新陳代謝 核酸2次學習課件

第四節(jié)DNA與基因組織DNATranscription

RNA（mRNA、tRNA、rRNA等）TranslationProtein基因基因是一段含有特定遺傳信息的核苷酸序列,是遺傳物質(zhì)的最小功能單位。結(jié)構(gòu)基因調(diào)節(jié)基因基因組一、DNA與基因●結(jié)構(gòu)基因（structuralgene）：有實際表達產(chǎn)物,

為特定的RNA和多肽編碼的基因●調(diào)節(jié)基因或調(diào)節(jié)順序（regulatorysequence）：

DNA分子中只起調(diào)節(jié)功能的非轉(zhuǎn)錄和非翻譯序列●基因組(genome):某生物體所含全部基因的總和●基因組學（genomics）：研究生物體的基因組的大小、組織和基因組成的學科★可見：基因是實體,其物質(zhì)基礎是DNA(或RNA);基因是遺傳信息傳遞和性狀分化發(fā)育的依據(jù)；基因(類型)是可分的。二、原核生物基因組的特點1.除調(diào)節(jié)序列和信號序列外,DNA的大部分為結(jié)構(gòu)基因，每個基因出現(xiàn)頻率低。2.功能相關(guān)的基因常串聯(lián)在一起,并轉(zhuǎn)錄在同一mRNA中（多順反子）。（多順反子為多條肽鏈編碼的mRNA－－遺傳學將編碼一個多肽鏈的遺傳單位稱為順反子cistran）3.有基因重疊現(xiàn)象。ABCDEFG三、真核生物基因組的特點1.DNA分子中有重復序列單拷貝序列：在整個DNA中只出現(xiàn)一次或少數(shù)幾次，主要為編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。中度重復序列：在DNA中可重復幾十次到幾千次。高度重復序列：或稱簡單序列DNA，可重復幾百萬次高度重復序列一般富含A-T對或G-C對。富含A-T對的在密度梯度離心時在離心管中形成的區(qū)帶比主體DNA更靠近管口，富含G-C對的更靠近管底，故稱為衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）富含A-T富含G-C主體DNA衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）重復順序：由2-10bp組成重復單位，重復單位成串排列而成由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開，因而稱為衛(wèi)星DNA（或隨體DNA）在人細胞組中，衛(wèi)星DNA約占5-6％，按其浮力密度不同，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四種；果蠅的衛(wèi)星DNA順序已經(jīng)清楚，可分為三類，都是由7bp組成的高度重復順序：

衛(wèi)星Ⅰ為：5’ACAACTT3’

衛(wèi)星Ⅱ為：5’ACAAATT3’蟹的衛(wèi)星DNA為只有AT兩個堿基的重復順序組成。2.有斷裂基因（splitgene）由于基因中內(nèi)含子的存在內(nèi)含子（intron)：基因中不為多肽編碼，不在mRNA中出現(xiàn)的居間序列。外顯子（exons）：為多肽編碼的基因片段。內(nèi)含子(intron)指大多數(shù)真核結(jié)構(gòu)基因中的居間序列(interveningsequence)或不編碼序列。它們可以轉(zhuǎn)錄，但在基因轉(zhuǎn)錄后，由這些居間序列轉(zhuǎn)錄的部分經(jīng)加工被從初級轉(zhuǎn)錄本中準確除去，才產(chǎn)生有功能的RNA。內(nèi)含子常比外顯子長，且占基因的更大比例。真核基因所含內(nèi)含子的數(shù)目、位置和長度不盡相同，如雞卵清蛋白基因的外顯子被7個內(nèi)含子隔開(圖)，雞卵伴清蛋白基因有17個內(nèi)含子，α-珠蛋白基因有2個內(nèi)含子，膠原蛋白基因含50多個內(nèi)含子等。mRNA1872bpAFtranscription例外：組蛋白基因(histongene)和干擾素基因(interferongene)無內(nèi)含子。

