn)，沒有CP，啟動細胞的數(shù)目亦不會增加。腫瘤也可看作是一種機會性疾病。受損細胞的數(shù)目越多，得到下次遺傳性損害的機會亦越大，發(fā)展成可見腫瘤的機會亦越大。促癌階段中CP的作用更為明顯。三、細胞程序性死亡與致癌過程致癌過程與細胞的生與死都有密切關系。大量無控制的細胞增殖固然是致癌過程不可缺少的條件，而細胞死亡調(diào)控的失調(diào)亦是導致腫瘤形成的一個重要（甚至可以說是必要）的條件。因此有學者提出：細胞惡性轉(zhuǎn)化是由于細胞增殖與細胞死亡調(diào)控功能失調(diào)所致。細胞死亡與細胞增殖過程一樣，涉及到一個相當復雜的調(diào)控過程。細胞程序性死亡（PCD）的觸發(fā)是一個系列基因（有人認為至少有14個基因參與）表達的結果，它廣泛存在于正常組織的不同形態(tài)發(fā)生、生長與發(fā)育階段。PCD所誘發(fā)的細胞與壞死性細胞死亡在形態(tài)上、生長改變上都有明顯差別，可見這是一種特殊的主動形式，因此稱為凋亡，如同秋天落葉，生死規(guī)律的交替，使生命得以正常的延續(xù)。機體對于致癌物所引起的DNA損傷除了動員修復機制進行修復以外，亦會啟動自身清除機制，例如PCD清除突變或癌變細胞。在外源性或內(nèi)源性因素作用下，體內(nèi)細胞的突變頻率應當是相當高的（相當于每個基因和細胞10-9～10-5次，再乘以每日細胞分裂數(shù)，約為109細胞/d），若無適當?shù)那宄龣C制，突變頻率將十分高，據(jù)此推算腫瘤發(fā)生率應比現(xiàn)在高得多，但事實并非如此。PCD可能是清除這類突變細胞或癌變細胞的途徑之一。啟動細胞要發(fā)展成可見腫瘤必須改變自身對于PCD的反應，以便能逃脫這種清除。任何一種機制若能使經(jīng)致癌物損傷的細胞更多地存活下來，都有會增加致癌的危險性，因為這種存活意味著有更多的機會積累必要的多次遺傳損傷，使之獲得腫瘤表型。四、DNA修復與致癌過程外源性或內(nèi)源性因素對于人體內(nèi)DNA損傷的方式是多種多樣的?？沙霈F(xiàn)單個或多個堿基損傷，亦可出現(xiàn)鏈斷裂或鏈交聯(lián)。機體對此相應發(fā)展了多種形式的修復方式。目的是將受損部分去掉，再補上被除去部分的空缺。這部分成分若是完整無缺的或功能上是完全相同的，就是正確修復，機體內(nèi)這部分DNA完全回復原有的結構或功能。但在一定條件下，經(jīng)修補的部分結構或功能上可能是有缺陷的。這就出現(xiàn)易錯修復。通過錯誤修復，細胞盡管仍然能夠生存并保持了部分功能，但代價是出現(xiàn)突變。從這一角度來看，有些修復過程，它本身也是一個誘變過程，修復與突變的關系是密不可分的，甚至可以說：沒有修復就沒有突變?；瘜W突變不是通過損傷－突變這樣一種模式，而是損傷－修復－突變模式形成的。DNA損傷的后果是什么？在很大程度上是受機體對DNA損傷方式與修復能力所左右。受到致癌物的作用后是否會出現(xiàn)癌基因活化，抑癌基因失活等一系列致癌過程，在一定程度上亦受制于DNA修復。五、某些非遺傳機制與致癌過程傳統(tǒng)上將致癌過程中致癌因素對于DNA所引起的一系列啟動作用列為遺傳機制，而對于DNA以外靶子所起的作用稱為非遺傳或非遺傳毒性機制。這類機制，涉及的因素很多，目前研究得比較充分的主要有：細胞間隙連接通訊（GJIC)；信號傳導系統(tǒng)，其中特別是蛋白激酶C(PKC）作用；激素作用等方面的因素。它們在不同方面不同程度上參與了多階段的致癌過程。對于某些致癌因素來說，這些非遺傳機制對于它們所誘導的致癌過程起著關鍵的作用，是不容忽視的方面。附錄：對化學致癌作用的機制研究已有多年的歷史，并形成了一些學派，主要有遺傳機制學派(genetictheory)和遺傳外機制學派(epigenetictheory)。遺傳機制學派認為，外來致癌因素引起細胞基因的改變或外來基因整合到細胞基因中，從而導致癌變。