DB11∕T2358-2024淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境INA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范2024-12-25發(fā)布2025-04-01實(shí)施北京市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 1 25試劑 36儀器設(shè)備和材料 5 58分析步驟 69結(jié)果分析 710質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 8 9附錄A(資料性)淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物常用擴(kuò)增引物 附錄B(資料性)環(huán)境DNA采樣記錄表 附錄C(資料性)沉積物樣品采集和前處理 附錄D(資料性)淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)結(jié)果記錄表 參考文獻(xiàn) 本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由北京市生態(tài)環(huán)境局提出并歸口。本文件由北京市生態(tài)環(huán)境局組織實(shí)施。本文件起草單位：北京市生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心。本文件主要起草人：常淼、沈秀娥、孫成華、杜澤瑞、陳圓圓、戰(zhàn)愛(ài)斌、熊薇、陳義永、馬秋月、賀鑫、荊紅衛(wèi)、陶蕾、劉康、任帥、晁晶迪。1淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境INA監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范1范圍本文件規(guī)定了淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)的監(jiān)測(cè)原則及流程、試劑、儀器設(shè)備和材料、監(jiān)測(cè)點(diǎn)位布設(shè)、監(jiān)測(cè)頻次和時(shí)間、樣品采集、實(shí)驗(yàn)分析、結(jié)果分析、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制等技術(shù)要求。本文件適用于河流、湖泊、水庫(kù)等淡水水體中大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA的監(jiān)測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T30989高通量基因測(cè)序技術(shù)規(guī)程GB/T40226環(huán)境微生物宏基因組檢測(cè)高通量測(cè)序法HJ91.2地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范HJ1295水生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)指南河流水生生物監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)(試行)HJ1296水生態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)指南湖泊和水庫(kù)水生生物監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)(試行)DB11/T2023魚(yú)類(lèi)貝類(lèi)環(huán)境DNA識(shí)別技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物freshwaterbenthicmcroirvertebrates生活史的全部或至少一個(gè)時(shí)期棲息于內(nèi)陸淡水水體的水底中且個(gè)體不能通過(guò)500μm孔徑網(wǎng)篩的無(wú)脊椎動(dòng)物。主要包括刺胞動(dòng)物門(mén)(Cnidaria)或稱(chēng)腔腸動(dòng)物門(mén)(Coelenterata)、扁形動(dòng)物門(mén) (Platyhelminthes)、線(xiàn)形動(dòng)物門(mén)(Nematomorpha)、線(xiàn)蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)(Nematoda)、環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)(Annelida)、軟體動(dòng)物門(mén)(Mbllusca)、節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)的動(dòng)物。從生物生活環(huán)境中直接提取到的不同物種DNA的總和，包含生物脫落、釋放的細(xì)胞或游離的DNA。[來(lái)源：DB11/T2023—2022,3.3,有修改]高通量測(cè)序high-througlputsequencing(HS)區(qū)別于傳統(tǒng)雙脫氧鏈末端終止法(Sanger)測(cè)序，能夠一次并行對(duì)大量核酸分子進(jìn)行平行序列測(cè)定的技術(shù)。