BCDEG7700bpAF內(nèi)含子的功能－－－－

●可能含有調(diào)節(jié)信號，調(diào)控基因的表達；

●將基因分割成“可交換的單位”，有利于重新組合出新的基因。第五節(jié)核糖核酸（RNA）——RNA分子是含短的不完全的螺旋區(qū)的多核苷酸鏈。RNA的二級結(jié)構(gòu)一、RNA的組成和結(jié)構(gòu)特點（一）RNA分子主要堿基：

A、U、G、C（二）連接方式：3′,5′－磷酸二酯鍵（三）單鏈:自身回折,局部雙螺旋(與A-型DNA

結(jié)構(gòu)相似)

（有些病毒為雙鏈RNA）（四）RNA的高級結(jié)構(gòu)特點1.RNA是單鏈分子，因此，在RNA分子中并不遵守堿基種類的數(shù)量比例關(guān)系，即分子中的嘌呤堿基總數(shù)不一定等于嘧啶堿基總數(shù)。2.RNA分子中，部分區(qū)域也能形成雙螺旋結(jié)構(gòu),

不能形成雙螺旋的部分則形成突環(huán)。這種結(jié)構(gòu)可以形象地稱為“發(fā)夾型”結(jié)構(gòu)。3.在RNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基的配對情況不象DNA中嚴格。G除了可以和C配對外，也可以和U配對。G-U配對形成的氫鍵較弱。

不同類型的RNA,其二級結(jié)構(gòu)有明顯差異。4.tRNA中除了常見的堿基外,還存在一些稀有堿基，這類堿基大部分位于突環(huán)部分。5.除tRNA外，幾乎全部細胞中的RNA都與蛋白質(zhì)形成核蛋白復合物（四級結(jié)構(gòu)）。G-U配對(2個氫鍵)動物細胞內(nèi)主要RNA的種類與功能

細胞核和胞液線粒體功能核糖體RNArRNA

mt

rRNA

核蛋白體的組分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白質(zhì)合成模板轉(zhuǎn)運RNAtRNA

mt

tRNA

轉(zhuǎn)運氨基酸不均一核RNAhnRNAmRNA的前體小核RNAsnRNA

參與hnRNA的剪接、轉(zhuǎn)運小核仁RNAsnoRNA

rRNA的加工、修飾小胞質(zhì)RNAscRNA/7SL-RNA蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位、合成的信號識別體的組分二、RNA的類型與結(jié)構(gòu)（一）tRNA

（transferRNA）1.概況（1）含量：占細胞內(nèi)RNA總量的約15%。（2）種類：50~60種，有些真核生物可達100多種(運載同一氨基酸的幾種tRNA

稱為同工tRNA)。（3）分子量：23000～28000，4S（4）功能：在蛋白質(zhì)合成中，轉(zhuǎn)運氨基酸和識別密碼子；另外，在蛋白質(zhì)合成的起始、反轉(zhuǎn)錄合成DNA及其他代謝和基因表達調(diào)節(jié)中也起重要作用。2.一級結(jié)構(gòu)1965年Holley等測定了酵母丙氨酸t(yī)RNA一級結(jié)構(gòu)（1）組成：以76個核苷酸為標準，通常由73~93

個核苷酸組成。（2）修飾堿基（稀有堿基）：較多，可達堿基總數(shù)的10%~15％。（增加識別和疏水作用）（3）3′端皆為

CpCpAOH;5′端多為pG,

也有為pC

的。（4）有一些保守序列，與其特殊的結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)。3.tRNA的二級結(jié)構(gòu)——三葉草模型

tRNA的二級結(jié)構(gòu)都呈“三葉草”形狀，在結(jié)構(gòu)上具有某些共同之處,由氨基酸臂（受體臂）、二氫尿嘧啶環(huán)（DHU環(huán)）、反密碼子環(huán)、額外環(huán)（可變環(huán)）和胸苷-假尿苷-胞苷環(huán)（TC環(huán)）5部分組成。