遺傳外機制學派認為癌癥的發(fā)生是由于非基因改變機制引起的。隨著分子生物學、生物化學及遺傳學等基礎學科的迅速發(fā)展，目前對致癌作用機制的認識逐步深入，鑒于致癌物的多樣性和致癌過程的復雜性，遺傳機制和遺傳外機制可能是相輔相成的，在致癌作用的不同階段中起作用?；瘜W致癌機制重要的學說有親電子劑學說、體細胞突變學說、癌基因?qū)W說和癌變的階段學說。目前認為，正常細胞經(jīng)過遺傳學改變的積累，才能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎?，癌癥的發(fā)生是多階段過程，至少包括引發(fā)、促長和進展階段。癌變的階段學說是在上世紀40年代，Rous、Mottram和Bemblum等分別研究利用致癌性多環(huán)芳烴和巴豆油誘發(fā)小鼠皮膚乳頭瘤，提出化學致癌的兩階段學說，即引發(fā)(啟動，initiation)和促長(promotion)兩個階段。其實驗證據(jù)是用亞致癌劑量(即在實驗期間不引起腫瘤發(fā)生的劑量)的致癌性多環(huán)芳烴涂抹小鼠皮膚一次，20周后不發(fā)生乳頭瘤或很少發(fā)生。但如在使用劑量相同的致癌物之后再用巴豆油涂抹同一部位(每周2次，共20周)則有約1／3～1／2的小鼠發(fā)生乳頭瘤。單獨使用巴豆油或在涂抹致癌物之前使用巴豆油都不引起乳頭瘤。據(jù)此提出化學致癌的引發(fā)和促長兩階段學說，將所用的致癌性多環(huán)芳烴稱為引發(fā)劑(initiator)，巴豆油稱為促長劑(promotor)，巴豆油中具有促長作用的有效成分經(jīng)鑒定為佛波醇酯(TPA)。癌變的階段學說在肝、膀胱、肺、胃腸道等癌癥發(fā)生和體外細胞轉(zhuǎn)化試驗中得到證實。進一步的研究證明，癌變過程是多階段過程，從良性腫瘤向惡性轉(zhuǎn)變的過程稱為進展(progression)階段。化學致癌過程的主要階段見圖9-2，在引發(fā)和進展階段有細胞基因組(DNA)的結構改變。在促長階段雖不涉及細胞基因組的結構改變，但依賴于基因的表達改變。前致癌物正常細胞DNA結合活化修復引發(fā)的細胞DNA結合終致癌物致癌物-DNA促長加合物分化的腫瘤DNA復制進展錯配修復失敗DNA修復不分化的癌轉(zhuǎn)移細胞死亡細胞含錯配堿基圖9-2化學致癌過程的主要階段一、引發(fā)階段引發(fā)階段是指化學物或其活性代謝物(親電子劑)與DNA作用，導致體細胞突變成引發(fā)細胞的階段。在引發(fā)過程中至少有三個細胞功能是重要的，即致癌物的代謝，DNA修復和細胞增殖。Miller等(1971)提出親電子劑學說，認為大多數(shù)有機致癌物都是間接致癌物，又稱前致癌物，或先形成近致癌物再進一步活化成終致癌物。終致癌物是親電子劑，含有親電子中心，可與細胞大分子的親核中心共價結合，進而導致癌癥。本身就有反應活性，不需要代謝活化的致癌物或能自發(fā)形成親電子劑的致癌物稱為直接致癌物。毒物代謝酶類對于間接致癌物具有代謝活化和代謝解毒雙重功能，間接致癌物的致癌性取決于代謝活化和代謝解毒之間的平衡。終致癌物引起DNA損傷可誘導DNA修復，DNA修復可能是無誤的，也可能將錯誤的堿基引入基因組，而細胞增殖對于產(chǎn)生基因組可遺傳的改變是必需的。引發(fā)階段歷時很短，引發(fā)作為一個突變事件，需要一次或多次細胞分裂來“固定”引發(fā)事件，引發(fā)所確定的基因型和／或表型是不可逆的。引發(fā)細胞在形態(tài)上與正常細胞很難區(qū)別。引發(fā)是不可逆的，但并非所有的引發(fā)細胞都將構成腫瘤，因其中大多數(shù)將經(jīng)歷程序性細胞死亡(凋亡)。引發(fā)細胞不具有生長自主性，因此不是腫瘤細胞。引發(fā)劑本身有致癌性，大多數(shù)是致突變物，沒有可檢測的閾劑量，引發(fā)作用是不可逆的并且是累積性的。