[來(lái)源：GB/T30989—2014,3.19,有修改]2INA條形碼IMbarcode一段標(biāo)準(zhǔn)的、短小的、易于PCR擴(kuò)增的、物種間有足夠變異且物種內(nèi)相對(duì)保守的、能夠代表該物種的基因序列。本文件選用淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物常用的后生動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組上的DNA序列作為目標(biāo)eIM宏條形碼技術(shù)eINntabarcodingtechnology利用高通量測(cè)序技術(shù)獲取環(huán)境樣品(如水、沉積物等)中的目標(biāo)基因序列，根據(jù)物種間特定DNA序列差異識(shí)別物種，獲取物種組成的技術(shù)。序列相似值seqμencesinilarity反映序列間相似程度的數(shù)值，即序列間相同DNA堿基數(shù)目所占的比例，一般以百分?jǐn)?shù)表示。[來(lái)源：SN/T4278—2015,3.8,有修改]判定兩條DNA序列是否為同一操作分類(lèi)單元的最小序列相似值。測(cè)序數(shù)據(jù)按照一定的序列相似度閾值進(jìn)行聚類(lèi)，獲得的用于表征物種的分子水平的分類(lèi)單元。相對(duì)序列豐度relativeseqpenceabundknce樣品中分配到某一分類(lèi)階元的序列數(shù)占該樣品序列總數(shù)的比例。[來(lái)源：GB/T40226—2021,3.2,有修改]陰性對(duì)照negativecontrol不含待測(cè)物種或者所有物種DNA的樣品(如滅菌超純水),與待測(cè)樣品同步實(shí)驗(yàn)，用于判斷待測(cè)樣品是否被污染。[來(lái)源：SN/T4278—2015,3.7,有修改]陽(yáng)性對(duì)照positivecontrol已知物種組成的基因組DNA或人工合成含有目標(biāo)序列的DNA片段的混合物，與待測(cè)樣品同步實(shí)驗(yàn)，用于判斷結(jié)果是否可靠。[來(lái)源：SN/T4278—2015,3.6,有修改]4環(huán)境INA監(jiān)測(cè)原則及流程4.1.1科學(xué)性原則淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)應(yīng)客觀、科學(xué)地反映監(jiān)測(cè)對(duì)象的實(shí)際狀況，符合生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和環(huán)境科學(xué)的基本原理和要求。41.2代表性原則3監(jiān)測(cè)結(jié)果應(yīng)能在物種及相對(duì)豐度等方面全面客觀反映監(jiān)測(cè)水域淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物群落的整4.1.3可操作性原則在水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)行業(yè)現(xiàn)有技術(shù)水平和資源配置的條件下，以支撐環(huán)境管理為目標(biāo)，優(yōu)先采用效率高、成本低、方法簡(jiǎn)、操作易的監(jiān)測(cè)方法。4.1.4可比性原則淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物群落及生境的時(shí)空變化具有長(zhǎng)期性、復(fù)雜性，監(jiān)測(cè)點(diǎn)位、方法、指標(biāo)、時(shí)間和頻次等一經(jīng)確定，應(yīng)盡量保持延續(xù)性，使監(jiān)測(cè)結(jié)果可比。4.1.5保護(hù)性原則監(jiān)測(cè)工作以保護(hù)和恢復(fù)為最終目標(biāo)，在監(jiān)測(cè)過(guò)程中應(yīng)盡量避免傷害野生動(dòng)植物、破壞生態(tài)環(huán)境和超出客觀需要的頻繁采樣。4.1.6安全性原則監(jiān)測(cè)工作具有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)，監(jiān)測(cè)人員應(yīng)接受相關(guān)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，并做好安全防護(hù)措施。4.2監(jiān)測(cè)流程淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)流程見(jiàn)圖1。監(jiān)測(cè)點(diǎn)位布設(shè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)位布設(shè)準(zhǔn)備階段監(jiān)測(cè)頻次和時(shí)間樣品采集現(xiàn)場(chǎng)采樣階段質(zhì)量保證和DWA質(zhì)量檢測(cè)和保存實(shí)驗(yàn)分析階段高通量測(cè)序生物信息學(xué)分析結(jié)果分析階段結(jié)果統(tǒng)計(jì)樣品保存質(zhì)量控制圖1監(jiān)測(cè)流程圖5.1試劑基本要求4除非另有說(shuō)明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)用水為滅菌超純水。