DB32T 4644.4-2025從業(yè)人員健康檢查 第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T4644.4—2025從業(yè)人員健康檢查第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法Healthexaminationofemployees—Part4:DetectionmethodsofSalmonellatyphimurium，Salmonellaparatyphi，Vibriocholerae，ShigellaandEntamoebahistolytica2025-02-21發(fā)布2025-03-21實(shí)施江蘇省市場監(jiān)督管理局中國標(biāo)準(zhǔn)出版社發(fā)布出版Ⅰ前言 Ⅲ引言 Ⅳ 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4縮略語 5方法原理 6設(shè)備與材料 7培養(yǎng)基和試劑 8檢驗(yàn)程序 9操作步驟 10生物安全 附錄A（資料性）培養(yǎng)基和試劑 附錄B（規(guī)范性）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測反應(yīng)體系及注意事項(xiàng) Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB32/T4644《從業(yè)人員健康檢查》的第4部分。DB32/T4644已經(jīng)發(fā)布了以下部分：——第1部分：檢查機(jī)構(gòu)管理規(guī)范；——第2部分：健康檢查技術(shù)規(guī)范；——第3部分：質(zhì)量控制規(guī)范；——第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法；——第5部分：信息系統(tǒng)基本數(shù)據(jù)集。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康委員會(huì)提出并組織實(shí)施。本文件由江蘇省衛(wèi)生健康標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：江蘇省疾病預(yù)防控制中心、南京市疾病預(yù)防控制中心、徐州市疾病預(yù)防控制中心、深圳市職業(yè)病防治院、赤峰眾康生物科技有限公司。苗升浩。Ⅳ引言從業(yè)人員健康檢查是根據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》《中華人民共和國食品安全法》《中華人民共和國藥品管理法》《公共場所衛(wèi)生管理?xiàng)l例》《生活飲用水衛(wèi)生監(jiān)督管理辦法》《化妝品衛(wèi)生管理?xiàng)l例》等法律法規(guī)所進(jìn)行的從業(yè)前、從業(yè)期間的健康檢查。DB32/T4644《從業(yè)人員健康檢查》分為以下5個(gè)部分：——第1部分：檢查機(jī)構(gòu)管理規(guī)范；——第2部分：健康檢查技術(shù)規(guī)范；——第3部分：質(zhì)量控制規(guī)范；——第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法；——第5部分：信息系統(tǒng)基本數(shù)據(jù)集。DB32/T4644的制定是對從業(yè)人員健康檢查工作相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的有力補(bǔ)充，對貫徹落實(shí)《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》、推進(jìn)健康中國建設(shè)、提高人民健康水平、保障公眾健康和公共衛(wèi)生安全具有重要意義。DB32/T4644.4—20251從業(yè)人員健康檢查第4部分：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)方法本文件描述了從業(yè)人員健康檢查糞便標(biāo)本（肛拭子）中傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的檢驗(yàn)方法。本文件適用于公共場所從業(yè)人員、食品生產(chǎn)和加工人員、食品流通和餐飲服務(wù)人員、飲用水生產(chǎn)、經(jīng)營人員健康檢查項(xiàng)目中糞便標(biāo)本（肛拭子）的傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的檢驗(yàn)，醫(yī)療衛(wèi)生用品、化妝品等相關(guān)行業(yè)從業(yè)人員的健康檢查可參照執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.4食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求WS280傷寒和副傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)WS287細(xì)菌性和阿米巴性痢疾診斷標(biāo)準(zhǔn)WS289霍亂診斷標(biāo)準(zhǔn)3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。實(shí)時(shí)熒光PCRreal-timePCR實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。