引發(fā)劑作用的靶主要是原癌基因和腫瘤抑制基因。引發(fā)階段的個體變異、物種差異及親器官特征是取決于細胞對致癌物的代謝、DNA修復及細胞增殖／凋亡的平衡。二、促長階段促長階段是引發(fā)細胞增殖成為癌前病變或良性腫瘤的過程。促長劑單獨使用不具致癌性，必須在引發(fā)劑后使用才發(fā)揮促長作用，促長劑通常是非致突變物，存在閾劑量和最大效應，其劑量反應關系呈S形曲線。促長劑通常影響引發(fā)細胞的增殖，導致局部增殖并引起良性局灶性病理損害如乳頭瘤、結節(jié)或息肉。這些病損很多會消退，僅少數(shù)細胞發(fā)生進一步突變引成惡性腫瘤。促長劑可能經(jīng)特異的受體中介干擾細胞信號轉(zhuǎn)導途徑、改變基因表達；促長劑可能在細胞和分子水平上通過改變細胞周期控制，選擇性促進引發(fā)細胞的增殖；促長劑還可能抑制程序性細胞死亡(凋亡)。促長階段歷時較長，早期有可逆性，晚期為不可逆的，因此在促長階段(特別是在早期)持續(xù)給以促長劑是必需的。促長階段的另一個特點是對生理因素調(diào)節(jié)的敏感性，衰老、飲食和激素可影響促長作用。證實引發(fā)和促長作用的實驗方案如圖9-3A，實驗期限一般為3-6個月，終點一般是癌前損害(PNL)，如小鼠皮膚乳頭瘤、大鼠和小鼠肝轉(zhuǎn)化灶、大鼠乳腺末端芽狀增生、大腸和結腸的變性隱窩等。三、進展階段進展階段是從引發(fā)細胞群(癌前病變、良性腫瘤)轉(zhuǎn)變成惡性腫瘤的過程，在進展期腫瘤獲得生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。在進展期中可觀察到惡性腫瘤(癌)的多種特征，包括生長率增加、侵襲、轉(zhuǎn)移、對激素無反應性、形態(tài)特征隨疾病的發(fā)展獨立地變異等。這些特征是由于在進展階段的核型不穩(wěn)定性。環(huán)境因素在早期可影響進展階段，但隨惡性腫瘤的生長和核型不穩(wěn)定性的發(fā)展，對環(huán)境因素的反應可能喪失。作用于促長階段的細胞轉(zhuǎn)變成進展期的化學物稱為進展劑(progressor)，進展劑可引起染色體畸變，但不一定具有引發(fā)活性。進展劑導致核型不穩(wěn)定性的機制很多，包括有絲分裂裝置的紊亂、端粒功能改變、DNA低甲基化、重組、基因易位和基因擴增等。進展階段主要的特征是核型不穩(wěn)定性，腫瘤的染色體發(fā)生斷裂和斷片易位，存在多復本或部分／整個缺失。染色體結構改變伴有細胞癌基因和／或腫瘤抑制基因的突變，這些突變可能反映了適于惡性生長的細胞選擇并也可能反過來增加了核型不穩(wěn)定性。這些突變可能來自于癌基因／腫瘤抑制基因的功能改變或由于化學致癌物暴露。表9-3多階段致癌的形態(tài)學和生物學特征引發(fā)促長進展1.不可逆性1.在基因表達和細胞水平上有可逆性1.不可逆性2.經(jīng)引發(fā)的“干細胞”在形態(tài)學上不能鑒定2.持續(xù)給以促長劑才可維持促長細胞群2.核型不穩(wěn)定性導致細胞基因組結構的形態(tài)學改變；3.對外源化學物及其他化學因子敏感；3.對衰老、飲食和激素因子敏感3.在進展階段早期，已改變的細胞對環(huán)境因子敏感；4.引發(fā)細胞可能自發(fā)(內(nèi)源性)發(fā)生；4.內(nèi)源性促長劑可起“自發(fā)性”促長作用；4.在進展階段觀察到良性或惡性能腫瘤5.需經(jīng)細胞分裂“固定”；5.劑量—反應關系顯示有閾值和最大作用；5.進展劑使已促長的細胞進入此期。6.劑量—反應關系沒有易于確定的閾值；6.以能否有效地擴大引發(fā)細胞群來確定促長劑的相對強度。7.經(jīng)規(guī)定的促長階段后，定量癌前病變來確定引發(fā)劑的相對強度。