5.2采樣及前處理試劑市售含氯消毒劑，使用時(shí)按說(shuō)明書(shū)稀釋?zhuān)褂脻舛燃s為500mg/L。5.3環(huán)境INA提取試劑推薦使用市售的DNA提取試劑或試劑盒。如使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取DNA所需試劑a)滅菌超純水：超純水經(jīng)121℃,0.1MPa滅菌30min,無(wú)細(xì)菌無(wú)核酸酶；b)乙二胺四乙酸(EDTA,Cn?H?N?O?);c)氫氧化鈉(NaOH);d)氫氧化鈉溶液：c(NaOH)=1mol/L;e)乙二胺四乙酸溶液：c(EDTA)=0.02ml/L,pH=8.0;f)三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCI,CaH?CINO?);h)Tris-HCI溶液：c(Tris-HCI)=0.1mol/L,稱(chēng)取15.76g三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶于適量滅菌超純水中，鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0,定容至1000mL,滅菌后備用；i)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB,C?H?BrN);j)氯化鈉(NaCl);k)CTAB提取液：稱(chēng)取4g十六烷基三甲基溴化銨和16.38g氯化鈉，分別溶于適量滅菌超純水中，加入乙二胺四乙酸溶液8mL和Tris-HCI溶液20mL,pH約8.0,定容至200mL,滅菌后I)酚氯仿異戊醇：市售，Tris飽和酚、三氯甲烷和異戊醇體積比25:24:1,pH=8.0;n)乙酸銨溶液：c(CH?COONH?)=7.5mol/L,稱(chēng)取57.81g乙酸銨溶于適量滅菌超純水中，定容0)無(wú)水乙醇(C?H?0);p)75%乙醇：無(wú)水乙醇和滅菌超純水體積比3:1配制；q)蛋白酶K:市售，酶活力≥45U/mg,濃度為20mg/ml;r)陽(yáng)性對(duì)照樣品：已知物種組成的基因組DNA或人工合成含有目標(biāo)序列的DNA片段的混合物，5.4PCR擴(kuò)增試劑5.41PCR通用引物：淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA擴(kuò)增引物可選擇一對(duì)或多對(duì)，推薦的引物參5.42PCR擴(kuò)增試劑：推薦市售的PCR擴(kuò)增試劑套裝，包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg"和PCR緩沖5.5IM凝膠電泳試劑5.5.1電泳緩沖液：使用TAE緩沖液(1×)。取20mL市售TAE緩沖液(50×),滅菌超純水[見(jiàn)5.3a)]定容至1L,pH=7.8～8.8。5.5.2瓊脂糖凝膠：使用1%～2%瓊脂糖凝膠。取市售的瓊脂糖，加入電泳緩沖液(5.5.1)配制。55.5.3DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(含上樣緩沖液):市售的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)范圍100bp~2000bp,包含若干條單一的DNA條帶，如100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,20005.5.4DNA染料：推薦使用市售無(wú)毒性或低毒性DNA染料。5.5.5PCR產(chǎn)物純化試劑：推薦使用市售PCR產(chǎn)物純化試劑盒。6儀器設(shè)備和材料6.1采水器：有機(jī)玻璃材質(zhì)，1L、2L、3L等規(guī)格。6.2過(guò)濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵。6.3烘箱：室溫～250℃可調(diào)。6.4水浴鍋：室溫～100℃可調(diào)。6.5高壓蒸汽滅菌器：可達(dá)到121℃,0.1MPa滅菌條件。6.6超凈工作臺(tái)。6.8水平電泳儀：電場(chǎng)強(qiáng)度為5V/cm~10V/cm。6.9離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可達(dá)13000r/min,溫度可控制在4℃。6.10DNA濃度分光光度計(jì)：最小測(cè)量體積1μL,波長(zhǎng)范圍應(yīng)覆蓋230nm~280nm。6.11凝膠成像儀：具備DNA凝膠成像拍照功能。6.12高通量測(cè)序儀：測(cè)序讀長(zhǎng)滿(mǎn)足PCR產(chǎn)物測(cè)序長(zhǎng)度的要求。6.13采樣瓶或采樣袋：市售的1L螺口旋蓋的無(wú)菌高密度聚乙烯塑料瓶或無(wú)菌采樣袋。6.14無(wú)菌微孔濾膜：孔徑0.45μm,根據(jù)水體濁度也可選用孔徑0.22μm~1.2μm的濾膜。6.15一次性離心管：1.5mL、2mL、5mL和50mL,無(wú)DNA和生物殘留。6.16一次性?xún)龃婀埽?.5mL、2mL、5mL和10mL,無(wú)DNA和生物殘留。6.17一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備和材料。如PCR管、96孔板等PCR反應(yīng)容器：無(wú)DNA和生物殘留。