檢驗(yàn)科微生物室課件

臨床微生物質(zhì)量控制內(nèi)容二、臨床微生物的質(zhì)量控制三、實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量控制四、實(shí)驗(yàn)中質(zhì)量控制五、實(shí)驗(yàn)后質(zhì)量控制六、工作中常見的問題和解決方法七、目標(biāo)一、臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的重要性臨床微生物檢驗(yàn)的目的和意義提供感染性疾病診斷的病原學(xué)依據(jù)為醫(yī)院感染流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)為感染性疾病治療提供用藥依據(jù)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測需要為合理使用抗菌藥物提供依據(jù)為生物安全、醫(yī)院感染管理和監(jiān)控預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)臨床微生物檢驗(yàn)質(zhì)量控制的有關(guān)概念為了保證質(zhì)量控制，首先應(yīng)了解以下有關(guān)概念：細(xì)菌檢驗(yàn)的質(zhì)量：結(jié)果真實(shí)顯示標(biāo)本中存在的病原菌及其生化特征和抗藥性細(xì)菌檢驗(yàn)的質(zhì)量控制：制定細(xì)菌檢驗(yàn)的質(zhì)量水平，并采取監(jiān)測手段，這一過程稱為細(xì)菌檢驗(yàn)的質(zhì)量控制。質(zhì)量保證：為達(dá)到應(yīng)有的質(zhì)量水平而采取的措施。質(zhì)量評價(jià)：用一個(gè)客觀的公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)來評定一個(gè)實(shí)驗(yàn)室或?qū)嶒?yàn)室中某項(xiàng)試驗(yàn)是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的過程。室間質(zhì)量控制：是各地實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行質(zhì)量控制的一種方式，也是上一級實(shí)驗(yàn)室對各實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行質(zhì)量管理的手段。參加由省臨床檢驗(yàn)中心或衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)控，會遇見一些平時(shí)罕見或未見過的菌株，通過質(zhì)控檢驗(yàn)對它們的生長條件、菌落形態(tài)、染色、鏡下形態(tài)等有了較深的感性認(rèn)識。日后工作中倘若再遇見這些菌將不再會漏檢。室內(nèi)質(zhì)量控制：做好室內(nèi)質(zhì)控直接關(guān)系到日常檢驗(yàn)工作的質(zhì)量。室內(nèi)質(zhì)控主要包括幾個(gè)方面：實(shí)驗(yàn)室前的質(zhì)量控制、標(biāo)本接種前的質(zhì)量控制、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制、試劑質(zhì)量控制、常用儀器的質(zhì)量控制、藥敏實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制、及發(fā)報(bào)告前的質(zhì)量控制。分析后質(zhì)量控制范疇分析前分析中質(zhì)量保持持續(xù)改進(jìn)微生物實(shí)驗(yàn)室程序臨床微生物制度生物安全防護(hù)制度三級報(bào)告制度：①涂片；②初步藥敏和確切涂片；③正式鑒定和藥敏傳染病原報(bào)告制度菌毒株保存制度廢棄物處理制度質(zhì)量控制制度制定程序性文件（可參考ISO15189認(rèn)可準(zhǔn)則中應(yīng)用說明要求）SOP操作手冊儀器的性能驗(yàn)證等為了保證質(zhì)量控制，我們需注意：標(biāo)本的質(zhì)量（數(shù)量、體積、可接受的合格標(biāo)本、運(yùn)送方式等）試驗(yàn)方法的有效性（根據(jù)臨床癥狀、診斷和其他臨床資料，采用適當(dāng)檢測方法）試驗(yàn)的操作方法和步驟、試劑、培養(yǎng)基、儀器、環(huán)境、人員等。有臨床意義的結(jié)果報(bào)告（報(bào)告的及時(shí)、準(zhǔn)確、完整）臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的基本裝備孵育箱、CO2培養(yǎng)箱、高壓滅菌器生物安全柜試劑、染液、質(zhì)控菌株、培養(yǎng)基冰箱、酒精燈、接種環(huán)、游標(biāo)卡尺、溫度計(jì)等光學(xué)顯微鏡室內(nèi)質(zhì)控室內(nèi)質(zhì)控內(nèi)容包括對各種實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行監(jiān)督監(jiān)督的對象有儀器設(shè)備、培養(yǎng)基、鑒定系統(tǒng)等操作全過程室間質(zhì)評臨床微生物室需建立室內(nèi)質(zhì)控