證實進展作用的實驗方案比較復雜(圖9-3B)，是在引發(fā)和促長階段之后再給以進展劑，然后再繼續(xù)給以促長劑，實驗應有適當?shù)膶φ?，終點為惡性損害(NL)。引發(fā)、促長和進展階段的形態(tài)學和生物學特征見表9-3。兼有引發(fā)劑、促長劑和進展劑作用的化學致癌物可稱為完全致癌物(completecarcinogen)。綜上所述，化學致癌是長期的、復雜的多階段過程，至少涉及引發(fā)、促長和進展三個階段。在引發(fā)和進展階段涉及遺傳機制，在促長階段主要是遺傳外機制。在引發(fā)階段主要是細胞原癌基因和腫瘤抑制基因的突變，在進展階段主要是核型不穩(wěn)定性。正常細胞經(jīng)過遺傳學改變的積累才能轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎?。第三?jié)化學毒物致癌性的判別目前所使用的系統(tǒng)大致可分為三大類：短期試驗、動物誘癌試驗和人類流行病學觀察。它們在判別化學物質(zhì)致癌性方面各有其長短處，往往需要互為補充才能作出可靠的結論。哺乳動物致癌試驗哺乳動物致癌試驗是鑒定化學致癌物的標準體內(nèi)試驗。哺乳動物致癌試驗用來確定受試物對試驗動物的致癌性、劑量—反應關系及誘發(fā)腫瘤的靶器官。在下列情況下，一般應考慮進行致癌性評價：①人體可能長期暴露于該化學物；②該化學物或其代謝物的化學結構與已知致癌物相似；③反復染毒毒性試驗提示該化學物可能產(chǎn)生癌前病變。此外，研究結果表明，如在3種遺傳毒理學短期試驗均得到陽性結果，可預測為遺傳毒性致癌物；如在3種遺傳毒理學短期試驗均得到陰性結果，可預測為非遺傳毒性非致癌物；如經(jīng)5種遺傳毒理學短期試驗仍不能預測其致癌性的化學品，應優(yōu)先進行哺乳動物致癌試驗。一、試驗動物物種和品系：要求用兩種實驗動物，常規(guī)選用大鼠和小鼠，也可用倉鼠。嚙齒類動物對多數(shù)致癌物易感性較高，壽命相對較短，費用也較低，生理和病理資料較完備，因此使用最廣泛。在選擇品系時應選擇較敏感、自發(fā)腫瘤率低、生活力強及壽命較長的品系。性別：為接近人類情況，應使用同等數(shù)量的雌雄兩種性別的動物。年齡：使用剛離乳的動物，以保證有足夠長的染毒和發(fā)生癌癥的時間，而且幼年動物解毒酶及免疫系統(tǒng)尚未完善，對致癌作用比較敏感。二、劑量選擇和動物數(shù)量致癌試驗一般設三個試驗組。美國NCI推薦以最大耐受劑量(MTD)為高劑量。最大耐受劑量是由90天毒性試驗來確定的，此劑量應使動物體重減輕不超過對照組的10％，并且不引起死亡及導致縮短壽命的中毒癥狀或病理損傷（最大可行劑量，受試物在飼料中最高含量為5％。限制劑量為1500mg／(kg體重·d)）。中及低劑量組則按等比級數(shù)下推，如分別為上一個劑量水平的1／2或1／3。低劑量組應不影響動物的正常生長、發(fā)育和壽命，即不產(chǎn)生任何毒性效應。但低劑量組應高于人的接觸劑量，一般不低于高劑量的10％。中劑量組介于高、低劑量之間，如有可能按受試物的毒物動力學性質(zhì)來確定。對照組除不給受試物外，其他條件均與試驗組相同。同時應設陰性(溶劑或賦形劑)對照組。必要時可設陽性對照組，陽性致癌物最好與受試物的化學結構相近。試驗動物數(shù)與試驗組動物腫瘤發(fā)生率、對照動物腫瘤自發(fā)率及要求的統(tǒng)計學顯著性水平有關。三、染毒途徑應盡可能模擬人體可能的暴露途徑，主要途徑有經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入三種，應根據(jù)受試物的理化性質(zhì)和接觸方式選擇確定。經(jīng)口染毒是將受試物給予實驗動物的常用途徑，一般把受試物摻入飼料或飲水中連續(xù)給予動物(5～7天／周)。若摻入后的適口性不良，可用灌胃法。