除了氨基酸臂外，其余每個區(qū)均含有一個突環(huán)和一個臂。D臂酵母丙氨酸-tRNA

（Holley等1965年測定）TψC環(huán)氨基酸臂可變環(huán)D環(huán)反密碼環(huán)反密碼子臂D臂TψC臂酵母丙氨酸-tRNA

（Penswick于1975年修訂）

二氫尿嘧啶臂：D臂，3~4bp反密碼臂：5bpTψC臂：5bp四臂四環(huán)

二氫尿嘧啶環(huán):D環(huán),8～14b反密碼環(huán)：7bTψC環(huán):7b可變環(huán):4-5b(少數(shù)13～21b)氨基酸臂：7bp，3′-CCA-OHtRNA的三葉草型二級結(jié)構(gòu)主要特征：四環(huán)四臂(1)分子中由A-U、G-C堿基對構(gòu)成的雙螺旋區(qū)稱臂，不能配對的部分稱環(huán)，tRNA一般由四環(huán)四臂組成。(2)5’-端1~7位與近3’-端的67~72位形成7bp的反平行雙鏈稱氨基酸臂，3’端有共同的-CCA-OH結(jié)構(gòu)，其羥基可與該tRNA所能攜帶的氨基酸形成共價鍵。(3)第10～25位形成3~4bp的臂和8~14b的環(huán)，由于環(huán)上有二氫尿嘧啶(D),故稱為D環(huán),相應的臂稱為D臂。(4)第27~43位有5bp的反密碼子臂和7b的反密碼子環(huán)，其中34~36位是與mRNA相互作用的反密碼子。(5)第44~48位為可變環(huán)，80％的tRNA由4~5b

組成，20％的tRNA由13~21b組成。(6)第49~65位為5bp的TψC臂和7b的TψC環(huán)，因環(huán)中有TψC序列而得名。(7)tRNA分子中含有多少不等的修飾堿基，某些位置上的核苷酸在不同的tRNA分子中很少變化,稱不變核苷酸（都位于三葉草結(jié)構(gòu)上的非氫鍵區(qū)域）。4.tRNA的三級結(jié)構(gòu)在三葉草型二級結(jié)構(gòu)的基礎上，突環(huán)上未配對的堿基由于整個分子的扭曲而配成對，目前已知的tRNA的三級結(jié)構(gòu)均為倒L型。(單鏈突環(huán)互相靠近形成的環(huán)間堿基對是三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要因素)tRNA倒L型三級結(jié)構(gòu)tRNA倒L型三級結(jié)構(gòu)tRNAtRNAmRNA反密碼子密碼子氨基酸5′3′ACC轉(zhuǎn)運RNA——tRNA（transfer）5′3′tRNA三維結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)位點tRNA的倒L結(jié)構(gòu)與核糖體上的空穴相符；TψC環(huán)中GTψC與核糖體中5SrRNA相應區(qū)段有堿基互補關(guān)系；L型分子表面化學基團排列的維妙化，與一些酶（氨基酰-tRNA合成酶）和蛋白質(zhì)與tRNA分子的相互識別有關(guān)。（二）rRNA

