T-ZNZ 286-2024 土壤中抗生素抗性基因檢測(cè) 高通量熒光定量PCR 法

T/ZNZHigh-throughputquantitativePCRmethodfordetection浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學(xué)會(huì)發(fā)布IT/ZNZ286—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全學(xué)會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所、武漢工程大學(xué)。本文件主要起草人：蘇建強(qiáng)、李歡琴、安新麗、李雅穎、姚槐應(yīng)。1T/ZNZ286—2024土壤中抗生素抗性基因檢測(cè)高通量熒光定量PCR法本文件規(guī)定了土壤中抗生素抗性基因檢測(cè)高通量熒光定量PCR法的方法。本文件適用于土壤中抗生素抗性基因的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T41689土壤質(zhì)量土壤樣品直接提取DNA的方法NY/T1121.1土壤檢測(cè)第1部分：土壤樣品的采集、處理和貯存3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1抗生素抗性基因antibioticresistancegenes存在于細(xì)菌或其他微生物基因組中的基因，具有降低抗生素效果或完全失效的能力。3.2高通量熒光定量PCRhigh-throughputquantitativepolymerasechainreaction,HT-qPCR基于微孔芯片進(jìn)行高通量、納升級(jí)別的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。3.3可移動(dòng)遺傳元件mobilegeneticelements在基因組中可擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移的遺傳元件，如質(zhì)粒、噬菌體、整合子、插入序列和整合接合元件等。3.4Ct值cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。3.5基因拷貝數(shù)genecopynumber2T/ZNZ286—2024某一種基因或某一段特定的DNA序列在單倍體基因組中出現(xiàn)的數(shù)目。4原理基于納升級(jí)微孔芯片，在PCR反應(yīng)體系中，加入特異性引物，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，核酸染料不斷與PCR產(chǎn)物結(jié)合，發(fā)出熒光信號(hào)，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化來監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。在PCR擴(kuò)增結(jié)束后，增加溶解曲線的步驟，監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性情況?；虻腃t值與基因起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系。因此，收集未知樣品微生物并提取其DNA，經(jīng)PCR反應(yīng)獲得該樣品的Ct值，即可根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒內(nèi)標(biāo)法計(jì)算出該樣品的相應(yīng)抗生素抗性基因的起始拷貝數(shù)。5設(shè)備與材料5.1設(shè)備5.1.1高通量熒光定量PCR儀。5.1.2冷凍離心機(jī)。5.1.3渦旋儀。5.1.4核酸定量?jī)x。5.1.5熒光成像系統(tǒng)。5.1.6多樣品納米分配器。5.2材料5.2.1高通量熒光定量芯片。5.2.2384方孔板。5.2.3封板膜。5.2.4平底96孔板。5.2.5SYBRGreenIMaster。5.2.6牛血清白蛋白溶液：50mg/mL。5.2.7超純水。5.2.8加樣槽。5.2.9抗生素抗性基因引物。5.2.10次氯酸鈉溶液：有效氯終濃度0.2%。5.2.11TE緩沖液：pH8.0。5.2.12雙鏈DNA超敏檢測(cè)試劑盒。5.2.13DNA純化試劑盒。5.2.14DNA連接試劑盒。5.2.15質(zhì)粒提取試劑盒。6測(cè)定步驟6.1土壤樣品采集按照NY/T1121.1采集土壤樣品。3T/ZNZ286—20246.2DNA提取按GB/T41689提取樣品中的DNA。樣品DNA濃度范圍應(yīng)為20ng/μL~40ng/μL，對(duì)濃度大于40ng/μL的樣品應(yīng)用超純水進(jìn)行稀釋。