Ct值cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。4縮略語BS：亞硫酸鉍瓊脂（BismuthSulfiteAgar）DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）FAM：6-羧基熒光素（6-carboxyfluorescein）2TCBS：硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂（TCBSAgar）XLD：木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（Xylose-LysineDesoxycholateAgar）5方法原理5.1篩查試驗(yàn)5.1.1依據(jù)核酸體外擴(kuò)增基本原理，針對傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴特異靶基因序列設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記探針，在實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)過程中，當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到并超過所設(shè)定的閾值時(shí)，利用熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物量的正相關(guān)關(guān)系，即可對實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果進(jìn)行分析和判定。5.1.2對標(biāo)本的模板DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)其Ct值及擴(kuò)增曲線進(jìn)行標(biāo)本結(jié)果報(bào)告，當(dāng)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果呈陰性時(shí)直接報(bào)告陰性結(jié)果；當(dāng)實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果呈陽性時(shí)，進(jìn)一步對陽性標(biāo)本做確證試驗(yàn)。從而實(shí)現(xiàn)對從業(yè)人員健康檢查糞便標(biāo)本（肛拭子）中的傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的快速篩查。5.2確證試驗(yàn)通過增菌、分離、生化和血清學(xué)鑒定等方法，從實(shí)時(shí)熒光PCR陽性標(biāo)本中分離得到目標(biāo)病原體。結(jié)果為陽性時(shí)報(bào)告陽性（檢出結(jié)果為陰性時(shí)報(bào)告陰性（未檢出）。6設(shè)備與材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，包括但不限于以下設(shè)備和材料。6.1Ⅱ級生物安全柜。6.2冰箱：2℃~8℃和-20℃。6.5離心機(jī)：離心力≥12000×g。6.6pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙。6.7渦旋混勻器。6.8恒溫金屬浴/水浴鍋：25℃~100℃。6.9實(shí)時(shí)熒光PCR儀。DB32/T4644.4—202536.10全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。6.11微生物飛行質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)。6.13無菌試管：10mm×75mm、15mm×150mm或其他合適規(guī)格。6.14無菌小玻管：3mm×50mm。6.15無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。6.19采樣拭子：長度≥10cm。6.20PCR反應(yīng)管。7培養(yǎng)基和試劑7.3氯化鎂孔雀綠大豆胨（RVS）增菌液：見A.3。7.4堿性蛋白胨水培養(yǎng)基：見A.4。7.7木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂：見A.7。7.9慶大霉素瓊脂：見A.9。7.10硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂：見A.10。7.18動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體（MIU）瓊脂：見A.18。7.19沙門氏菌顯色培養(yǎng)基。7.20沙門氏菌診斷血清。7.21志賀氏菌診斷血清。7.22霍亂弧菌診斷血清。7.23除特別說明外，PCR所用化學(xué)試劑為分析純。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。7.25實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑：傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴熒光PCR檢測靶基因、反應(yīng)體系及注意事項(xiàng)應(yīng)符合附錄B。DB32/T4644.4—202548檢驗(yàn)程序傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)程序見圖1。