(ribosomalRNA)1.核糖體的化學組成rRNA：60%蛋白質(zhì)：40%

原核生物

真核生物核糖體

rRNA核糖體

rRNA

30S70S50S16S5S/23S

40S80S60S18S5S/5.8S/28S70S80S50S30S60S40S31proteins23SRNA5SRNA21proteins16SRNA49proteins28SRNA5.8SRNA5SRNA33proteins18SRNA核糖體的組成原核真核2.核糖體功能：蛋白質(zhì)合成場所3.rRNA結(jié)構(gòu):rRNA占細胞RNA總量的80%左右（1）一級結(jié)構(gòu)：與tRNA不同，rRNA的修飾（如甲基化）多發(fā)生在核糖上，故含有修飾核苷而非修飾堿基（2）二級結(jié)構(gòu)：莖環(huán)結(jié)構(gòu)大腸桿菌16SrRNA有一半核苷酸形成鏈內(nèi)堿基配對，整個分子約有60個螺旋。未配對部分形成突環(huán)，一些分子內(nèi)長距離的堿基互補使相隔很遠的部分配對，形成復雜的多環(huán)多臂結(jié)構(gòu)。5′3′原核生物16SrRNA真核生物18SrRNA原核生物16SrRNA（3）三級結(jié)構(gòu)：對rRNA三級結(jié)構(gòu)的認識很少。核糖體的整體構(gòu)象由rRNA的三維結(jié)構(gòu)決定（主體），蛋白質(zhì)只是輔基或支架，一般正好位于RNA螺旋之間，分布在核糖體外表。4.rRNA的功能

rRNA決定核糖體的結(jié)構(gòu)和功能,分別與mRNA和tRNA作用，負責解碼，催化肽鍵的形成，促使蛋白質(zhì)合成的正確進行。萬卡特拉曼-萊馬克里斯南、托馬斯-施泰茨和阿達-尤納斯（從左至右）因?qū)Α昂颂求w結(jié)構(gòu)和功能的研究”做出突出貢獻而獲得2009年諾貝爾化學獎。他們在原子水平上揭示了核糖體的形態(tài)和功能。原核細胞核糖體真核細胞核糖體rRNA的結(jié)構(gòu)與功能（自讀）在有足夠量的Mg2+存在下分離到的16SrRNA處于緊密狀態(tài)，其空間結(jié)構(gòu)與30S亞基的形狀和大小非常相似16SrRNA（1542b的序列已確定）1535~1539b的CCUCC與mRNA的相應序列（mRNA的5’端SD序列）有互補關(guān)系大腸桿菌23SrRNA2904b的序列亦已確定23SrRNA的形狀與50S亞基相似，再次說明RNA自身折疊形成的構(gòu)象決定了核糖體亞基的形態(tài)rRNA的結(jié)構(gòu)與功能（自讀）真核生物的18SrRNA除多一些臂和環(huán)結(jié)構(gòu)外，空間結(jié)構(gòu)與16SrRNA十分相似已經(jīng)證明23SrRNA的特定區(qū)域在蛋白質(zhì)合成時對肽鍵形成有催化作用。(--核糖體是1種核酶)真核生物28SrRNA空間結(jié)構(gòu)與大腸桿菌23SrRNA相似5SrRNA60％以上的堿基形成分子內(nèi)堿基對，己發(fā)現(xiàn)有一特定序列與tRNA分子上的GTψCG互補

（三）mRNA和hnRNA

1961年Jacob和Monod提出信使RNA(messengerRNA)的概念，指帶有從DNA上得到的信息并指導蛋白質(zhì)合成的一類RNA分子。mRNA約占細胞總RNA的3％～5%；平均分子量:50萬,8S；代謝活躍，壽命較短

mRNA的核苷酸序列決定相應蛋白質(zhì)的氨基酸序列，其分子長度差異很大原核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細胞同一空間進行，兩個過程常緊密偶聯(lián)同時發(fā)生

真核生物在細胞核內(nèi)合成mRNA的前體，包括內(nèi)含子和外顯子的整個基因均被轉(zhuǎn)錄，形成分子大小極不均一的hnRNA(nuclearheterogenousRNA，核內(nèi)不均一RNA)。hnRNA在核內(nèi)被加工為成熟的mRNA，進入細胞質(zhì)指導蛋白質(zhì)合成。因此，真核生物由于細胞核的出現(xiàn)，基因的表達——轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個過程在時間和空間上是分開的。mRNA功能：蛋白質(zhì)合成的模板（遺傳密碼）1.一級結(jié)構(gòu)----mRNA中的核苷酸排列順序（1）原核mRNA的結(jié)構(gòu)特點5′—非編碼區(qū)——編碼區(qū)——間隔區(qū)——編碼區(qū)——非編碼區(qū)—3′可指導多條肽鏈合成，即是多順反子（為多條肽鏈編碼的mRNA－－－遺傳學將編碼一個多肽鏈的遺傳單位稱為順反子cistran）編碼區(qū)：為蛋白質(zhì)編碼非編碼區(qū)：在翻譯調(diào)控中起作用（2）真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)特點A、單順反子：只為一條肽鏈編碼的mRNAAAAA…Anm7GpppAUGGUGUAA………………5′3′5′帽子結(jié)構(gòu)密碼子3′多聚A尾