7.1監(jiān)測(cè)點(diǎn)位布設(shè)7.2監(jiān)測(cè)頻次和時(shí)間7.3樣品采集7.3.1采樣位置樣品采集時(shí)應(yīng)拍攝并詳細(xì)記錄現(xiàn)場(chǎng)情況，記錄采樣點(diǎn)位周邊是否有污水排口、天氣、采樣時(shí)間、樣品運(yùn)輸和保存條件等信息，采樣記錄表見(jiàn)表B.1。若在規(guī)定的監(jiān)測(cè)時(shí)間段內(nèi)河流、湖庫(kù)水文氣象條件(如降雨集中期、冰凍期)不適宜采樣，可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整采樣時(shí)間。不能抵達(dá)指定采樣位置時(shí)，應(yīng)記錄現(xiàn)場(chǎng)情況和調(diào)整后的實(shí)際采樣位置。7.3.2采樣方式和技術(shù)要求6河流、湖庫(kù)岸邊采樣：按照HJ91.2,河流和湖庫(kù)岸邊點(diǎn)位用采水器在水面下0.5m范圍內(nèi)采集水樣。水深(h),h<0.5m時(shí)，在1/2水深處采樣。河流、湖庫(kù)離岸采樣：在水底上0.5m設(shè)置采樣點(diǎn)位。7.3.3采樣方法淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物環(huán)境DNA樣品與水質(zhì)或形態(tài)學(xué)鑒定樣品同步采樣時(shí)，一般應(yīng)先采集環(huán)境DNA樣品。采樣體積為1L,也可根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)情況調(diào)整采樣體積(1L~2L)。條件具備時(shí)，在同一點(diǎn)位也可補(bǔ)充采集沉積物樣品，沉積物樣品采樣和前處理方式見(jiàn)附錄C,沉積物監(jiān)測(cè)結(jié)果可與水樣合并使用。7.4環(huán)境INA富集水樣宜現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾，過(guò)濾體積推薦1L,也可根據(jù)水體濁度調(diào)整過(guò)濾體積(1L~2L)。如水樣混濁且含有易堵塞濾膜的懸浮物，應(yīng)靜置分離懸浮顆粒物，再過(guò)濾。生物密度較高的水體(如處于藻華爆發(fā)期),可將水樣等體積分開(kāi)過(guò)濾至多張濾膜，作為子樣品。7.5樣品保存7.5.1如現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾，過(guò)濾后的濾膜放入無(wú)菌離心管或凍存管中，保存在樣品低溫保存箱中4℃及以下冷藏運(yùn)輸，當(dāng)天返回實(shí)驗(yàn)室后-20℃~-80℃保存，應(yīng)盡快完成DNA的提取。7.5.2如未能現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾，需要采樣瓶裝滿(mǎn)水后蓋上瓶蓋密封，4℃冷藏運(yùn)輸，并在6h內(nèi)返回實(shí)驗(yàn)室，24h內(nèi)完成過(guò)濾，濾膜-20℃~-80℃保存，應(yīng)盡快完成DNA的提取。水樣濾膜應(yīng)妥善保存，在條件允許的情況下應(yīng)保留備份樣品，并記錄保存信息。8分析步驟使用市售的DNA提取試劑盒或CTAB法提取水樣中的DNA。DNA提取試劑盒提取的具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。CTAB法提取步驟如下：a)將水樣濾膜盡量剪碎后放入離心管中，加入500μLCTAB提取液[見(jiàn)5.3k]]和5μL蛋白酶K[見(jiàn)5.3q]],渦旋震蕩混勻后在水浴鍋中56℃水浴裂解3h;b)移取全部溶液至離心管，加入550μL酚氯仿異戊醇(見(jiàn)5.31)]混勻后，13000r/min,4℃c)取上清液移至離心管，加入550μL酚氯仿異戊醇[見(jiàn)5.31]]混勻后，13000r/min,4℃d)取上清液移至離心管，加入1ml的-20℃預(yù)冷處理的無(wú)水乙醇[見(jiàn)5.30]]、50μL乙酸銨溶液[見(jiàn)5.3n]]混勻后，-20℃靜置30min,13000r/min,4℃離心10min。棄上清液，保留離心管底部沉淀物；e)向離心管內(nèi)加入1mL75%乙醇(見(jiàn)5.3p)],13000r/min,4℃離心10min,棄上清液，保留離心管底部沉淀物。重復(fù)操作一次；f)沉淀物用75%乙醇洗脫兩次，25℃烘干1h~2h,加入50μL~100μL滅菌超純水[見(jiàn)5.3a)]溶解。待測(cè)。782INA質(zhì)量檢測(cè)和保存用DNA濃度分光光度計(jì)檢測(cè)提取后的DNA質(zhì)量和濃度，DNA濃度宜高于1ng/μL,DNA在260nm和280nm波長(zhǎng)處的吸光度值比值(OD260nm/OD280nm)應(yīng)在1.7~2.0范圍內(nèi)。合格的DNA樣品分裝為兩份，一份保存在-20℃用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，另一份在-80℃長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融。8.3PFCR擴(kuò)增8.3.1FCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件8.3.1.1選擇已添加索引的PCR引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA條形碼序列。