6.3質(zhì)粒樣品的制備6.3.1PCR擴(kuò)增對(duì)DNA樣品進(jìn)行抗生素抗性基因（見附錄A）的PCR擴(kuò)增。6.3.2DNA純化用凝膠電泳對(duì)PCR反應(yīng)物進(jìn)行分離，應(yīng)用熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增的DNA片段。應(yīng)用切膠刀精確切割出目標(biāo)DNA片段。應(yīng)用DNA純化試劑盒，對(duì)回收的DNA片段進(jìn)行純化處理。6.3.3連接載體應(yīng)用DNA連接試劑盒，將純化后的DNA片段連接到PMDTM19-T載體上進(jìn)行連接反應(yīng)。6.3.4轉(zhuǎn)化培養(yǎng)和Blast比對(duì)將連接好的DNA載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，在含有氨芐西林的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從培養(yǎng)皿中挑選單個(gè)菌落進(jìn)行測(cè)序，獲得DNA序列信息。應(yīng)用Blast軟件將測(cè)序結(jié)果與參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)目標(biāo)基因的存在和序列的正確性。6.3.5質(zhì)粒提取應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒，從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA。6.3.6質(zhì)粒濃度測(cè)定宜用雙鏈DNA超敏檢測(cè)試劑盒測(cè)定提取的質(zhì)粒DNA的濃度。6.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行梯度稀釋，獲得不同拷貝數(shù)（范圍宜為102~108copies/μL）的標(biāo)準(zhǔn)液。使用這些標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行PCR反應(yīng)，以基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Ct值作為縱坐標(biāo)作圖，并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)需設(shè)置至少5個(gè)濃度點(diǎn)，每個(gè)濃度應(yīng)至少做3個(gè)平行重復(fù)。6.5實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)立實(shí)驗(yàn)設(shè)立以下對(duì)照：——陽(yáng)性對(duì)照，為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA；——陰性對(duì)照，相應(yīng)的無抗生素抗性基因土壤樣品DNA；——空白對(duì)照，設(shè)置兩個(gè)空白對(duì)照，一是提取DNA時(shí)設(shè)置的提取空白對(duì)照（以超純水代替樣品二是PCR反應(yīng)的空白對(duì)照（以超純水代替DNA模板）。6.6高通量熒光定量PCR反應(yīng)體系的制備6.6.1抗生素抗性基因引物和DNA樣品的分配4T/ZNZ286—2024使用多樣品納米分配器，按照附錄A描述，將抗生素抗性基因引物、DNA樣品和陽(yáng)性克隆質(zhì)粒分配到納米芯片上。6.6.2PCR反應(yīng)液I的制備將911μLSYBRGreenIMaster和547μL無菌水混合形成PCR反應(yīng)液I。6.6.3引物的加載在無酶孔板上，為每個(gè)孔加載10.9μLPCR反應(yīng)液I和2.7μL抗生素抗性基因引物，共計(jì)120孔。將引物從孔板分樣到納米芯片上。6.6.4PCR反應(yīng)液II的制備將493μLSYBRGreenIMaster、9μL滅菌的50mg/mL牛血清白蛋白溶液和287μL無菌水混合，制備成PCR反應(yīng)液II。6.6.5DNA樣品的加載在無酶孔板上，為每個(gè)孔加載15.2μLPCR反應(yīng)液II和3.8μLDNA樣品，共計(jì)42孔。每個(gè)樣品應(yīng)進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。將DNA樣品從孔板分樣到已加載引物的芯片上。6.6.6離心和備用引物和DNA樣品分配完成后，宜用離心機(jī)將芯片在3200rpm下離心5min。離心完成后，應(yīng)在芯片上貼膜以備后續(xù)使用。