5′非編碼區(qū)編碼區(qū)

3′非編碼區(qū)mRNA的5

帽子結(jié)構(gòu)—m7GpppNm5

5

B、有帽子和尾巴結(jié)構(gòu)帽子的作用：

a.穩(wěn)定mRNA的結(jié)構(gòu)：封閉了mRNA5′-末端,使5′-末端無游離5′

-磷酸，抗外切酶降解；

b.為核糖體與mRNA結(jié)合提供信號：帽子與40S亞基結(jié)合；

c.與蛋白質(zhì)合成有關(guān)：帽子附近有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，縮短帽子與起始密碼之間的距離。Poly(A)尾巴的作用：

a.對mRNA有保護作用；

b.與mRNA從細胞核到細胞質(zhì)的運輸有關(guān)。2.mRNA二級結(jié)構(gòu)：花束狀結(jié)構(gòu)模型

（1）典型的mRNA單鏈自身回折形成許多雙螺旋區(qū)（2）順反子的起始密碼常處于暴露或易被暴露的地方，使它在核糖體上易與起始tRNA相互作用。（3）核糖體移動使二級結(jié)構(gòu)打開。

游離的mRNA可產(chǎn)生高級結(jié)構(gòu)，但在核糖體上翻譯時必須解開。mRNA產(chǎn)生的高級結(jié)構(gòu)顯著影響翻譯效率，有可能藉此作為調(diào)節(jié)翻譯的一種方式。（四）snRNA和asRNA●

snRNA(smallnuclearRNA，核內(nèi)小RNA）主要存在于細胞核中，少數(shù)穿梭于核質(zhì)之間，或存在于細胞質(zhì)中?！?/p>

snRNA存在廣泛，含量只占細胞RNA總量的0.1％~1%，分子大小多為58～300b?！?/p>

5’端有帽子結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)含U多的snRNA

稱為U-RNA，不同結(jié)構(gòu)的U-RNA稱為U1、U2等?！?/p>

5’端無帽子結(jié)構(gòu)的snRNA，按沉降系數(shù)或電泳遷移率排列，如4.5SRNA、7SRNA等；同一種snRNA

的結(jié)構(gòu)差異用阿拉伯數(shù)字或英文字母表示，如7S-1、7S-4等?！?/p>

snRNA均與蛋白質(zhì)連在一起，以核糖核酸蛋白（snRNP）的形式存在。●

U-RNP在hnRNA

及rRNA前體的加工中有重要作用●其他snRNA在控制細胞分裂和分化，協(xié)助細胞內(nèi)物質(zhì)運輸，構(gòu)成染色質(zhì)等方面有重要作用

●

asRNA（antisenseRNA）即反義RNA，指與正義RNA互補的RNA●1983年在原核生物發(fā)現(xiàn)的asRNA可通過互補序列與特定的mRNA結(jié)合，抑制mRNA的翻譯●隨后在真核生物亦發(fā)現(xiàn)了asRNA,并發(fā)現(xiàn)asRNA除主要在翻譯水平抑制基因表達外，還可抑制DNA的復制和轉(zhuǎn)錄?！?/p>

asRNA技術(shù)可用于基因功能研究，也可通過抑制有害基因的表達用于生產(chǎn)實踐和人類疾病的治療。如已用于抑制導致水果腐爛的酶的基因,延長水果保存期，并為某些疾病的基因治療提供新的途徑。（五）其他RNA的結(jié)構(gòu)