11234常規(guī)試驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控培養(yǎng)基質(zhì)控藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控自動化設(shè)備質(zhì)控：鑒定和藥敏、血培養(yǎng)系統(tǒng)質(zhì)控必備菌株細(xì)菌名稱菌號用途金黃色葡萄球菌ATCC25923紙片擴(kuò)散質(zhì)控金黃色葡萄球菌ATCC29213MIC測定質(zhì)控大腸桿菌ATCC25922紙片和MIC綠膿假單胞菌ATCC27853紙片和MIC糞腸球菌ATCC29212胸腺嘧啶含量測定淋病奈瑟菌ATCC49226淋球菌藥敏流感嗜血桿菌ATCC49247嗜血桿菌藥敏肺炎克雷伯菌ATCC700603ESBL陽性菌低溫速凍苛養(yǎng)細(xì)菌冷凍干燥長期保留菌株參考菌株保存方法高層瓊脂非苛養(yǎng)菌瓊脂斜面現(xiàn)用菌株參考菌株保存方法室間質(zhì)評—樣本的檢測操作程序1.測試環(huán)境、儀器、試劑的要求室溫：20～25℃濕度：<80%試劑：所用試劑或試條均為儀器配套產(chǎn)品質(zhì)控品：為儀器配套產(chǎn)品，并在使用效期內(nèi)，同時(shí)無變質(zhì)或污染。儀器：儀器必須有質(zhì)量控制保證。2.質(zhì)評樣品的準(zhǔn)備按測定日期從冰箱中取出參評物，放置至室溫(約30min)。根據(jù)標(biāo)本種類，質(zhì)控菌株進(jìn)行培養(yǎng)分離鑒定。3.質(zhì)評樣品的測定質(zhì)控菌株用小牛血清或肉湯溶解，按標(biāo)本種類接種各種選擇培養(yǎng)基，放適當(dāng)環(huán)境培養(yǎng)。培養(yǎng)分離病原菌，根據(jù)病原菌種類進(jìn)行鑒定和耐藥表型檢測，并根據(jù)質(zhì)控要求，病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)(重復(fù)2次)。4.填寫報(bào)表或網(wǎng)上回報(bào)填寫報(bào)表時(shí)應(yīng)按要求逐項(xiàng)填寫，字跡清晰整潔。填寫完后再次核對，以防筆誤、樣本號順序錯(cuò)誤等。然后則測定者、室負(fù)責(zé)人簽字。5.結(jié)果存檔填寫完后復(fù)印或?qū)⒕W(wǎng)頁另存，一份寄出，一份存檔，以備核查。室間質(zhì)評的評價(jià)方法1.單項(xiàng)PT值評分標(biāo)準(zhǔn)每一批號每一項(xiàng)目結(jié)果在允許范圍內(nèi)時(shí)，測定結(jié)果合格，得分為100%，若在允許范圍外時(shí)，測定結(jié)果不合格，得分為0%。單個(gè)項(xiàng)目的得分計(jì)算公式為：(該項(xiàng)目的合格結(jié)果數(shù)÷該項(xiàng)目的總的測定樣本數(shù))×100%。合格：該項(xiàng)目的測定成績≥80%

不合格：該項(xiàng)目的測定成績≤80%2.總項(xiàng)目的PT值評分標(biāo)準(zhǔn)總項(xiàng)目的計(jì)算公式為：

(總項(xiàng)目的合格結(jié)果數(shù)÷總項(xiàng)目的總的測定樣本數(shù))×100%

合格：總項(xiàng)目的測定總分≥80%

不合格：總項(xiàng)目的測定總分≤80%3.部臨檢中心給參加實(shí)驗(yàn)室發(fā)證書的規(guī)定合格證書：每年每個(gè)專業(yè)參加2次或3次以上，不得缺席，每次有五個(gè)調(diào)查樣本。每次總項(xiàng)目的測定總分≥80%；頒發(fā)合格證書。參加證書：不符合合格證書的要求和標(biāo)準(zhǔn)的均頒發(fā)參加證書。注意：若失控，應(yīng)將調(diào)查所有失控原因及相關(guān)糾正措施，并做好記錄，上報(bào)科質(zhì)量控制小組和科主任，由科主任簽字后，質(zhì)控結(jié)果歸檔保存。1.患者的準(zhǔn)備2.標(biāo)本采集3.標(biāo)本保存與送檢4.驗(yàn)收和登記5.標(biāo)本的正確評估