圖1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴檢驗(yàn)程序9操作步驟9.1標(biāo)本采集、保存及運(yùn)輸用滅菌的采樣拭子，由肛門插入直腸內(nèi)3cm~5cm處，旋轉(zhuǎn)360°采集，或用采樣拭子蘸取適量糞便，5放入盛有1mL~3mL生理鹽水的采樣管內(nèi)，旋緊管蓋，編號(hào)備用。9.1.2標(biāo)本的保存和運(yùn)輸采集的標(biāo)本盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，如不能立即送檢，在2℃~8℃條件下保存不超過24h。9.2標(biāo)本的前處理將標(biāo)本充分混勻，吸取勻液1mL加入到4mL營養(yǎng)肉湯中，置于36℃±1℃增菌培養(yǎng)3h~6h。9.2.2標(biāo)本混合9.2.2.1根據(jù)樣本數(shù)量，取n個(gè)無菌的1.5mL離心管或合適容量篩選管作為混合管，分別編號(hào)。9.2.2.2每份標(biāo)本取增菌液100μL，分別依次加入到混合管中。根據(jù)實(shí)際情況，將5~10份標(biāo)本混合成1份混合標(biāo)本。9.2.2.3標(biāo)本混合時(shí)，應(yīng)防止操作人員和環(huán)境污染?；旌贤瓿珊?，使用渦旋振蕩器進(jìn)行混勻，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。9.2.2.4如混合標(biāo)本PCR檢測為陰性，判定混合標(biāo)本所代表的全部標(biāo)本為陰性。如混合標(biāo)本PCR檢測為某種致病微生物陽性，則再對混合標(biāo)本中的每一份標(biāo)本按9.4進(jìn)行確證試驗(yàn)，以確定具體陽性標(biāo)本。9.3篩查試驗(yàn)9.3.1DNA模板的制備標(biāo)本12000×g離心5min，棄上清；加入50μL~100μLDNA取液，重懸沉淀并充分混合后100℃加熱處理5min，12000×g離心2min，取5μL上清液，作為模板DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。若不能及時(shí)檢測，應(yīng)存放于-20℃以下保存，并盡快完成檢測。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，也可使用商品化試劑盒制備DNA模板。9.3.2PCR反應(yīng)體系19.64μL，1U/μLUNG酶0.06μL，5U/μLTaq酶0.3μL模板DNA5μL。反應(yīng)體系按照附錄B執(zhí)行。9.3.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測9.3.3.1將9.3.2中瞬時(shí)離心后的PCR反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀內(nèi)，記錄標(biāo)本擺放順序，進(jìn)行核酸擴(kuò)增和檢測。（同時(shí)采集FAM、VIC和CY5熒光信號(hào)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。9.3.4對照設(shè)置檢測過程（包括DNA提?。┲?，每個(gè)反應(yīng)均應(yīng)設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。其中陽性對照模板為擴(kuò)增片段的陽性克隆分子DNA或標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，陰性對照模板為大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，空白對照為滅菌去離子水。69.3.5結(jié)果判讀9.3.5.1對照的結(jié)果判讀陽性對照出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，Ct值≤30；陰性對照無典型擴(kuò)增曲線或Ct值≥40；空白對照無典型擴(kuò)增曲線或Ct值≥40。否則，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果視為無效。9.3.5.2樣品的結(jié)果判定和報(bào)告9.3.5.2.1FAM通道Ct值>40或無Ct值，可判定標(biāo)本檢測結(jié)果為傷寒沙門氏菌（A管）和（或）痢疾阿米巴（B管）陰性，可直接報(bào)告未檢出傷寒沙門氏菌和（或）痢疾阿米巴；VIC通道Ct值>40或無Ct值，可判定標(biāo)本檢測結(jié)果為副傷寒沙門氏菌（A管）陰性，可直接報(bào)告未檢出副傷寒沙門氏菌；CY5通道Ct值>40或無Ct值，可判定標(biāo)本檢測結(jié)果為霍亂弧菌（A管）和（或）志賀氏菌（B管）陰性，可直接報(bào)告未檢出霍亂9.3.5.2.2FAM通道Ct值<35，有明顯指數(shù)增長期，可判定該標(biāo)本檢測結(jié)果為傷寒沙門氏菌（A管）和（或）痢疾阿米巴（B管）陽性；VIC通道Ct值<35，有明顯指數(shù)增長期，可判定該標(biāo)本檢測結(jié)果為副傷寒沙門氏菌（A管）陽性；CY5通道Ct值<35，有明顯指數(shù)增長期，可判定該標(biāo)本檢測結(jié)果為霍亂弧菌（A管）表1檢測結(jié)果判定表FAMVICCY5A管傷寒沙門氏菌副傷寒沙門氏菌霍亂弧菌B管痢疾阿米巴—志賀氏菌9.3.5.2.3FAM通道、VIC通道和（或）CY5通道35≤Ct值≤40，重新做實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。