摻入濃度要定期監(jiān)測，觀察其均勻性和穩(wěn)定性，摻入的濃度一般不超過5％。經(jīng)皮染毒，涂敷受試物的面積一般不少于動物體表總面積的10％。必須保證受試物與皮膚良好接觸，并防止動物舔食。每天涂抹一次，每周3～7次。吸人染毒，每天染毒4小時，每周5～7天。染毒柜內(nèi)受試物濃度應定期或連續(xù)監(jiān)測，其分布應均勻、恒定。其他注射途徑可根據(jù)需要采用。四、試驗期限ICH(1997)建議參考下面幾條準則：(1)一般情況下，試驗期限小鼠和倉鼠應為18個月，大鼠為24個月；然而對于某些生命期較長或自發(fā)腫瘤率低的動物品系，小鼠和倉鼠可持續(xù)24個月，大鼠可持續(xù)30個月。(2)當最低劑量組或?qū)φ战M存活的動物只有25％時，也可以結束試驗，對于有明顯性別差異的試驗，則試驗結束的時間對不同的性別應有所不同，在某種情況下因明顯的毒性作用，只造成高劑量組動物過早死亡，此時不應結束試驗。一個合格的陰性對照試驗應符合下列標準：①因自溶、同類自食，或因管理問題所造成的動物損失在任何一組都不能高于10％。②小鼠和倉鼠在18個月，大鼠在24個月時各組存活的動物不能少于50％。五、觀察和結果分析1.一般觀察每天觀察受試動物一次，主要觀察其外表、活動、攝食情況等。在實驗最初三個月每周稱體重一次，以后每兩周稱體重一次。經(jīng)飼料或飲水給以受試物時，應記錄食物消耗量或飲水量，以計算受試物的攝人量。觀察時要注意有無腫瘤出現(xiàn)、腫瘤出現(xiàn)時間及死亡時間。老年動物多病易死，應加強巡視，防止動物死亡后未及時剖驗，發(fā)生尸體組織自溶。2.病理檢查動物自然死亡或處死后必須及時進行病理檢查，包括肉眼和組織切片檢查。組織切片檢查應包括已出現(xiàn)腫瘤或可疑腫瘤的器官和肉眼檢查有明顯病變的器官，應注意觀察癌前病變。通過病理檢查確定腫瘤的性質(zhì)和靶器官。3.結果分析統(tǒng)計各種腫瘤的數(shù)量(包括良性和惡性腫瘤)及任何少見的腫瘤的動物數(shù)、每只動物的腫瘤數(shù)及腫瘤潛伏期。腫瘤發(fā)生率(％)=(實驗結束時患腫瘤動物總數(shù)／有效動物總數(shù))×100％式中，有效動物總數(shù)指最早發(fā)現(xiàn)腫瘤時存活動物總數(shù)。腫瘤潛伏期即從攝人受試物起到發(fā)現(xiàn)腫瘤的時間，因為內(nèi)臟腫瘤不易覺察，通常將腫瘤引起該動物死亡的時間定為發(fā)生腫瘤的時間。應對試驗結果進行仔細的統(tǒng)計學分析，并研究劑量—反應關系。致癌試驗陽性的判定標準為WHO提出的標準。WHO(1969)提出機體可以對致癌物有下列一種或多種反應：(1)對于對照組也出現(xiàn)的一種或數(shù)種腫瘤，試驗組腫瘤發(fā)生率增加；(2)試驗組發(fā)生對照組沒有的腫瘤類型；(3)試驗組腫瘤發(fā)生早于對照組；(4)與對照組比較，試驗組每個動物的平均腫瘤數(shù)增加。在進行試驗的兩個物種兩種性別動物中，有一種結果為陽性，即認為該受試物有致癌性。兩個物種兩種性別動物試驗結果均為陰性時，方能認為未觀察到致癌作用。在結果報告中，應著重報告發(fā)現(xiàn)腫瘤的部位、數(shù)量、性質(zhì)、癌前病變，以及其他毒性效應；應報告劑量—反應關系及統(tǒng)計學分析結果。如在動物組織中觀察到良性和惡性腫瘤，并有良性腫瘤向惡性化進展的證據(jù)，在進行統(tǒng)計學分析之前將良性和惡性腫瘤合并是適宜的，但仍希望分別對良性和惡性腫瘤分別進行統(tǒng)計學處理。評價該試驗不同劑量良性腫瘤和惡性腫瘤的相對數(shù)量可有助于確定該受試動物對受試物的劑量反應關系。另一方面，如果僅觀察到良性腫瘤，并無惡性化進展的證據(jù)，則將此受試物認為是致癌物是不適宜的，此僅提示在該試驗條件下需要進一步研究。