錘頭核酶的二級結(jié)構(gòu)底物部分通常為60個核苷酸左右同一分子上包括有催化部分和底物部分催化部分和底物部分組成錘頭結(jié)構(gòu)具有自我剪切作用其他類型的核酶，如發(fā)卡形、斧頭形、VS核酶（Varkud

衛(wèi)星RNA）第六節(jié)核酸的性質(zhì)一、一般理化性質(zhì)1.為兩性電解質(zhì)，通常表現(xiàn)為酸性。2.DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末；不溶于有機溶劑。3.DNA溶液的黏度極高,RNA溶液黏度小得多。4.RNA能在室溫條件下被稀堿水解而DNA對堿穩(wěn)定。利用核糖和脫氧核糖不同的顯色反應鑒定DNA與RNA:D-核糖與酸和苔黑酚共熱→綠色(λmax=670nm)D-2-脫氧核糖與酸和二苯胺→

藍紫色(λmax=595nm

)1、酸水解核酸分子內(nèi)的糖苷鍵和磷酸二酯鍵對酸的敏感性不同：糖苷鍵＞磷酸酯鍵；嘌呤糖苷鍵＞嘧啶糖苷鍵2、堿水解

RNA的磷酸二酯鍵對堿異常敏感，得到2′-或3′-核苷酸的混合物；

DNA對堿的作用并不敏感，其抗堿水解的生理意義在于作為遺傳物質(zhì)的DNA應更穩(wěn)定，不易水解。而RNA（主要是mRNA）是DNA的信使，完成任務后應該迅速降解。二、核酸的水解類別名稱作用方式底物產(chǎn)物RNA酶DNA酶

核酸酶RNARNaseT1內(nèi)切－GpN－Gp，－GpRNaseA內(nèi)切－PypN－Pyp，－PupRNaseU2內(nèi)切－PupN－Pup，－PupRNaseT2內(nèi)切－NpN－NpRNaseH內(nèi)切與DNA雜交的RNApNDNADNaseI內(nèi)切DNApN，pN－DNaseII內(nèi)切DNANp，－Np鏈球菌DNase內(nèi)切DNApN，pN－限制性內(nèi)切酶（RE）內(nèi)切，切點位于特殊的堿基序列雙鏈DNA粘端DNA，平端DNARNA，DNA核酸酶P1內(nèi)切、外切DNA、RNApN核酸酶M內(nèi)切DNA、RNANp核酸酶S1內(nèi)切單鏈DNA或RNApN牛脾磷酸二酯酶外切DNA、RNANp蛇毒磷酸二酯酶外切DNA、RNApN不同性質(zhì)的核酸酶3、酶促水解三、核酸的酸堿性質(zhì)（一）堿基的解離（二）核苷的解離（三）核苷酸的解離——兩性電解質(zhì)、等電點（四）核酸的滴定曲線四、核酸的紫外吸收性質(zhì)

核酸的堿基具有共軛雙鍵，因而有紫外吸收性質(zhì)，最大吸收峰在260nm（蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm）。核酸的光吸收值比其各核苷酸光吸收值的和少30~40%。當核酸變性或降解時光吸收值顯著增加（增色效應）;但核酸復性后，光吸收值又回復到原有水平（減色效應）。紫外吸收是實驗室中最常用的測定DNA或RNA的方法。從A260/A280比值可判斷核酸樣品的純度：