若重新檢測結(jié)果的Ct值≥40，則判定為相應(yīng)病原體陰性，否則判定為陽性。9.3.5.2.4如用商品化實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，應(yīng)按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測和結(jié)果判定。9.3.5.3PCR陽性混合標(biāo)本確認(rèn)對PCR結(jié)果為陽性的混合標(biāo)本，依據(jù)9.4確證試驗(yàn)做進(jìn)一步的確認(rèn)。9.4確證試驗(yàn)9.4.1.1混合標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果為傷寒沙門氏菌或副傷寒沙門氏菌陽性時(shí)，將混合前的所有個(gè)標(biāo)本分別接種于RVS增菌液中42℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，同時(shí)接種TTB增菌液中42℃±1℃培養(yǎng)9.4.1.2混合標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果為志賀氏菌陽性時(shí)，無須增菌，將混合前的所有單個(gè)標(biāo)本直接分別分離培養(yǎng)。9.4.1.3混合標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測結(jié)果為霍亂弧菌陽性時(shí)，將混合前的所有單個(gè)標(biāo)本分別接種于堿性蛋白胨水培養(yǎng)基中36℃±1℃增菌培養(yǎng)6h~8h。79.4.2分離培養(yǎng)9.4.2.1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌：按照GB4789.4進(jìn)行檢測。9.4.2.2志賀氏菌：取前增菌液1環(huán)，劃線接種于MAC或XLD瓊脂平板，于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，志賀氏菌呈現(xiàn)不發(fā)酵乳糖的菌落，見表2。表2志賀菌屬在MAC和XLD瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板志賀氏菌MAC瓊脂落較大，不透明，培養(yǎng)時(shí)間稍長易形成淡粉紅色、扁平的粗糙菌落XLD瓊脂紅色透明狀、表面光滑、濕潤、隆起、邊緣整齊的菌落9.4.2.3霍亂弧菌：取增菌液1環(huán)，劃線接種于強(qiáng)、弱選擇性培養(yǎng)基各一塊置37℃培養(yǎng)18h~24h。強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基包括慶大霉素瓊脂、TCBS瓊脂和四號(hào)瓊脂，弱選擇性培養(yǎng)基一般使用堿性營養(yǎng)瓊脂?；魜y弧菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征見表3。表3霍亂弧菌在選擇性培養(yǎng)基上的菌落特征選擇性瓊脂平板霍亂弧菌堿性營養(yǎng)瓊脂無色、圓形、透明或半透明、表面光滑、潤濕、扁平或稍凸起、邊緣整齊，菌落直徑一般約為慶大霉素瓊脂和四號(hào)瓊脂與堿性營養(yǎng)瓊脂上生長的菌落相似，但透明性略差，多呈半透明狀，由于這類培養(yǎng)基均含有亞碲酸鹽成分，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而加深TCBS瓊脂9.4.3菌株鑒定9.4.3.1傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌按照WS280進(jìn)行檢測?？蛇x擇生化鑒定試劑盒、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)或微生物飛行質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。9.4.3.2志賀氏菌按照WS287進(jìn)行檢測?？蛇x擇生化鑒定試劑盒、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。9.4.3.3霍亂弧菌按照WS289進(jìn)行檢測。包括玻片凝集試驗(yàn)和氧化酶試驗(yàn)。9.4.3.3.2.1經(jīng)初篩陽性或可疑陽性的菌株，應(yīng)該進(jìn)行復(fù)核鑒定。按照WS289進(jìn)行檢測。可選擇生化鑒定試劑盒、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)或微生物飛行質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)。DB32/T4644.4—202589.4.3.3.2.2復(fù)核結(jié)果符合O1群或O139群霍亂弧菌的菌株，按菌株管理的要求保存與上送；如復(fù)核結(jié)果出現(xiàn)疑問，應(yīng)盡快將菌株上送參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)分析。9.4.4血清學(xué)分型傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、志賀氏菌采用玻片凝集試驗(yàn)。