三、實(shí)驗(yàn)室前的質(zhì)量控制1.患者的準(zhǔn)備①精神因素：緊張、情緒激動可影響神經(jīng)內(nèi)分泌功能，致使白細(xì)胞、血糖、乳酸、非酯化脂肪酸升高，在采集血液標(biāo)本前醫(yī)生或護(hù)士應(yīng)向患者解釋采集標(biāo)本的目的、方法及注意事項(xiàng)，讓患者克服緊張情緒。②飲食：某些血液成分受飲食影響較大，護(hù)士在標(biāo)本采集前要告訴患者明確的禁食時(shí)間及禁食內(nèi)容，以避免飲食因素影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如血脂檢測至少兩周內(nèi)保持一般飲食，患者應(yīng)在采血前24h禁食高脂肪飲食，12h禁食空腹采血，且前1d晚禁止大量飲酒。③運(yùn)動：強(qiáng)烈的肌肉運(yùn)動明顯影響體內(nèi)代謝，丙酮酸、乳酸可升高，對紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白的測定明顯影響，可造成假性升高。住院患者可在起床前抽血，匆忙起床到門診的患者應(yīng)至少休息15min后采血。④藥物：藥物對血液成分的影響是一個(gè)十分復(fù)雜的問題。采集標(biāo)本應(yīng)盡量選擇在未使用各種藥物前。如患者長期服用藥物，在選擇與解釋結(jié)果時(shí)，必須考慮藥物的影響。

3.正確的運(yùn)送和保存方式需進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢測的所有標(biāo)本，最好在收集后2h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室。量少標(biāo)本在采集后15-30分鐘內(nèi)送檢。對環(huán)境敏感的細(xì)菌包括志賀氏菌、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟氏菌和流感嗜血桿菌（對低溫敏感）等均應(yīng)立即處理。通常用于細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)本在4°C存放不超過24h，而病毒檢測標(biāo)本可于4°C存放2-3天。4.標(biāo)本驗(yàn)收仔細(xì)核對，標(biāo)本標(biāo)識是否與申請單一致和唯一，對不合格標(biāo)本要拒收。5.標(biāo)本評估—有可靠的標(biāo)本質(zhì)量評價(jià)方法痰標(biāo)本中>10個(gè)上皮細(xì)胞/LP、<25個(gè)WBC/LP為不合格標(biāo)本有培養(yǎng)價(jià)值的糞便標(biāo)本：涂片鏡檢WBC>5個(gè)/HP，未經(jīng)抗菌藥物治療的持續(xù)性腹瀉患者糞便傷口標(biāo)本：如出現(xiàn)上皮細(xì)胞，提示標(biāo)本已受皮膚菌群的污染，高倍視野中超過5個(gè)鱗狀上皮細(xì)胞的傷口標(biāo)本不適合做厭氧培養(yǎng)血液細(xì)菌培養(yǎng)臨床上疑為敗血癥、膿毒血癥或其他血流感染的患者，需做血液細(xì)菌培養(yǎng)以明確病原。及時(shí)、準(zhǔn)確地從患者血液中分離出病原菌，才能正確實(shí)施有效地抗菌治療，從而有助于提高治愈率和降低醫(yī)療費(fèi)用。

1.采血時(shí)機(jī)應(yīng)在用抗菌素治療前,最好在患者發(fā)冷發(fā)熱前半小時(shí)采血為宜。2.采血次數(shù)與間隔急性感染患者：從兩臂分別采2份血樣（兩套）。感染性心內(nèi)膜炎患者：24h內(nèi)采血3次,每次間隔不少于30分鐘。發(fā)熱原因不明患者：24～48h后可再采血2次,間隔不少于60分鐘。呼吸道標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)----痰采集方法自然咳痰：必須用清水漱口3次，應(yīng)包括咽喉部，立即用力咳出痰，于滅菌容器中或輸送培養(yǎng)基中；支氣管鏡或支氣管毛刷:由醫(yī)生采集，建議直接種入輸送培養(yǎng)基處理痰首先用滅菌生理鹽水將痰液洗3次，然后將痰塊打碎，或加入等量10g/L的胰蛋白酶將痰塊消化后再接種。合格標(biāo)本