與研究致癌作用有關的其他試驗一、短期試驗哺乳動物致癌試驗是標準體內(nèi)試驗，對于鑒定哺乳動物致癌物是關鍵性的試驗，但其實驗條件要求較高，人力、經(jīng)費及時間耗費巨大，難以滿足化學品安全性評價的要求。為此，發(fā)展了一些與研究致癌作用有關的其他試驗。一、用于致癌物篩選的短期試驗目前已建立的短期試驗為數(shù)近百種。在發(fā)展這些方法的早期，由于對于致癌過程的復雜性認識還不充分，有些學者認為誘變性與致癌性關系密切，單純利用短期的誘變試驗就可以預測致癌性（Ames，1973）。但經(jīng)過大量的試驗表明：一些化合物可對于嚙齒類動物具有致癌作用，而在Ames試驗或其它誘變試驗系統(tǒng)則呈現(xiàn)陰性。用于致癌物篩選的短期試驗如下：①基因突變試驗：鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(Ames試驗)，培養(yǎng)哺乳動物細胞TK或HPRT正向突變試驗；②染色體畸變試驗：體外細胞系細胞遺傳學分析，小鼠骨髓微核試驗，大鼠骨髓染色體畸變試驗；③原發(fā)性DNA損傷：DNA加合物，鏈斷裂，DNA修復誘導(細菌SOS反應，大鼠肝UDS誘導)，SCE試驗；④體外細胞轉(zhuǎn)化：敘利亞地鼠胚胎細胞，Balb／c3T3細胞。哺乳動物細胞轉(zhuǎn)化試驗是體外試驗，是一種遺傳毒理學試驗。在第六章中介紹的遺傳毒理學試驗的遺傳學終點為基因突變、染色體畸變、DNA原發(fā)性損傷和非整倍體，而體外細胞轉(zhuǎn)化則是另一個重要的遺傳學終點。[體外細胞轉(zhuǎn)化試驗是檢測受試物對體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞轉(zhuǎn)化的遺傳毒理試驗。是將動物細胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境下，將細胞暴露于致癌物，高度模擬致癌物在體內(nèi)致癌的作用進行致癌物檢測的一種技術，可以有效的體外篩查致癌物質(zhì)的致癌活性。不僅可以檢測具有遺傳毒性的潛在致癌物，還可以檢測非遺傳毒性致癌物的致癌活性。體外細胞轉(zhuǎn)化試驗是以所培養(yǎng)的細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化從而產(chǎn)生的形態(tài)改變?yōu)樵囼灲K點，可直接在體外觀察并記錄細胞由正常轉(zhuǎn)化為具有腫瘤細胞性質(zhì)的過程。]四個短期試驗系統(tǒng)分別與動物誘癌試驗結果相對比可見Ames試驗與動物試驗相關顯著性最高，特異性亦最高（91%），但敏感性最低（48%）。Ames試驗陽性預測率亦最高（89%）。姐妹染色體交換與小鼠淋巴瘤試驗則敏感性較高（分別為69%與72%），但陽性預測率低（64%，63%）。由此可見Ames試驗對于誘變作用的致癌性可檢出大部分，但對于無誘變性的致癌物則不能準確判定。當前短期試驗在預測致癌性方面所遇到的最大問題是如何檢出非誘變性致癌物。一些化合物可通過影響細胞的自穩(wěn)狀態(tài)或代謝，通過引起炎癥或抑制修復過程，或者影響細胞增殖周期、細胞分化、基因表達程度等方面作用于致癌過程。這些作用利用現(xiàn)有的短期試驗無法檢出。迄今為止，只有動物誘癌試驗可以準確判別人類致癌物的致癌性。二、哺乳動物短期致癌試驗哺乳動物短期致癌試驗又稱為有限體內(nèi)試驗，指時間有限(數(shù)月)，靶器官有限。較受重視的短期致癌試驗有下列四種：1.小鼠皮膚腫瘤誘發(fā)試驗，于小鼠皮膚局部連續(xù)涂抹受試物，以觀察皮膚乳頭瘤和癌的發(fā)生，一般20周可結束實驗，較敏感的小鼠為SENCAR小鼠。此試驗也可設計為檢測受試物的引發(fā)活性或促長活性。典型的引發(fā)劑為致癌性多環(huán)芳烴，促長劑為佛波醇酯(TPA)。2.小鼠肺瘤誘發(fā)試驗。