DB23T 3897-2024基于60Coγ輻射技術(shù)創(chuàng)制秸稈降解真菌種質(zhì)資源篩選鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.01CCSB0523IDB23/T3897—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院、哈爾濱學(xué)院、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)本文件主要起草人：胡小梅、李鳳蘭、董士嘉、李孝忠、王浩、谷春濤、高愛麗、孫以新、馮旭、高云飛、虞琦、賀付蒙、田苗。1DB23/T3897—2024基于60Coγ輻射技術(shù)創(chuàng)制秸稈降解真菌種質(zhì)資源篩選鑒定技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)界定了基于60Coγ輻射技術(shù)創(chuàng)制秸稈降解真菌種質(zhì)資源篩選鑒定技術(shù)的術(shù)語和定義，規(guī)定了秸稈降解真菌創(chuàng)制、突變菌株篩選鑒定、秸稈降解菌株保藏和檔案管理。本文件適用于60Coγ輻射誘變創(chuàng)制秸稈降解真菌種質(zhì)資源的篩選與鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB10252γ輻照裝置的輻射防護(hù)與安全規(guī)范GB/T17568γ輻照裝置設(shè)計(jì)建造和使用規(guī)范GB/T23874飼料添加劑木聚糖酶活力的測定分光光度法HJ710.11-2014生物多樣性觀測技術(shù)導(dǎo)則大型真菌NY/T3494農(nóng)業(yè)生物質(zhì)原料纖維素、半纖維素、木質(zhì)素測定SN/T2632微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1秸稈降解真菌能夠?qū)⒆魑锝斩挿纸?、腐化的一類產(chǎn)孢絲狀真菌。4秸稈降解真菌創(chuàng)制4.1菌種來源從自然環(huán)境中分離的具有降解秸稈能力的真菌，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?.2培養(yǎng)方法4.2.1培養(yǎng)基4.2.1.1馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基馬鈴薯浸出粉12g，葡萄糖20g，瓊脂15g，去離子水定容至1000mL，121℃滅菌20min。4.2.1.2高粱粒培養(yǎng)基高粱粒5g，去離子水5mL，121℃滅菌20min。2DB23/T3897—20244.2.1.3產(chǎn)酶培養(yǎng)基（MA）十二水磷酸氫二鈉17.907g，硫酸銨1.4g，磷酸二氫鉀2.0g，七水硫酸鎂0.60g，氯化鈣0.60g，尿素0.3g，失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚0.5mL，蛋白胨2.0g，微量元素溶液1mL，pH5.5，去離子水定容至1000mL。4.2.1.4微量元素溶液七水硫酸亞鐵0.5g，一水硫酸錳0.16g，七水硫酸鋅0.14g，六水合二氯化鈷0.2g，去離子水定容至100mL，0.22μm無菌濾膜過濾除菌。4.2.2菌種活化將凍存的菌種解凍后在PDA培養(yǎng)基上采用四區(qū)劃線方法進(jìn)行活化，長出單菌落后，備用。4.2.3孢子懸浮液制備將菌種活化后長出的單菌落接種至高粱粒培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，菌絲長滿平板48h后，將產(chǎn)生的孢子用無菌0.9%（w/v）生理鹽水洗脫并用四層無菌紗布過濾除去菌絲體，在6000rpm條件下離心20min收集沉淀。將沉淀再用適量生理鹽水重懸后，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度，并用生理鹽水將孢子濃度稀釋至1×106CFU/mL～1×108CFU/mL。4.3輻射處理4.3.1輻射劑量選擇金屬元素鈷源（60Co）的γ射線進(jìn)行輻射誘變處理，真菌孢子懸浮液的60Coγ輻射劑量以2000Gy為宜。4.3.2輻射裝置60Coγ輻射裝置應(yīng)符合GB/T17568的規(guī)定。4.3.3輻射方法輻射方法應(yīng)符合GB10252的規(guī)定。5突變菌株篩選鑒定5.1菌株篩選5.1.1篩選指標(biāo)篩選指標(biāo)包括菌株致死率、形態(tài)指標(biāo)、纖維素酶和半纖維素酶活力、木質(zhì)素酶活力、和秸稈降解率。5.1.2致死率誘變結(jié)果以致死率表示，致死率按式（1）計(jì)算：3DB23/T3897—2024式中：LR—致死率；Cc—陰性對(duì)照PDA平板菌落數(shù)；CT—試驗(yàn)組PDA平板菌落數(shù)。5.1.3形態(tài)指標(biāo)篩選將輻射誘變后符合致死率≥85%的菌株孢子懸浮液稀釋100倍，取100μL稀釋孢子液涂布在PDA平板上。在28℃下培養(yǎng)至長出菌落，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并與誘變前的菌株進(jìn)行比較，獲得形態(tài)上具有差異的突變菌株。5.1.4纖維素酶和半纖維素酶活力測定5.1.4.1內(nèi)切葡聚糖酶活力取1%（w/v）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液1.5mL，加入0.5mL稀釋后的粗酶液，50℃水浴條件下孵育30min。采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）測定法，加入1.5mLDNS顯色劑。