外觀為膿痰、粘液、血，涂片鏡檢<10個(gè)上皮細(xì)胞/LP、>25個(gè)WBC/LP為合格標(biāo)本。泌尿道標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)應(yīng)在用藥前或停藥5天后留取標(biāo)本,并使尿液在膀胱內(nèi)停留6～8h以上。盡量避免或減少尿道口正常菌群干擾。清潔中段尿、導(dǎo)尿?qū)Ч苣?、?jīng)恥骨上皮膚穿刺采集膀胱內(nèi)尿液，送檢標(biāo)本以晨起第一次尿液為佳尿量不宜太多，試管塞子與尿液不應(yīng)直接接觸留取導(dǎo)尿管尿要排空導(dǎo)尿管內(nèi)陳舊尿液，倘留置尿管超過三天應(yīng)避免采用。標(biāo)本采集后立即送檢，不能立即送檢者，可暫存4℃冰箱，但保存不超過8h糞便標(biāo)本的培養(yǎng)應(yīng)在發(fā)病早期并且盡量在用抗生素治療前采集，稀便不少于1ml，固體便不少于1克，無便患者可用直腸拭子采集標(biāo)本。要挑取含膿、黏液、血等病理改變或水樣糞便送檢。直腸拭子采樣量要足夠，拭子上肉眼應(yīng)可見糞便。注意事項(xiàng)：⑴雖然糞便標(biāo)本本身含很多細(xì)菌但也要用無菌容器。⑵厭氧細(xì)菌（難辯梭菌）培養(yǎng)的標(biāo)本應(yīng)盡量減少與空氣接觸。⑶注意挑取膿血便或粘液便做培養(yǎng)⑷要進(jìn)行分區(qū)劃線。如圖所示。分泌物的培養(yǎng)1.對開放性病灶的采集：如眼結(jié)膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術(shù)后切口、導(dǎo)管治療感染、瘺管內(nèi)膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應(yīng)先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊的分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的組織送檢。2.閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對封閉的膿腫常采用穿刺或引流的的方法采樣，應(yīng)在用藥前采集，應(yīng)注意膿液的氣味、性狀、顏色注意厭氧菌存在的可能。不能及時(shí)送檢應(yīng)應(yīng)用輸送培養(yǎng)基。膿液標(biāo)本要盡量避免病灶表面細(xì)菌污染。開放性膿腫，采樣前無菌鹽水沖洗傷口，拭去表面污染膿液，挑取病灶深部膿液；封閉性膿液，嚴(yán)格病灶皮膚或黏膜表面的消毒后用無菌干燥注射器穿刺抽取，置無菌試管內(nèi)送檢，或切開排膿時(shí)用無菌拭子采集深部膿液。厭氧菌和傷口標(biāo)本厭氧菌標(biāo)本隔絕空氣-氧對厭氧菌有毒性作用液狀標(biāo)本應(yīng)用注射器抽取密封送檢分泌物標(biāo)本最好床邊采集床邊接種；另置厭氧環(huán)境送檢（輸送培養(yǎng)基）傷口標(biāo)本在傷口切開排膿時(shí)留取標(biāo)本不能在傷口消毒清洗后留取標(biāo)本盡量采集傷口深部的膿汁送檢腦脊液標(biāo)本直接涂片：革蘭染色、抗酸染色、印度墨汁染色無菌采集技術(shù)：避免標(biāo)本污染及患者被感染病毒培養(yǎng)標(biāo)本：置4℃保存分枝桿菌培養(yǎng)標(biāo)本：2mL以上，置4℃保存細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)本置35℃保存種類和環(huán)節(jié)多（細(xì)菌鑒定、藥敏、培養(yǎng)基、生化管、儀器、稀釋液）涉及知識面廣復(fù)雜性高需要強(qiáng)烈的責(zé)任感四、微生物試驗(yàn)分析中質(zhì)量控制常規(guī)試驗(yàn)的質(zhì)量控制-天天做（質(zhì)控菌株）觸酶試驗(yàn)：3％H2O2每三天更換一次血漿凝固酶試驗(yàn)：人血漿或商品乳膠試劑氧化酶試驗(yàn)：1％鹽酸四甲基對苯胺水溶液浸泡厚濾紙，室溫吹干壓成小紙片，置含干燥劑容器－20℃保存，或買商品制劑β－內(nèi)酰胺酶：頭孢硝噻吩(Nitrocefin)為底物，適于測試嗜血桿菌、淋球菌、卡他莫拉菌、腸球菌革蘭染色：革蘭陽性菌染成紫色；革蘭陰性菌染成紅色；另涂片厚度、染色和脫色時(shí)間、染料沉渣等也影響染色質(zhì)量培養(yǎng)基的質(zhì)量控制一般性狀：①外觀：透明、清亮、無混濁、無沉淀，顏色符合要求，表面濕潤但無水汽、平整、光潔無凹坑和氣泡。整塊平板厚薄均勻。②厚度：一般厚度在3mm，但MH平板厚度≥4mm。斜面的長度≤試管長度的2/3。③pH是細(xì)菌生長的重要條件之一，合格培養(yǎng)基的pH應(yīng)在規(guī)定值上下0.2的范圍內(nèi)。無菌試驗(yàn)：新制備或新買的培養(yǎng)基在使用前要隨機(jī)抽取一定數(shù)量的樣品作無菌試驗(yàn)。購買的培養(yǎng)基要有質(zhì)量保證如合格證明等文件；若無質(zhì)量保證需檢測相應(yīng)的性能。培養(yǎng)基的質(zhì)量控制細(xì)菌生長試驗(yàn)：所有的培養(yǎng)基在使用前還必須做細(xì)菌生長試驗(yàn)以測定培養(yǎng)基性能是否符合要求。標(biāo)準(zhǔn)菌株分2種：一種是已知的可在某種培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生典型生物學(xué)性狀的，對培養(yǎng)基中的某種物質(zhì)產(chǎn)生陽性反應(yīng)的菌株；另一種是用已知的不能在某種培養(yǎng)基上生長或?qū)ε囵B(yǎng)基中的某種物質(zhì)產(chǎn)生陰性生化反應(yīng)的菌株。如血瓊脂平板：乙型溶血性鏈球菌生長，β溶血；甲型鏈球菌，a溶血；巧克力瓊脂平板：流感嗜血桿菌生長良好；中國藍(lán)瓊脂平板和SS瓊脂平板：革蘭陰性菌生長，革蘭陽性菌不生長。試劑質(zhì)控臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常用的試劑包括染色液、診斷血清以及各種生化反應(yīng)試劑等。染色液及染色方法質(zhì)量控制：購買的或配置的染色液，每次需做好相關(guān)的記錄，如操作者和開瓶日期等；還要進(jìn)行染色步驟質(zhì)控，如革蘭染色在一張玻片上同時(shí)涂有金葡菌和大腸桿菌，以保證染色性判斷準(zhǔn)確無誤。常用生化試劑的質(zhì)控：隨著細(xì)菌鑒定儀和快速微量生化鑒定板條的普及，臨床微生物檢驗(yàn)常用的生化試劑種類日趨減少，應(yīng)注意在用試劑在貯存時(shí)的避光、冷藏等要求，保證試劑的穩(wěn)定性。不要使用過期的試劑。診斷血清的質(zhì)控：診斷血清是一種重要的細(xì)菌鑒定試劑，應(yīng)從有資質(zhì)的生產(chǎn)單位購買。驗(yàn)收時(shí)必須看清生產(chǎn)批號、血清效價(jià)、透明度與色澤。試驗(yàn)中應(yīng)注意無菌操作，避免細(xì)菌污染。要經(jīng)常檢查貯存在4℃冰箱中的各種血清，若發(fā)現(xiàn)混濁，出現(xiàn)絮狀，應(yīng)停止使用。為保證血清凝集反應(yīng)結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)每3個(gè)月對血清進(jìn)行一次質(zhì)控。不要使用過期的血清。紙片藥敏試驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控基礎(chǔ)質(zhì)控：連續(xù)做30天，如失控超過3次還需繼續(xù)，如失控低于3次可改為每周1次糾控：每周質(zhì)控中發(fā)生失控應(yīng)糾控，方法：連續(xù)5天，每天1次，每次重復(fù)5個(gè)紙片，如找到明確失控原因，可立即改為每周1次，否者繼續(xù)4℃冰箱保存一周的用量藥物敏感試驗(yàn)是臨床微生物檢驗(yàn)的重要步驟之一，其結(jié)果正確與否涉及治療效果的好壞。儀器的質(zhì)量控制按儀器說明規(guī)定用標(biāo)準(zhǔn)菌株定期對不同批號的試劑進(jìn)行質(zhì)控對冰箱、二氧化碳孵箱、普通孵箱、水浴箱等基本設(shè)備的每日溫度、氣體濃度的監(jiān)控記錄；顯微鏡、細(xì)菌鑒定儀等儀器的使用、保養(yǎng)、維修記錄。以保障實(shí)驗(yàn)室各種設(shè)備、儀器的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。對儀器進(jìn)行性能驗(yàn)證，若有兩臺以上的儀器則要進(jìn)行儀器比對細(xì)菌鑒定的基本步驟標(biāo)本的分離培養(yǎng)（這關(guān)系到整個(gè)結(jié)果的可靠性）培養(yǎng)結(jié)果的觀察（致病菌的選擇）細(xì)菌的分純、鑒定（天地人鑒定系統(tǒng)、ATB半自動微生物鑒定、VITEK系統(tǒng)、MicroScan自動微生物分析系統(tǒng)、Sensititre