染毒途徑常用腹腔注射，也可灌胃或吸人，一般30周可結束實驗，觀察肺腫瘤的發(fā)生。較敏感的小鼠為A系小鼠。此試驗也可設計為檢測受試物的引發(fā)活性或促長活性。典型的引發(fā)劑為烏拉坦，促長劑為二丁基羥基甲苯(BHT)。3.大鼠肝轉(zhuǎn)化灶誘發(fā)試驗。對大鼠進行肝大部切除術后，給以受試物，一般可在8-14周結束實驗，觀察肝轉(zhuǎn)化灶生成。肝轉(zhuǎn)化灶是癌前病變，有r—谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(r-GT)活性升高，G6P酶(G6Pase)和ATP酶(ATPase)活性降低，以及鐵攝取能力降低。轉(zhuǎn)化灶可用組織化學或免疫化學方法鑒定。此試驗也可設計為檢測受試物的引發(fā)活性或促長活性。典型的引發(fā)劑為二乙基亞硝胺(DEN)，促長劑為苯巴比妥(PB)。4.雌性大鼠乳腺癌誘發(fā)試驗，一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，實驗周期為6個月。此四個試驗不是成組試驗，應根據(jù)受試物的特點選擇使用。此四個試驗任一試驗得到陽性結果的意義與長期動物致癌試驗相似，但陰性結果并不能排除受試物的致癌性。三、轉(zhuǎn)基因小鼠在致癌作用的研究轉(zhuǎn)基因小鼠可用于研究在致癌過程中特定基因的作用，可用于分析化學物-基因的相互作用?？煞譃?類。1.轉(zhuǎn)癌基因小鼠。與轉(zhuǎn)錄啟動子連接的癌基因轉(zhuǎn)入后可直接在某些特定的組織中高效表達，使該組織細胞處于引發(fā)狀態(tài)，這類轉(zhuǎn)基因動物是研究化學物致癌作用的敏感體系。攜帶癌基因的轉(zhuǎn)基因動物可用于致癌試驗，試驗周期僅3個月左右，有希望發(fā)展成代替長期動物致癌試驗的試驗系統(tǒng)。這些攜帶有癌基因的轉(zhuǎn)基因動物，可用來研究外源化學物與腫瘤相關基因的作用及外源化學物在致癌不同階段中的作用機制。以各種組織特異性的促長劑處理轉(zhuǎn)入不同癌基因的小鼠，可為致癌過程的研究提供新線索。2.腫瘤抑制基因敲除小鼠。在P53-／-小鼠，腫瘤(特別是淋巴肉瘤)的發(fā)生比正常小鼠(P53+／+)增加而且提前。由于P53-／-小鼠的腫瘤發(fā)生具有組織特異性，進一步研究這些腫瘤的遺傳學基礎有助于鑒定P53基因的功能。而半合子小鼠(P53+／-)在出生后6個月內(nèi)自發(fā)癌發(fā)生率低，但在之后發(fā)生淋巴瘤和軟組織肉瘤，其中大部分丟失P53野生型等位基因。這種小鼠對遺傳毒性致癌物敏感性并不增加。這種半合子小鼠也可用于鑒定致癌過程中的協(xié)作基因。而且缺P53小鼠加速形成惡性腫瘤，提示此基因主要在進展階段起作用。P53在腫瘤發(fā)生中的作用有待進一步研究。3.轉(zhuǎn)穿梭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因動物小鼠：轉(zhuǎn)入帶有報告基因的穿梭載體是研究體內(nèi)基因突變的轉(zhuǎn)基因動物模型。常用的靶基因如laeI、lacZ可通過噬菌體體外包裝等方法，從小鼠基因組內(nèi)回收，再在大腸桿菌內(nèi)檢測靶基因突變，可為研究不同器官基因的自發(fā)突變和誘發(fā)突變的分子機制提供有效的方法。二、動物誘癌試驗一般認為動物誘癌試驗結果對于判別化學物質(zhì)致癌性具有很高價值，短期試驗固然不能取而代之，即使是人類流行病資料，雖然在一定條件下，單獨就可以證實是否屬人類致癌物，但動物誘癌模型對于闡明其致癌原理，研究有關作用因素具有不可替代的作用。動物誘癌試驗至今仍然是鑒定致癌性的重要條件，目前可用的化學致癌動物模型已有多種（表9一2）。短期試驗固然不可取代動物誘癌試驗，但短期試驗對于幫助選擇適當?shù)膭游镌囼炇茉囄锞哂兄匾膬r值。