KTA2030-CN-EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）

EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）Cat#:KTA2030 Size:100T/500T EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光） 貨號：KTA2030 批號：見產(chǎn)品標(biāo)簽 適用樣本：貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、活體動物 保質(zhì)期：-20℃，避光保存12個月原理細(xì)胞增殖的檢測對于評估細(xì)胞健康，確定遺傳毒性或評估抗癌藥物至關(guān)重要。目前直接測量DNA合成是最準(zhǔn)確的方法，在復(fù)制過程中將核苷類似物（例如[3H]胸苷或5-溴-2'-脫氧尿苷）加入到細(xì)胞中，然后通過放射自顯影或使用BrdU抗體來進(jìn)行檢測。EdU法細(xì)胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）是一種替代BrdU的新型檢測方法。EdU（5-乙炔基-2′-脫氧尿苷）是胸腺嘧啶核苷的核苷類似物，可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。與BrdU方法相比EdU-Click檢測不是基于抗體，因此不需要通過DNA變性（變性通常使用氯化氫、加熱或脫氧核糖核酸酶消化）來檢測加入的核苷。檢測基于Click反應(yīng)，疊氮化物和炔烴之間由銅催化的共價反應(yīng)，整個反應(yīng)30min內(nèi)可完成。包裝清單試劑盒組分 規(guī)格 儲存條件 100T 500T EdU(10mM) 100μL 500μL -20℃BSAWashSolution(5×) 12mL 60mL -20℃AbFluor488azide 20μL 100μL -20℃，避光保存Reactionbuffer(10×) 1mL 5mL 4℃CopperReagent 0.4mL 2mL 4℃ReducingAgent 100mg 5×100mg -20℃Hoechst33342(1000×) 12μL 60μL -20℃，避光保存Hydroxyurea 10μL 50μL 4℃，避光保存自備耗材·低溫離心機(jī)·可調(diào)節(jié)式移液槍及槍頭·去離子水·固定液（含3.7%甲醛的PBS）·通透劑（含0.5%TritonX-100的PBS）試劑制備EdU(10mM)：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃保存。BSAWashSolution(1×)：向BSAWashSolution（5×）中添加磷酸鹽緩沖液（PBS），將5×母液稀釋成1×工作液（終濃度為3%BSA），并混勻。使用后分裝并保存在-20℃，該溶液可穩(wěn)定保存6個月。AbFluor488Azide：即用型；使用前，平衡到室溫；-20℃避光保存。ReactionBuffer(10×)：即用型，使用前，平衡到室溫；4℃保存。CopperReagent：即用型；使用前，平衡到室溫；4℃保存。ReducingAgent(10×)的配制：向ReducingAgent中添加去離子水配制終濃度為100mg/mL的ReducingAgent（10×）并混合直至化合物完全溶解。使用后分裝-20℃保存，該溶液可穩(wěn)定保存6個月。若溶液變成棕色，說明組分已經(jīng)降解，不建議繼續(xù)使用。Hoechst33342(1×)：臨用前配制，用PBS按1：1,000的比例配成1×Hoechst33342工作液；分裝，-20℃避光保存。Hydroxyurea：DNA合成抑制劑；即用型；使用前，平衡到室溫；4℃避光保存。實驗步驟A.EdU標(biāo)記培養(yǎng)細(xì)胞本實驗以96孔板培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞為例。懸浮細(xì)胞可在孵育EdU后進(jìn)行涂片處理（將適量細(xì)胞滴加到載玻片上，酒精燈烘烤至干燥），涂片后從固定開始與貼壁細(xì)胞采用相同的染色步驟。1.孔板內(nèi)放入適配蓋玻片，接種適量細(xì)胞，使其生長至所需密度后處理細(xì)胞；2.可選步驟：陰性對照的設(shè)置：EdU孵育前加入DNA合成抑制劑Hydroxyurea，按1:1,000的比例直接加入到陰性對照孔內(nèi)，混勻孵育0.5h；3.用10mMEdU溶液在培養(yǎng)基中制備2×EdU工作溶液（20μM）。推薦的EdU終濃度為10μM，用細(xì)胞培養(yǎng)液1:500稀釋10mMEdU即可得到2×EdU工作溶液（20μM）；4.將預(yù)熱（37℃）的2×EdU溶液等體積添加到含有試驗細(xì)胞的培養(yǎng)基中，使96孔板中的EdU終濃度變?yōu)?×；注意：建議不要更換所有培養(yǎng)基，因為這會影響細(xì)胞增殖速率；建議EdU起始濃度是10μM。5.在最適合的條件下孵育細(xì)胞2h（根據(jù)細(xì)胞擴(kuò)增時間確定，一般腫瘤細(xì)胞的孵育時間為2h）；6.孵育后除去培養(yǎng)基，并向每個孔中加入0.1mL固定液（含3.7%甲醛的PBS），室溫下孵育15min；7.除去固定液，用0.1mLBSAWashSolution(1×)浸洗孔中細(xì)胞5min，重復(fù)3次；8.除去洗滌液，向每個孔中加入0.1mL通透劑（含0.5%TritonX-100的PBS），室溫下孵育15min；9.除去通透劑，用0.1mLBSAWashSolution(1×)浸洗孔中細(xì)胞5min，重復(fù)2次；10.轉(zhuǎn)步驟C。B.EdU標(biāo)記活體動物本實驗以6周齡小鼠為例，其它動物體內(nèi)EdU的標(biāo)記請參考相關(guān)文獻(xiàn)。1.對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進(jìn)行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進(jìn)行測試。