沸水浴5min終止反應(yīng)，在540nm波長處測定吸光度，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力，每分鐘水解CMC-Na產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量定義為1U。對(duì)照組中加入沸水浴30min滅活的粗酶液，其它條件均相同，按照式（2）計(jì)算酶活力。5.1.4.2外切葡聚糖酶活力取0.1%（w/v）對(duì)硝基苯酚纖維二糖苷（pNPC）溶液50μL，加入100μL稀釋后的粗酶液，50℃水浴條件下孵育30min。加入150μL10%Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在420nm波長下測定吸光度，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力，每分鐘水解pNPC產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量定義為1U。對(duì)照組中加入沸水浴30min滅活的粗酶液，其它條件均相同，按照式（2）計(jì)算酶活力。5.1.4.3β-葡萄糖苷酶活力取0.5%（w/v）水楊苷溶液，加入0.5mL稀釋后的粗酶液，在50℃水浴條件下孵育30min。采用DNS測定法，加入1.5mLDNS顯色劑，沸水浴5min終止反應(yīng)，在540nm波長處測定吸光度，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活力，每分鐘水解水楊苷產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量定義為1U。對(duì)照組中加入沸水浴30min滅活的粗酶液，其它條件均相同，按照式（2）計(jì)算酶活力。5.1.4.4木聚糖酶活力按照GB/T23874的規(guī)定執(zhí)行。式中：U—相應(yīng)纖維素或半纖維素酶活力；m—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出相應(yīng)葡萄糖或?qū)ο趸椒淤|(zhì)量（mg）；M—葡萄糖或?qū)ο趸椒幽栙|(zhì)量（g/molt—酶解反應(yīng)時(shí)間（min）；1000—轉(zhuǎn)化因子，1mmol=1000μmol；4DB23/T3897—2024n—樣品總稀釋倍數(shù)。5.1.5木質(zhì)素酶活力測定5.1.5.1漆酶活力取3.3mL100mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5），加入0.5mL0.5mmol/LABTS（2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）溶液，加入200μL粗酶液，混勻。在30℃水浴條件下孵育3min，在420nm（3420=36000L·mol-1·cm-1）處測定吸光度變化，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每分鐘氧化1μmolABTS所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U），按照式（3）計(jì)算酶活力。5.1.5.2錳過氧化物酶活力取2.5mL50mmol/L琥珀酸-琥珀酸鈉緩沖液（pH4.5），加入0.4mL1.6mmol/LMnSO4溶液，加入1mL粗酶液，加入100μL10mmol/LH2O2溶液，混勻。在37℃水浴條件下孵育3min，在240nm（3240=6500L·mol-1·cm-1）處測定吸光度變化，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每分鐘氧化1μmolMn2+轉(zhuǎn)化為Mn3+所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U），按照式（3）計(jì)算酶活力。5.1.5.3木質(zhì)素過氧化物酶活力取2.5mL250mmol/L酒石酸-酒石酸鈉緩沖液（pH3.0加入0.4mL10mmol/L藜蘆醇（VA加入1mL粗酶液，加入100μL10mmol/LH2O2溶液，混勻。在30℃水浴條件下孵育3min，在310nm（3310=9300L·mol-1·cm-1）處測定吸光度變化，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每分鐘氧化1μmol的藜蘆醇所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U），按照式（3）計(jì)算酶活力。酶酶式中：U—相應(yīng)木質(zhì)素酶活力；△A—t時(shí)間內(nèi)吸光度變化值；l—比色皿厚度（cmt—反應(yīng)時(shí)間（min）；V總—反應(yīng)體系體積（mL）；V酶—反應(yīng)中酶液的體積（mL）；5.1.6秸稈降解率選擇纖維素酶活力、半纖維素酶活力和木質(zhì)素酶活力高（如占前50%）的突變菌株進(jìn)行秸稈降解率測定。將選取的突變菌株用液體PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.8，離心去上清，用蒸餾水將菌體重懸獲得菌懸液。取烘干的2g秸稈放入50mL經(jīng)0.22μm的濾膜進(jìn)行過濾的土壤懸浮液中，然后加入上述調(diào)整好的菌液。在15℃條件下培養(yǎng)2周，然后將降解后的秸稈取出放置在80℃中48h烘干。參照NY/T3494，測定秸稈中木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的含量。以第0d為對(duì)照組，均進(jìn)行三次重復(fù)。木質(zhì)素、纖維素、半纖維素的降解率分別按式（456）計(jì)算：5DB23/T3897—2024式中：LD—木質(zhì)素降解率；CD—纖維素降解率；HD—半纖維素降解率；M1—對(duì)照組秸稈中木質(zhì)纖維素含量；M2—處理