全自動微生物鑒定系統(tǒng)）常用的培養(yǎng)基種類和用途血平板—普通細(xì)菌用巧克力平板—含V、X因子，主要培養(yǎng)嗜血桿菌、腦膜炎球菌和淋球菌用中國藍(lán)/麥康凱平板—G-桿菌用SS平板—沙門氏菌和志賀氏菌用M-H平板—細(xì)菌藥敏用TCBS平板—弧菌科細(xì)菌用真菌顯色平板—真菌培養(yǎng)用羅氏培養(yǎng)基—分枝桿菌用常見標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)基選擇痰-血平板、巧克力平板、（中國藍(lán)/麥康凱）放CO2環(huán)境，能分離肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌尿-血平板、（中國藍(lán)/麥康凱）定量培養(yǎng)糞便-中國藍(lán)/麥康凱平板、SS平板等能分離沙門菌、志賀菌等，報(bào)告“未檢出XXX菌”腦脊液-血平板、巧克力平板CO2環(huán)境，能分離常見苛養(yǎng)菌（腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、單核細(xì)胞李斯特菌等），常規(guī)進(jìn)行革蘭染色、墨汁染色胸腹水：血平板、巧克力、肉湯胃液、膽汁：血平板、中國蘭、肉湯真菌培養(yǎng)：沙氏培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)：厭氧血平板、中國蘭、肉湯、涂片陰拭子、膿、分泌物：血平板、中國蘭、肉湯咽、眼、耳拭子：血平板、巧克力平板、中國蘭、肉湯；TB培養(yǎng)：羅氏雞蛋培養(yǎng)注：血平板和巧克力平板放置CO2培養(yǎng)箱或燭缸培養(yǎng)，其它放置普通培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)結(jié)果的觀察（致病菌的選擇）觀察培養(yǎng)基上是否有細(xì)菌生長觀察生長情況（是單一種細(xì)菌還是多種細(xì)菌）觀察生長的細(xì)菌是否具有某些典型特征排除污染細(xì)菌對于無菌部位所采集的標(biāo)本（CSF、胸水、腹水、關(guān)節(jié)液、血液、骨髓、各器官穿刺液等等），只要培養(yǎng)出細(xì)菌（排除污染）一律都視為致病菌。對于有菌部位或易被正常菌群污染的標(biāo)本，培養(yǎng)出細(xì)菌后，要根據(jù)標(biāo)本的不同，排除正常菌群后，再挑選致病菌（請看下圖）。無菌部位標(biāo)本涂片染色