一般采用瓊脂含量為1.2%~1.5%的純培養(yǎng)物進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。首先用生理鹽水進(jìn)行自凝性檢測。若菌體在生理鹽水中凝集，即認(rèn)為有自凝性，反之無自凝性。對無自凝的培養(yǎng)物參照下面方法進(jìn)行血清學(xué)鑒定。9.4.4.2傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌血清分型按照WS280進(jìn)行檢測。9.4.4.3志賀氏菌血清分型按照WS287—2008中A.1進(jìn)行檢測。9.4.5痢疾阿米巴檢驗(yàn)PCR檢測結(jié)果為痢疾阿米巴陽性時(shí)，需重新采集病人糞便，按照WS287—2008中A.2進(jìn)行檢測。9.5結(jié)果報(bào)告根據(jù)確證試驗(yàn)結(jié)果對實(shí)時(shí)熒光PCR陽性標(biāo)本作出最終結(jié)果判定和菌型判定。10生物安全標(biāo)本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)、保存和檢驗(yàn)等活動(dòng)，按照GB19489相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。9（資料性）培養(yǎng)基和試劑A.1營養(yǎng)肉湯蛋白胨牛肉膏氯化鈉蒸餾水A.2四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液蛋白胨牛肉浸粉氯化鈉碳酸鈣硫代硫酸鈉（含5個(gè)結(jié)晶水）牛膽鹽蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解。煮沸，無須高壓滅菌。煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.6±0.2。DB32/T4644.4—2025A.2.1.2碘溶液碘化鉀碘蒸餾水gggg將碘化鉀溶解于少量的蒸餾水中，再加入碘，振搖至碘全部溶解。加蒸餾水至100mL，轉(zhuǎn)入棕色瓶內(nèi)，塞緊瓶塞冷藏貯存。A.2.1.3煌綠溶液煌綠蒸餾水將煌綠在蒸餾水中溶解后，存放在冷暗處不少于1d。A.2.2制法20.0mL，再搖勻，分裝到無菌試管中。加入煌綠和碘液的培養(yǎng)基當(dāng)天使用，且不應(yīng)再次加熱。A.3氯化鎂孔雀綠大豆胨（RVS）增菌液大豆蛋白胨氯化鈉磷酸二氫鉀磷酸氫二鉀氯化鎂（含6個(gè)結(jié)晶水）孔雀綠蒸餾水A.3.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH，定量分裝于試管中，115℃高壓滅菌15min。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為5.2±0.2。A.4堿性蛋白胨水培養(yǎng)基蛋白胨氯化鈉蒸餾水A.4.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。分裝，121℃高壓滅菌15min。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.6±0.2。蛋白胨牛肉浸粉葡萄糖硫酸亞鐵磷酸氫二鈉煌綠檸檬酸鉍銨亞硫酸鈉瓊脂蒸餾水A.5.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌。冷卻至48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.5±0.2。注：本培養(yǎng)基于臨用前一天制備并傾注平皿，在室溫暗處保存，第二天使用。制備完成的培養(yǎng)基保存時(shí)間超過48h會(huì)降低其選擇性。A.6HE瓊脂蛋白胨牛肉浸粉乳糖蔗糖水楊苷膽鹽氯化鈉硫代硫酸鈉檸檬酸鐵銨脫氧膽酸鈉酸性品紅溴麝香草酚藍(lán)瓊脂蒸餾水A.6.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌。冷卻至48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.5±0.2。A.7木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂酵母浸粉L-賴氨酸木糖乳糖蔗糖脫氧膽酸鈉檸檬酸鐵銨硫代硫酸鈉氯化鈉酚紅瓊脂蒸餾水A.7.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌。冷卻至48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.4±0.2。蛋白胨乳糖3號(hào)膽鹽氯化鈉中性紅結(jié)晶紫瓊脂蒸餾水A.8.2制法A.9慶大霉素瓊脂蛋白胨牛肉粉氯化鈉蔗糖枸櫞酸鈉亞硫酸鈉多黏菌素B慶大霉素亞碲酸鉀瓊脂蒸餾水A.9.2制法將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌，冷卻至55℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.4±0.2。A.10硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂蛋白胨酵母浸膏檸檬酸鈉（C6H5O7Na3·2H2O）硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）氯化鈉牛膽汁粉檸檬酸鐵膽酸鈉蔗糖溴麝香草酚藍(lán)麝香草酚藍(lán)瓊脂蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。