如果之前使用過BrdU進(jìn)行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU需單獨購買；2.可選步驟：陰性對照的設(shè)置：EdU處理時加入DNA合成抑制劑Hydroxyurea，按1000mg/kg的濃度用EdU溶液進(jìn)行配制。Hydroxyurea需單獨購買；3.24小時后或根據(jù)特定實驗確定的適當(dāng)時間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標(biāo)記的時間也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)自行調(diào)整；4.對于冰凍切片：(1)加入適量固定液（含3.7%甲醛的PBS），室溫下孵育15min；(2)除去固定液，用適量BSAWashSolution(1×)浸洗5min，重復(fù)3次；(3)除去洗滌液，加入適量通透劑（含0.5%TritonX-100的PBS），室溫孵育15min；(4)除去通透劑，用適量BSAWashSolution(1×)浸洗5min，重復(fù)2次；(5)抗原修復(fù)(選做)：如果同時需要進(jìn)行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進(jìn)行抗原修復(fù)，可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液，或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理；(6)轉(zhuǎn)步驟C。5.對于石蠟切片：(1)脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10min，換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10min。組織復(fù)性：在無水乙醇中洗滌5min，換新的無水乙醇洗滌3min；然后依次在95%、85%、75%和50%乙醇中洗滌3min；最后在PBS中洗滌5min。(2)抗原修復(fù)(選做)：如果同時需要進(jìn)行目的蛋白的免疫組化染色，并有必要進(jìn)行抗原修復(fù)，可以使用適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液，或者自行配制的適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理；注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進(jìn)行抗原修復(fù)，必須反復(fù)洗滌干凈，否則殘留的酶會嚴(yán)重干擾后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。(3)轉(zhuǎn)步驟C。C.EdU檢測注意：在該步驟中，每孔使用100μL反應(yīng)混合物。對于其它孔板或切片，反應(yīng)混合物體積可根據(jù)實際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，但必須按比例加入反應(yīng)組分。1.根據(jù)下表制備Click-iT反應(yīng)混合物；注意：要按表中列出的順序添加成分，否則反應(yīng)將無法得到最佳效果。配置好的Click-iT反應(yīng)混合物必須在15min內(nèi)使用。組分 體積DeionizedWater 758μLReactionBuffer（10×） 100μLCopperReagent 40μLAbFluor488Azide 2μLReducingAgent（10×） 100μLTotalVolume 1mL2.向每個樣品中加入100μLClick-iT反應(yīng)混合物，室溫下避光孵育30min；3.除去反應(yīng)混合物，用0.1mLBSAWashSolution(1×)浸洗孔中細(xì)胞5min，除去洗滌液；4.可選步驟：進(jìn)行核染色（1×Hoechst33342）或抗體標(biāo)記；重要提示：在孵育過程中一定要避光。如不需要其它染色，孵育后請直接進(jìn)行成像和分析。5.用熒光顯微鏡（Ex/Em=501/525nm）分析樣品中標(biāo)記的DNA，用Ex/Em=360/460nm檢測細(xì)胞核。注意事項1.為避免交叉污染，在加入不同樣本和不同試劑時都需更換吸頭。2.實驗開始前確保所有的組分及設(shè)備處于合適的溫度。3.熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。4.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。草莓時刻：除了DNA結(jié)構(gòu)變化檢測細(xì)胞增殖之外，多數(shù)情況下通過檢測細(xì)胞質(zhì)中的NADH的含量來評估細(xì)胞的增殖情況。DNA的結(jié)構(gòu)變化是細(xì)胞增殖的早期事件（KTA2030），而DNA結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致NADH的含量也隨之發(fā)生改變（BMU106-CN）。此外，要全面的檢測細(xì)胞狀態(tài)，還要從細(xì)胞凋亡（KTA2010、KTA0002）與細(xì)胞衰老（KTA3030）的角度進(jìn)行分析。掃描右側(cè)二維碼，關(guān)注Abbkine公眾號，了解更多Abbkine產(chǎn)品信息。 FAQ1.該試劑盒是否可以染間充質(zhì)干細(xì)胞，再進(jìn)行活體移植？ A:建議先在體外培養(yǎng)觀察染色效果，再進(jìn)行移植實驗，并在一周內(nèi)進(jìn)行顯色和觀察。2.該試劑盒可以做組織染色嗎？ A:EdU適用于細(xì)胞增殖的檢測，如客戶想進(jìn)行組織染色，建議用增殖抗體PCNA（貨號ABP0112、A01040、ABP59848）及其直標(biāo)抗體進(jìn)行IHC實驗檢測。3.該試劑盒是否可以用免疫熒光（