8.3.1.2每個(gè)樣品應(yīng)設(shè)置3個(gè)PCR重復(fù)樣品。8.3.1.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：總體積一般為25μL,一般包括擴(kuò)增緩沖液、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA。各組分濃度宜根據(jù)目標(biāo)基因、引物和實(shí)驗(yàn)情況調(diào)整。剩余體積用滅菌超純水補(bǔ)齊。8.3.1.4PCR反應(yīng)程序設(shè)置：95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s;退火溫度范圍見(jiàn)表A.1,退火時(shí)間范圍為30s~45s,宜根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳退火溫度；72℃延伸45s;變性、退火、延伸過(guò)程共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。8.3.2FCR反應(yīng)產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)使用1%～2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增的有效性。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)目的條帶；陽(yáng)性對(duì)照和受試樣品應(yīng)在目標(biāo)長(zhǎng)度位置出現(xiàn)條帶；若3個(gè)PCR重復(fù)樣品中出現(xiàn)2個(gè)PCR重復(fù)樣品擴(kuò)增失敗，該樣品應(yīng)重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增。8.3.3FCR產(chǎn)物純化和保存將3個(gè)PCR重復(fù)產(chǎn)物混合，使用市售的PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化目的片段，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。用DNA濃度分光光度計(jì)檢測(cè)純化后的PCR產(chǎn)物質(zhì)量和濃度。PCR產(chǎn)物在-20℃~-80℃溫度條件下保存，保存時(shí)間一般不超過(guò)1年。8.4高通量測(cè)序宜將含有不同索引的擴(kuò)增產(chǎn)物等摩爾量混合構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。文庫(kù)的片段長(zhǎng)度分布應(yīng)符合預(yù)期。文庫(kù)濃度應(yīng)滿(mǎn)足高通量測(cè)序要求。參照GB/T30989和GB/T35537的規(guī)定對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。每個(gè)樣品的預(yù)期序列數(shù)不宜低于30000條，可根據(jù)監(jiān)測(cè)目標(biāo)和測(cè)序結(jié)果調(diào)整測(cè)序預(yù)期序列數(shù)。9結(jié)果分析9.1生物信息學(xué)分析9.1.1序列處理首先根據(jù)擴(kuò)增引物前添加的索引將序列分配到不同的樣品中。通過(guò)檢查索引序列和引物序列的匹配度篩除非特異性擴(kuò)增序列。刪除測(cè)序序列中含有的模糊堿基、單堿基高重復(fù)區(qū)或長(zhǎng)度過(guò)短的序列、嵌合體序列等。對(duì)堿基序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾(質(zhì)量值一般>020),按照GB/T40226的規(guī)定，>020的堿基比8例應(yīng)≥90%再進(jìn)行序列長(zhǎng)度過(guò)濾，刪除序列長(zhǎng)度過(guò)短的序列，按照序列長(zhǎng)度(>測(cè)序預(yù)期長(zhǎng)度的70%)修剪序列。將序列相似值高于或等于閾值(序列相似度閾值一般為0.97)的序列合并成OTU,將序列比對(duì)到每個(gè)OTU的代表性序列，獲得每個(gè)OTU在每個(gè)樣品中出現(xiàn)的序列數(shù)。根據(jù)監(jiān)測(cè)目標(biāo)和測(cè)序結(jié)果調(diào)整應(yīng)刪除的9.1.3物種注釋將每個(gè)OTU的代表性序列與本地DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)或公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，獲得物種注釋信息。按照DB11/T2023設(shè)定物種鑒定閾值范圍，保留覆蓋度、序列相似值均大于85%的注釋信息。物種注釋方法和物種鑒定閾值的設(shè)定應(yīng)綜合考慮選用的DNA條形碼片段、參考數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性及數(shù)據(jù)用途。注釋得到的物種信息應(yīng)與歷史監(jiān)測(cè)結(jié)果和形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行人工校驗(yàn)，篩選保留淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物信息，剔除非淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物的物種信息。