線粒體功能課件

線粒體功能及其檢測

線粒體結(jié)構(gòu)外膜(outmembrane)膜孔蛋白（porin）、離子通道蛋白以及Bcl-2家族蛋白。由膜孔蛋白構(gòu)成的親水通道，允許分子量為5KD以下的分子通過，1KD以下的分子可自由通過。膜間隙(intermembranespace)

細(xì)胞色素C電壓依賴性陰離子通道(VDAC)、ADP/ATP轉(zhuǎn)換蛋白。線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔道(mitochondrialpermeabletransitionpore，MPTP)存在于內(nèi)外膜接觸點(diǎn)。凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosisinducingfactor，AIF)和Procaspase2、3、9及其他酶蛋白?；|(zhì)（matrix）三羧酸循環(huán)：除糖酵解在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行外，其他的生物氧化過程都在線粒體中進(jìn)行。催化三羧酸循環(huán)，脂肪酸和丙酮酸氧化的酶類均位于基質(zhì)中。線粒體基因組：基質(zhì)具有一套完整的轉(zhuǎn)錄和翻譯體系。包括線粒體DNA（mtDNA），70S型核糖體，tRNAs、rRNA、DNA聚合酶等。存儲鈣離子的致密顆粒。線粒體DNA線粒體基因組哺乳動物的線粒體基因DNA沒有內(nèi)含子，幾乎每一對核苷酸都參與一個(gè)基因的組成。線粒體基因組能夠單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及合成蛋白質(zhì)。僅有少數(shù)線粒體蛋白質(zhì)是由mtDNA編碼，大多數(shù)線粒體蛋白質(zhì)（90%）還是由核DNA編碼。線粒體功能能量供應(yīng)氧化應(yīng)激凋亡鈣儲池細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤發(fā)育等線粒體與能量供應(yīng)細(xì)胞有氧呼吸和供能的場所，供應(yīng)細(xì)胞生命活動95%的能量。線粒體的主要功能是把氧化各種底物產(chǎn)生的自由能轉(zhuǎn)化為可被細(xì)胞直接利用的形式－ATP。線粒體具有能量代謝與自由基代謝兩條途徑。①燃料分解（胞質(zhì)中）②乙酰CoA生成③三羧酸循環(huán)(線粒體基質(zhì))④電子傳遞和氧化磷酸化(內(nèi)膜上)生成ATP葡萄糖脂肪酸氨基酸線粒體是細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧的一個(gè)重要部位，消耗氧用于合成ATP的同時(shí)不可避免地產(chǎn)生活性氧。氧化應(yīng)激作用下，膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔道開放造成線粒體基質(zhì)內(nèi)的高滲透壓，使線粒體內(nèi)外H+梯度消失，呼吸鏈脫偶聯(lián)，能量產(chǎn)生中斷。還會由于水和溶質(zhì)的進(jìn)入使基質(zhì)腫脹并導(dǎo)致外膜破裂，通透性增高，釋放出包括細(xì)胞色素C在內(nèi)的各種活性蛋白。過多自由基的產(chǎn)生可導(dǎo)致mtDNA的損傷，氧化損傷是mtDNA突變的主要原因。線粒體本身也極易受氧化應(yīng)激的攻擊。活性氧在啟動和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程中扮演著重要的角色。活性氧的積累可以導(dǎo)致：線粒體膨大，線粒體內(nèi)膜非特異性孔道產(chǎn)生；細(xì)胞色素C從內(nèi)膜脫落并進(jìn)入到胞質(zhì)中；BAX表達(dá)，caspase活化等。這些都是啟動細(xì)胞凋亡的因素。線粒體與凋亡從線粒體釋放的細(xì)胞色素C與凋亡誘導(dǎo)因子、Procaspase9結(jié)合在一起形成“凋亡體”（Apoptosome），導(dǎo)致Caspase9和Caspase3的激活。內(nèi)膜Bcl-2家族蛋白調(diào)控紊亂。Caspases激活、胞漿Ca++水平升高、產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，直接或間接地引發(fā)膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔道持續(xù)開放。ROS－膜轉(zhuǎn)運(yùn)孔道持續(xù)開放－凋亡鈣儲池線粒體功能紊亂線粒體?。╬rimarygeneticdefects）線粒體病理性損傷mtDNA突變(點(diǎn)突變、缺失、插入）導(dǎo)致線粒體功能缺陷。如線粒體肌病和腦肌病、線粒體眼病、老年性癡呆、帕金森病、糖尿病等。mtDNA突變隨著年齡累積。mtDNA突變呼吸鏈復(fù)合體I～I(xiàn)V活性下降A(chǔ)TP合成減少氧自由基產(chǎn)生增多鈣穩(wěn)態(tài)失衡脂質(zhì)氧化增強(qiáng)線粒體功能變化II型糖尿病胰島β細(xì)胞線粒體參與胰島素分泌、胰島素抵抗的形成。線粒體是高血糖時(shí)細(xì)胞ROS的重要來源。線粒體氧自由基增多與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。線粒體本身受氧化應(yīng)激攻擊，導(dǎo)致mtDNA合成減少、發(fā)生突變。Nitrotyrosinelevel(硝基酪氨酸,markerofoxidativestress)complexIandcomplexVATP/ADPratioUncouplingprotein-2(UCP-2)expressionmembranepotentialM.Anelloetal.Functionalandmorphologicalalterationsofmitochondriainpancreaticbetacellsfromtype2diabeticpatients.Diabetologia,(2005)48:282–2897cases,clinicaldiabeteswas5.6±0.6years胰島組織:8-羥基脫氧鳥嘌呤

(8-OHdG，kidneyandurine)MitochondrialDNADeletionCOXI/COXIV(mtDNA/nDNA)MaikoKakimoto,ToyoshiInoguchi,ToshiyoSonta.Accumulationof8-Hydroxy-2’-DeoxyguanosineandMitochondrialDNADeletioninKidneyofDiabeticRats.Diabetes51:1588–1595,2002STZrats,觀察時(shí)間：4，8周腎組織:NADHdehydrogenase(complexI)cytochrome-coxidase(complexIV)COXImtDNAlevelsmtDNAdeletionDirkLebrecht1,BernhardSetzer1,RolfRohrbach,etal.MitochondrialDNAanditsrespiratorychainproductsaredefectiveindoxorubicinnephrosis.NephrolDialTransplant,2004,19:329–336doxorubicinnephrosisrats腎組織：ATP膜轉(zhuǎn)運(yùn)通道開放程度cytochromeccaspase3Ca++PerazaMA,etal.Morphologicalandfunctionalalterationsinhumanproximaltubularcelllineinducedbylowlevelinorganicarsenic:evidencefortargetingofmitochondriaandinitiatedapoptosis.JApplToxicol.2006,26(4):356-67體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能檢測enzymeactivityassays(分光光度法)

NADH(complexI),succinatedehydrogenase(complexII)細(xì)胞色素c還原酶(complexIII)

COX(complexIV)ATP（luciferin/luciferase發(fā)光法，核磁共振法）呼吸控制率(ATP合成功能，氧電極法)能量供應(yīng)氧化應(yīng)激8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG，ELISA法)ROS(分光光度法)glutathioneandcoenzymeQ(分光光度法,HPLC)細(xì)胞色素C含量（westernblot)caspase-9andcaspase-3(分光光度法)BCL-2(免疫組化，w