三、人群流行病學觀察要判別人類致癌物，流行病學資料是具有決定意義的，甚至只根據(jù)完整的人類流行病學資料，即可判別某種物質(zhì)是否為人類致癌物。砷化物即為一例。但完整的、可信的流行病學材料來之不易。過去流行病調(diào)查都以腫瘤發(fā)病數(shù)或死亡作為觀察單位，其判別的準確性是無疑的。但這是屬最后期的結果，不能用于早期發(fā)現(xiàn)、早期阻斷。近年在流行病學研究中引進了生物標記，其中包括一些早期、中期生物標記，特別是分子水平標記的方法。使分子流行病學在一定條件下應用于判別某些化合物對于人類的致癌性、致癌危險性評價以及腫瘤化學預防的干預試驗等方面。目前已在使用的化學致癌生物標記有以下幾類：(1)接觸標記可檢查在細胞、組織或體液內(nèi)某些致癌物的含量，用以衡量接觸的水平，例如檢查血清及脂肪組織內(nèi)DDT、多氯聯(lián)苯的濃度，吸煙者血清及唾液中N-甲-2-(3-吡啶基）-5-吡咯烷酮等。這類標記測定結果只說明機體接觸情況，不說明所接觸物質(zhì)對機體，特別是靶細胞是否已起作用。另一方面可檢查生物有效劑量，即檢查致癌物到達細胞的劑量或反映與細胞大分子相互作用的程度。雖然所作用的細胞不一定是靶細胞而是它的替代物，但二者之間有一致的關系。目前常用的有各種致癌物-DNA加合物或致癌物-蛋白質(zhì)加合物。由于這是致癌物經(jīng)歷體內(nèi)一系列吸收、分布、排泄以及生物轉(zhuǎn)化后在靶分子上所呈現(xiàn)的結果，比一般內(nèi)劑量有更直接的生物學意義。(2）生物效應標記反映致癌物對于靶子或相類似部位所造成的損害，這些損害可能與腫瘤有關。這類標記很多，但最終能完全證明它與腫瘤發(fā)生的因果關系的標記為數(shù)尚不多。這類標記常用的有姐妹染色體交換（接觸多種工業(yè)毒物、電離輻射），微核形成（有機溶劑、重金屬、吸煙、咀嚼檳榔），染色體畸變（工業(yè)毒物、電離輻射、大氣污染物），次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（腫瘤化療藥物、電離輻射），MN血型糖蛋白（GPT），突變（腫瘤化療藥物、電離輻射）、腫瘤抑制基因（例如p53)突變（黃曲霉毒素），癌基因活化（多環(huán)芳烴、吸煙）等。(3)敏感性標記這是一類衡量致癌物反應性個體差異的標記?？捎糜跈z出腫瘤高危個體。目前多注意參與致癌物活化與滅活代謝的酶系多態(tài)性。以上三類生物標記在化學致癌研究中常用于三個方面：一是病因?qū)W研究，用以確立某種因素與某種腫瘤之間的因果關系。用一種特異性的生物標記作為觀察終點，代替?zhèn)鹘y(tǒng)流行病學所選用的疾病或死亡終點，可達到早期判別、早期預防的目的。例如在20世紀90年代，有些學者以多環(huán)烴-DNA(PAH-DNA）加合物作為標記，觀察工業(yè)大氣污染及吸煙接觸PAH后，白細胞內(nèi)、肺組織內(nèi)、胎盤組織內(nèi)PAH-DNA的出現(xiàn)與分布規(guī)律。二是用于危險度評價。使用生物有效劑量衡量PAH的危險度比其它接觸參數(shù)更為直接，是一次有應用前景的嘗試。它比利用腫瘤發(fā)生率（或死亡率）作為觀察指標更為敏惑，更有利于使危險度評價應用于預防。三是用于干預試驗中臨床流行病學觀察。腫瘤化學預防的干預試驗過去是利用腫瘤發(fā)生率的變化作為判別終點。凡能降低腫瘤發(fā)生率的物質(zhì)就是具有化學預防作用，但是得到這一結果往往需要長至10年的觀察期，這期間有很多干擾因素，要作出準確的結論是不容易的。致癌性判別不單純是一個學術上的問題，而且和管理部門制定政策有密切關系。必須將短期試驗、動物試驗以及人群流行病學資料所得結果綜合起來，詳加分析，才能得出準確的結論。目前這三個方面試驗的方法學仍然有許多不足之處，有待進一步完善。思考題