涂片染色：應(yīng)具備最基本的兩種染色技術(shù)，即革蘭氏染色和抗酸染色。1革蘭染色：革蘭染色報(bào)告必須包括染色反應(yīng)或微生物種類和類別，描述物種的形態(tài)或結(jié)構(gòu)。如革蘭染色見到革蘭陽性球菌，呈葡萄狀排列；又如革蘭染色見到真菌小分生孢子及菌絲。2.抗酸染色：抗酸染色報(bào)告應(yīng)顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌三種結(jié)果，報(bào)告中應(yīng)以加號體現(xiàn)標(biāo)本中抗酸桿菌的存在量。如找到抗酸桿菌++；見到染色不典型抗酸桿菌+，建議再送標(biāo)本；不能報(bào)告找到結(jié)核桿菌但可報(bào)告未找到結(jié)核桿菌。細(xì)菌鑒定血清學(xué)試驗(yàn)?zāi)c道致病菌生化特征符合的前提下必須有血清學(xué)的試驗(yàn)作最后確認(rèn)，基層細(xì)菌室應(yīng)具備1-3項(xiàng)血清試劑。1.志賀氏菌多價(jià)和單價(jià)凝集血清：2.沙門氏菌多價(jià)和單價(jià)凝集血清3.致病性大腸桿菌多價(jià)和單價(jià)凝結(jié)血清4.耶爾森氏菌凝集血清真菌鑒定1．每一基層實(shí)驗(yàn)室必須開展真菌涂片，報(bào)告臨床是否找到真菌；是否見到真菌菌絲；從形態(tài)辨別常見絲狀真菌;區(qū)別曲菌或毛霉菌。2．開展酵母樣真菌分離培養(yǎng)，應(yīng)具備最基本的沙氏培養(yǎng)基或用顯色培養(yǎng)基，鑒別白念和非白念，隱球菌等。3.有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)開展非培養(yǎng)的鑒定方法，如