6.7高通量熒光定量PCR程序6.7.1PCR擴(kuò)增程序初始預(yù)變性步驟：95℃,10min。循環(huán)步驟：95℃變性30s，60℃退火延伸30s，共40個(gè)循環(huán)。6.7.2熔解曲線分析程序結(jié)束后自動(dòng)升溫，進(jìn)行熔解曲線分析，檢測(cè)PCR產(chǎn)物的特異性。6.8高通量定量?jī)x器運(yùn)行操作步驟6.8.1多樣品納米分配器操作步驟6.8.1.1儀器檢查和準(zhǔn)備氣瓶氣體含量應(yīng)大于0.3mpa，曝氣水瓶應(yīng)裝滿超純水。更換次氯酸鈉溶液（有效氯終濃度0.2%）。保持40psi壓力曝氣30min。6.8.1.2儀器噴樣將384引物板和樣品板噴到高通量熒光定量芯片上。離心機(jī)離心備用。6.8.2熱循環(huán)儀操作步驟6.8.2.1儀器檢查和準(zhǔn)備氣瓶總壓力應(yīng)不低于100psi，運(yùn)行時(shí)壓力維持在120psi。5T/ZNZ286—20246.8.2.2運(yùn)行儀器設(shè)置PCR程序和放置芯片。監(jiān)控壓力狀態(tài)和熒光信號(hào)。6.9結(jié)果計(jì)算與表述6.9.1質(zhì)量控制下述指標(biāo)有一項(xiàng)不符合者，需重新進(jìn)行高通量熒光定量PCR擴(kuò)增：——擴(kuò)增效率應(yīng)在80%~120%之間，且陰性對(duì)照均無擴(kuò)增?！股乜剐曰?個(gè)技術(shù)重復(fù)中，至少有2個(gè)為陽(yáng)性才判定為有效擴(kuò)增?！獦?biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒最低稀釋濃度宜為2copies/ngDNA，高通量定量過程中，根據(jù)質(zhì)粒最低濃度測(cè)定的Ct值作為檢測(cè)的最低檢測(cè)限，最低定量濃度宜為20copies/ngDNA。6.9.2定性定性分析的結(jié)果將按以下方式標(biāo)示：若PCR反應(yīng)未能檢測(cè)到目標(biāo)抗生素抗性基因，則結(jié)果記為“未檢出”；若PCR反應(yīng)能夠檢測(cè)到目標(biāo)基因，并且滿足設(shè)定的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，則結(jié)果記為“檢出”。6.9.3定量按照創(chuàng)建好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒外標(biāo)法計(jì)算土壤樣品中的相應(yīng)抗生素抗性基因拷貝數(shù)，單位為拷貝每納克（copies/ng）。按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算：Ct?ba(1)式中：C——抗生素抗性基因拷貝數(shù)，單位為拷貝每納克（copies/nga——標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中的斜率；b——標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中y軸截距；Ct——每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。6T/ZNZ286—2024A土壤中抗生素抗性基因信息土壤中抗生素抗性基因的種類、引物序列和類別見表A.1。表A.1土壤中抗生素抗性基因的種類、引物序列和抗生素類別ac(3)IIac(3)VIac(6')IadAadE1ACCTCTTTGGACACTTCCCadE2ant(2'')Iaph(2'')Igaph(3')I1AATCCAAGAGCAATAAGGGaph(3')I2AGAGAGGATGCATCGGAGGaph(3')I3aph(3')IIIaph(3')VIIaph(6)I1aph(6)I2rmtFrmtGbacAblaZCMYCTXMCTXM15/577T/ZNZ286—2024CTXM2CTXM24/27GES11IMP4KPC2/4/6mecAACCTCTGCTCAACAAGTTCmecR1NDM5/6OXA1/4OXA10OXA72penAROB1SHVSHV12TEM156TEM169/206VEB3VIM1VIM2cat1TTGGACAGAATCAAATGCTACTGTGTTTTCAGGTATCGGcat2ACCAATACCTGAAAACACAGTTcat3ACTGGTTACAATAGCGACGcat4catA1catA2catA3catB8T/ZNZ286—2024cmlAfloRmcr1fosBTGCCAATATTTAAATTCGCfusBermB1ermB2ermCTGCGTAATCACTGTTTTTAGermTAGATTGGTTCAGGGAAAGGTA