煮沸，勿過度加熱，勿高壓滅菌，冷卻至48℃±2℃傾注平皿，煮沸后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.6±0.2。A.11四號(hào)瓊脂蛋白胨牛肉膏粉氯化鈉無水亞硫酸鈉十二烷基硫酸鈉雷佛奴爾豬膽汁粉慶大霉素瓊脂蒸餾水將各成分溶于蒸餾水中，校正pH至8.5±0.2，加熱煮沸至完全溶解。冷至50℃左右，每100mL加入0.1mL通過0.22μm孔徑濾膜進(jìn)行過濾除菌的1%亞碲酸鉀溶液，搖勻，傾注平板。A.12堿性營養(yǎng)瓊脂蛋白胨牛肉粉氯化鈉瓊脂蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。分裝后121℃高壓滅菌15min。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為8.4±0.2。蛋白胨牛肉浸粉乳糖蔗糖葡萄糖酚紅氯化鈉硫酸亞鐵銨（含6個(gè)結(jié)晶水）硫代硫酸鈉瓊脂蒸餾水15min。滅菌后制成斜面，底層深度不小于2.5cm。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.4±0.2。蛋白胨牛肉膏酵母膏山梨醇葡萄糖氯化鈉檸檬酸鐵銨硫代硫酸鈉瓊脂酚紅蒸餾水將酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，校正pH至7.4±0.2，加入0.2%的酚紅溶液12.5mL，搖勻，分裝試管，裝量宜多些，以便得到比較高的底層，121℃高壓滅菌15min，放置高層斜面?zhèn)溆谩.15糖發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨牛肉浸粉氯化鈉磷酸氫二鈉（含12個(gè)結(jié)晶水）溴麝香草酚藍(lán)溶液蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH，121℃高壓滅菌15min。冷卻后加入終濃度為0.5%~1%的無水糖溶液，分裝。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為7.4±0.2。A.15.3試驗(yàn)方法挑取少量培養(yǎng)物接種于糖發(fā)酵管36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變?yōu)辄S色者為陽性。對于培養(yǎng)48h后，懷疑為乳糖遲緩發(fā)酵者，可繼續(xù)培養(yǎng)至3d~5d再觀察結(jié)果。A.16氧化酶試劑N，N，N'，N'-四甲基對苯二胺鹽酸鹽蒸餾水將N，N，N'，N'-四甲基對苯二胺鹽酸鹽溶于蒸餾水中，2℃~5℃冰箱內(nèi)避光保存，在7d之內(nèi)使用。A.16.3試驗(yàn)方法用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取新鮮（24h）菌落，涂布在氧化酶試劑濕潤的濾紙上。如果濾紙?jiān)?0s之內(nèi)呈現(xiàn)粉紅或紫紅色，即為氧化酶試驗(yàn)陽性。不變色為氧化酶試驗(yàn)陰性。A.17賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基蛋白胨酵母浸粉葡萄糖溴甲酚紫蒸餾水L-賴氨酸或DL-賴氨酸除賴氨酸以外的成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，加入L-賴氨酸或DL-賴氨酸，對照培養(yǎng)基不加賴氨酸。必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。分裝后115℃高壓滅菌15min。滅菌后的培養(yǎng)基在25℃的pH為6.8±0.2。A.17.3試驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物接種于賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基，混勻后滴加一層無菌液體石蠟進(jìn)行密封。36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基呈紫色者為賴氨酸脫羧酶陽性，培養(yǎng)基呈黃色者為賴氨酸脫羧酶陰性。對照管應(yīng)為黃色。A.18動(dòng)力-靛基質(zhì)-尿素半固體（MIU）瓊脂蛋白胨酪胨磷酸二氫鉀氯化鈉酚紅瓊脂蒸餾水將各成分加入蒸餾水中，攪勻后加熱溶解，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。121℃高壓滅菌15min，冷卻至55℃,無菌加入40%的尿素溶液50mL，混勻后分裝試管備用。A.18.3試驗(yàn)方法挑取培養(yǎng)物穿刺接種MIU半固體2/3深度，36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h，觀察結(jié)果。在MIU管內(nèi)，細(xì)菌沿穿刺線擴(kuò)散生長為動(dòng)力陽性，僅沿穿刺線生長為動(dòng)力陰性；穿刺部分呈紅色為尿素酶陽性，否則為陰性；加入0.5mL靛基質(zhì)試劑于MIU表面，數(shù)分鐘后上層呈深紅色或玫瑰紅色為陽性，否則為陰性。DB32/T4644.4—2025（規(guī)范性）實(shí)時(shí)熒光PCR檢測反應(yīng)體系及注意事項(xiàng)B.1熒光PCR檢測靶基因分別針對傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和痢疾阿米巴的特異基因設(shè)計(jì)引物和探針，引物和探