-D葡聚糖的檢測?？咕幬锩舾行栽囼?yàn)-常用方法擴(kuò)散試驗(yàn)diffusiontest：紙片擴(kuò)散法(抑菌圈直徑)稀釋試驗(yàn)dilutiontest：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、最小抑菌濃度minimuminhibitoryconcentration，MICE試驗(yàn)E-test自動化儀器檢測

紙片擴(kuò)散法操作步驟制備接種物（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬㎝-H瓊脂平板上（15分鐘內(nèi)接種，涂抹均勻）在接種好的瓊脂平板上貼加紙片

孵育（15分鐘內(nèi)反轉(zhuǎn)平板，35°C空氣孵育）

苛養(yǎng)菌5％CO2孵育判度結(jié)果和解釋結(jié)果ESBL確認(rèn)試驗(yàn)ESBL的質(zhì)控頻率篩選試驗(yàn)和表型確證試驗(yàn)均可每日進(jìn)行或每周進(jìn)行，所選擇菌株為肺克700603或大腸埃希菌25922。應(yīng)該注意的是：肺克700603ESBL基因在質(zhì)粒上，應(yīng)將其凍存于-60℃或以下。奇異變形桿菌ESBL監(jiān)測試驗(yàn)不適用不適用Ceftriaxone>1

27Cefotaxime

NANAAztreonam>1

22Ceftazidime>1*

22*Cefpodoxime稀釋法

(μg/ml)紙片擴(kuò)散法(mm)Drug可誘導(dǎo)的克林霉素耐藥(erm-介導(dǎo))常規(guī)D－試驗(yàn):陽性

15

g紅霉素紙片及2

g克林霉素之間距離為15-26.“DTest”–陽性反應(yīng)

紙片擴(kuò)散法判讀結(jié)果將游標(biāo)卡尺置于反轉(zhuǎn)的平板的背面，測量到最接近的整數(shù)毫米數(shù)。平板應(yīng)距離一個(gè)黑色不反光的背景數(shù)英寸，并用反射光照明。如果是加血的瓊脂培養(yǎng)基，則應(yīng)在透射光照射下，打開培養(yǎng)皿蓋，從上表面測量抑菌圈。如果被測菌是葡萄球菌或腸球菌，則應(yīng)孵育24小時(shí)，再在透射光下分別觀察苯唑西林或萬古霉素的透明抑菌圈內(nèi)有無耐甲氧西林或耐萬古霉素菌落的微弱生長，遇不敏感的結(jié)果需用稀釋法測定MIC法確變形桿菌(遷移生長)以及磺胺類藥物的紙片法藥敏忽略薄紗樣蔓延生長，微弱生長（20%或更少），克林霉素對葡萄球菌的抑菌圈內(nèi)如有薄霧狀菌苔應(yīng)報(bào)告細(xì)菌對克林霉素耐藥,不管其是否顯示“D”抑菌圈五、實(shí)驗(yàn)后質(zhì)量控制藥敏結(jié)果結(jié)果的審核S-敏感（Susceptible）：用常規(guī)用量治療有效，常規(guī)用藥時(shí)達(dá)到的平均血藥濃度超過細(xì)菌的MIC5倍以上。R-耐藥（Resistance）：用常規(guī)用量治療不能抑制細(xì)菌的生長，MIC高于藥物在血、體液中可能達(dá)到的濃度。I-中介(Intermediate)：MIC接近血、體液中藥物的濃度，治療反應(yīng)率低于敏感株，藥物生理濃集部位有效(泌尿道)，加大用藥劑量可能有效。常見細(xì)菌的耐藥問題肺炎鏈球菌—PRSP腸球菌—VRE葡萄球菌—MRSA、VRSA腸桿菌屬—AmpC超級細(xì)菌—NDM-1（Ⅰ型新德里金屬－β－內(nèi)酰胺酶）以上的耐藥問題都為目前全球最關(guān)注的細(xì)菌耐藥問題，也是我們在工作中要特別注意的問題