純DNA:A260/A280

＞

1.8；純RNA:A260/A280≥2.0對于純的核酸樣品，A260

=1時，相當于：

50μg/ml雙螺旋DNA，

40μg/ml單鏈DNA（或RNA），

20μg/ml寡核苷酸五、核酸的變性1.變性(denaturation)的概念核酸分子雙螺旋堿基對的氫鍵斷裂，雙鏈轉(zhuǎn)變成單鏈的無規(guī)線團狀態(tài)，使核酸的天然構(gòu)象和性質(zhì)發(fā)生改變（只涉及次級鍵的破壞）。核酸變性不同于降解變性核酸：增色效應；黏度下降；浮力密度升高（沉降系數(shù)變大）；生物活性降低、喪失

（主要是tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA和核酶等）

或不變（主要是DNA和mRNA等）

(P.114蛋白質(zhì)變性與核酸變性的比較)變性因素：溫度升高－－熱變性酸堿度改變－－酸堿變性尿素、甲酰胺、甲醛等所有破壞氫鍵、妨礙堿基堆積作用、增加磷酸基靜電斥力的因素在Tm時，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半（物化性質(zhì)改變一半）。DNATm值一般為82～95℃。2.熱變性和Tm

DNA變性是個突變過程，類似結(jié)晶的熔解，將其紫外吸收的增加量達到最大增量一半時的溫度稱熔解溫度(meltingtemperature,Tm)或解鏈溫度。想一想：為什么雙螺旋DNA熱變性的曲線為S型？雙螺旋的解鏈過程具有正協(xié)同效應，即解開第一個堿基對最難，隨后越來越容易。想一想：細胞內(nèi)的DNA是如何發(fā)生變性的？

解鏈酶的作用。3.影響Tm的因素（1）G-C的相對含量

（G+C）%=（Tm—69.3）×2.44

Tm＝69.3＋（G+C）％/2.44

RNA變性時也具有雙螺旋向無規(guī)線團之間的轉(zhuǎn)變。但由于RNA只有局部的雙螺旋區(qū)，故這種轉(zhuǎn)變不如DNA那樣明顯。變性曲線不那么陡，Tm較低。

(雙鏈互補RNA比同樣序列的DNA更穩(wěn)定，Tm值更高)（4）變性劑－－如甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。（3）溶液的pH－－高pH下堿基廣泛去質(zhì)子而喪失形成氫鍵的能力；低pH（＜5.0）下DNA易脫嘌呤。

（2）溶液離子強度－－離子強度低，Tm低。六、核酸的復性（退火）變性核酸的互補鏈在適當條件下重新締合成雙螺旋的過程稱為復性（renaturation）。因復性時需緩慢冷卻，故又稱退火(annealing)。復性的過程

溫度不宜過低，

Tm

－25℃Thedenaturationandrenaturationofdouble-strandedDNAmolecules如把加熱變性的DNA溶液直接插入冰浴,由于溶液溫度急速降低,單鏈DNA失去碰撞的機會,保持單鏈變性狀態(tài)而不能復性,這種冷處理過程稱淬火（guench）影響復性速度的因素：（1）單鏈片段濃度（2）單鏈片段的大?。?）片段內(nèi)重復序列的多少（即序列復雜度）（4）溶液離子強度的大?。?）溶液溫度的高低（Tm–25℃）不同DNA的復性動力學曲線七、核酸分子雜交(hybridization)在退火條件下,不同來源的DNA互補區(qū)形成氫鍵,或DNA單鏈和RNA鏈的互補區(qū)形成DNA-RNA雜合雙鏈的過程。－－是基因操作最核心技術(shù)之一，廣泛用于基因定位，測定基因拷貝數(shù),確定生物的遺傳進化關(guān)系,疾病的基因診斷等。分子雜交（molecularhybridization）加熱退火雙鏈DNA單鏈DNA雜交AB

加熱退火探針（probe）：用放射性同位素或熒光標記的DNA或RNA片段。原位雜交技術(shù)：直接用探針與菌落或組織細胞中的核酸雜交，未改變核酸所在的位置。印跡雜交（blothybridization）技術(shù)：把DNA或RNA、蛋白質(zhì)等在濾膜上先經(jīng)浸潤、固定后，于濾膜上與探針進行雜交，生成雜種分子。Southern印跡法（Southernblotting）或Southern