如檢出歷史上本地?zé)o分布的物種信息，應(yīng)記錄。9.2結(jié)果統(tǒng)計(jì)建議保留3個(gè)現(xiàn)場(chǎng)平行樣品中出現(xiàn)在2個(gè)現(xiàn)場(chǎng)平行樣品以上的物種注釋信息，取平行樣品間共有的物種注釋信息作為該點(diǎn)位的結(jié)果。根據(jù)監(jiān)測(cè)目標(biāo)調(diào)整應(yīng)保留的物種相對(duì)序列豐度，物種相對(duì)序列豐度宜取平行樣品間物種相對(duì)序列豐度的幾何平均值。9.3結(jié)果記錄同一批實(shí)驗(yàn)生物信息學(xué)分析流程及關(guān)鍵參數(shù)應(yīng)詳細(xì)記錄并保持一致。某個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)位的淡水大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物監(jiān)測(cè)結(jié)果記錄表由OTU編號(hào)、代表性序列、序列條數(shù)、相對(duì)序列豐度、物種分類(lèi)信息、覆蓋度和序列相似值等組成，見(jiàn)表D.1。10質(zhì)量保證和質(zhì)量控制10.1質(zhì)量保證實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域的設(shè)置宜符合GB/T30989中有關(guān)實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域的要求。10.2平行樣品每個(gè)采樣點(diǎn)位平行采集3個(gè)樣品。建議保留3個(gè)平行樣品中出現(xiàn)在2個(gè)平行樣品以上的物種注釋信息。相對(duì)序列豐度宜取幾何平均值。10.3陰性對(duì)照試驗(yàn)10.3.1陰性對(duì)照樣品為滅菌超純水。10.3.2每批次采樣時(shí)應(yīng)設(shè)置1個(gè)全程序陰性對(duì)照樣品。用采樣瓶(見(jiàn)6.13)攜帶滅菌超純水至采樣現(xiàn)場(chǎng)，經(jīng)采水器(見(jiàn)6.1)盛裝的陰性對(duì)照移入采樣瓶，按7.4相同的步驟富集后，與樣品一起進(jìn)行98.1～8.3的分析步驟。10.3.3每批次PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置不少于1個(gè)PCR擴(kuò)增陰性對(duì)照樣品。按8.3的分析步驟與樣品一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10.3.4陰性對(duì)照樣品應(yīng)無(wú)目的條帶。否則本批次樣品應(yīng)重新檢測(cè)。10.4陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)10.4.1陽(yáng)性對(duì)照為不少于10個(gè)特定物種的基因組DNA或人工合成含有目標(biāo)序列的DNA片段的等摩爾量混合物，樣品濃度一般不低于1ng/μL。10.4.2每次PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照樣品。按8.3的分析步驟與樣品一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10.4.3陽(yáng)性對(duì)照樣品應(yīng)在目標(biāo)長(zhǎng)度位置出現(xiàn)條帶。否則本批次樣品應(yīng)重新檢測(cè)。10.5質(zhì)量控制指標(biāo)10.5.1假陰性率使用陽(yáng)性對(duì)照樣品控制假陰性率。重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)樣品中含有但測(cè)量結(jié)果中未檢出的物種所占比例，即假陰性率(FN)。假陰性率不應(yīng)超過(guò)10%。按照公式(1)計(jì)算。FN——假陰性率，%;Q——標(biāo)準(zhǔn)樣品中未被測(cè)出的物種數(shù)目，單位為個(gè)；Q——標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)際物種數(shù)目，單位為個(gè)。10.5.2假陽(yáng)性率使用陽(yáng)性對(duì)照樣品控制假陽(yáng)性率。重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算測(cè)量結(jié)果中檢出但標(biāo)準(zhǔn)樣品中不存在的物種所占比例，即假陽(yáng)性率(FP)。假陽(yáng)性率不應(yīng)超過(guò)10%。按照公式(2)計(jì)算。式中：FP——假陽(yáng)性率，%;Q?——未在標(biāo)準(zhǔn)品物種清單的物種數(shù)目，單位為個(gè)；Q——標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)際物種數(shù)目，單位為個(gè)。11廢物處置實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的有害廢物的分