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室報(bào)告制度的規(guī)范臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對不同的細(xì)菌檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)間和內(nèi)容應(yīng)有相應(yīng)的規(guī)定，并告訴臨床各科，依此可防止不明原因的報(bào)告延遲。應(yīng)分兩種報(bào)告形式：危重感染報(bào)告:常規(guī)報(bào)告:報(bào)告的規(guī)范化1.涂片報(bào)告革蘭染色：危重報(bào)告30－60分鐘報(bào)告。報(bào)告內(nèi)容應(yīng)包括染色反應(yīng)、是細(xì)菌或真菌、細(xì)菌形態(tài)。有無細(xì)胞內(nèi)吞嗜現(xiàn)象，有無菌絲。抗酸染色：報(bào)告抗酸染色陽性或陰性；菌量以加號表示。常規(guī)報(bào)告24h,危重報(bào)告1h－2ｈ。2.血液和無菌體液培養(yǎng)的報(bào)告制度實(shí)行三級報(bào)告制度：第一級：培養(yǎng)液直接涂片結(jié)果；第二級：初步藥敏結(jié)果和平皿菌落涂片結(jié)果；第三級：正式細(xì)菌鑒定和藥敏報(bào)告。報(bào)告的規(guī)范化3.便培養(yǎng)24小時(shí)可發(fā)出初始報(bào)告;72小時(shí)應(yīng)報(bào)告藥敏試驗(yàn)結(jié)果；根據(jù)檢測范圍報(bào)告檢測結(jié)果，如未檢測出沙門菌、志賀菌。錯(cuò)誤報(bào)告:未見到致病菌4.尿培養(yǎng)：可在24小時(shí)報(bào)告初始結(jié)果，包括菌落計(jì)數(shù)和可能細(xì)菌種類，如氧化酶陰性的革蘭陰性桿菌；金黃色葡萄球菌等。

5.痰培養(yǎng)：24小時(shí)初始報(bào)告，報(bào)告內(nèi)容包括痰標(biāo)本是否合格，優(yōu)勢細(xì)菌，金葡菌、銅綠假單孢菌等特征明顯細(xì)菌的鑒定結(jié)果。6.分泌物報(bào)告：24h初始報(bào)告，有無細(xì)菌生長；革蘭陽性或陰性細(xì)菌或特征明顯的細(xì)菌名稱；根據(jù)涂片結(jié)果推測致病菌。臨床微生物檢驗(yàn)常見問題及解決方法標(biāo)本合格率低—制定標(biāo)本采集、運(yùn)送、評估及處理手冊，并進(jìn)行宣傳培訓(xùn)等苛養(yǎng)菌分離率低—培養(yǎng)基質(zhì)量、培養(yǎng)環(huán)境及人員水平結(jié)果準(zhǔn)確性不高—操作規(guī)范化及檢驗(yàn)前、中、后質(zhì)量保證質(zhì)量控制中存在的問題—制度執(zhí)行細(xì)菌耐藥性監(jiān)測工作還不能適應(yīng)抗感染治療需要—快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)報(bào)告及藥敏試驗(yàn)結(jié)果使用CLSI標(biāo)準(zhǔn)不規(guī)范可能造成的錯(cuò)誤—依據(jù)CLSI選藥，結(jié)合本院用藥細(xì)菌檢驗(yàn)基礎(chǔ)知識不扎實(shí)可能出現(xiàn)的問題—人員基本功提高、學(xué)習(xí)、培訓(xùn)七、工作中常見的問題和解決方法常見報(bào)告結(jié)果與臨床期待結(jié)果不一致的情況臨床認(rèn)為有細(xì)菌感染而培養(yǎng)陰性藥敏結(jié)果與臨床治療不符培養(yǎng)的細(xì)菌認(rèn)為是污染菌結(jié)果耐藥而治療卻有效結(jié)果敏感而治療效果不佳有關(guān)細(xì)菌耐藥我們應(yīng)該知道什么？

天然耐藥的抗菌藥物（肯定無效）可選擇的抗菌藥物（可能有效）細(xì)菌藥敏試驗(yàn)可以提供哪些信念如何解讀細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果解讀藥敏結(jié)果注意事項(xiàng)藥敏試驗(yàn)是參照美國的CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)制定的細(xì)菌全自動分析儀的藥敏組合是固定的某些細(xì)菌對某些抗生素