雜交：將電泳分離后的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，再進行雜交。

根據(jù)毛細管作用的原理,使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當?shù)臑V膜上,然后通過與標記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段,這種實驗方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由EdwinSouthern于1975年首先設計出來的,故又叫作SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。

（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)負片正片SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸限制性內(nèi)切酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。1977年，由J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾膜上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與Southern

DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做Northern

RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）。

將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質(zhì)之抗體進行反應,這種技術(shù)叫做Western蛋白質(zhì)雜交技術(shù)(Westernblotting)（1979年由Towbin等人提出）。Northern印跡法(Northernblotting)或Northern雜交

：將電泳分離后的RNA吸印到纖維素濾膜或尼龍膜上再進行分子雜交。第七節(jié)核酸的分離和純化一、核酸的提取和純化（一）DNA的提取和純化基因組DNA分離的要點●操作要溫和，防止DNA斷裂●不要劇烈震蕩●不要使用尖頭Tip頭●離心速度要適當●DNA回溶比較慢●沉淀的DNA為絲狀常用的DNA分離方法

●

鹽/苯酚/氯仿抽提法●

SDS/苯酚/氯仿抽提法

●氯化銫密度梯度離心法（二）RNA的提取和純化

RNA分離的要點

●

所有器皿、用具要嚴格處理，嚴防

RNase污染－－高溫焙烤、DEPC處理

●

破碎細胞時加入強變性劑（如胍鹽）使

RNase失活

●在RNA反應體系中加入RNase抑制劑（如RNasin）常用的RNA分離方法

●酸性胍鹽/苯酚/氯仿抽提法

●

胍鹽/氯化銫密度梯度離心法二、核酸的超速離心

密度梯度沉降平衡超速離心法－－

●測定核酸的密度●測定DNA中G－C之含量●研究溶液中核酸的構(gòu)象●用于核酸的制備想一想：為什么DNA、RNA和蛋白質(zhì)的混合物經(jīng)CsCl密度梯度離心后，在離心管中會呈現(xiàn)如圖所示的位置？

核酸的瓊脂糖凝膠電泳(分離數(shù)百bp～上百kbDNA分子)三、核酸的凝膠電泳核酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分析<1000bp

的DNA片段和RNA的電泳四、核酸的柱層析五、核酸的純度檢測和定量核酸含量的測定法

1.紫外分光光度法

2.定磷法

3.定糖法2.定磷法磷的測定最常用的是鉬藍比色法。此法需先用濃硫酸或過氯酸將有機磷水解成無機磷。在酸性條件下正磷酸與鉬酸作用生成磷鉬酸，在還原劑存在下被還原成鉬藍，其最大吸收峰在660nm處，在一定范圍內(nèi)溶液光密度與磷含量成正比，據(jù)此可以計算出核酸含量。

3.定糖法定糖法常用的也是比色法。當RNA與鹽酸共熱時核糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡c甲基苯二酚（地衣酚）反應呈鮮綠色，最大吸收峰在670nm處，反應需要三氯化鐵作催化劑。DNA在酸性溶液中與二苯胺共熱，其脫氧核糖可參與反應生成藍色化合物，最大吸收峰在595nm處。此外，還有一些比色反應也可給出靈敏的結(jié)果。第八節(jié)核酸的序列測定

DNA序列測定多采用Sanger的酶法和Gilbert的化學法－－它們都是建立在分辨力極高的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎上。目前實用中，主要運用酶法即雙脫氧末端終止法。反應體系DNA聚合酶單鏈DNA模板（待測DNA鏈）引物（與待測DNA鏈的3ˊ端互補的小DNA片段）4種dNTP適當?shù)臒o機離子4種ddNTP原理：ddNTP參入可導致DNA復制的末端終止步驟：進行四組平行反應每一組反應混合物含有四種dNTP每一組反應含有一種少量的dd