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DB51/T1082—2010飼料中伏馬毒素B?的測(cè)定高效液相色譜法IDB51/T1082-2010 Ⅱ1范圍 12規(guī)范性引用文件 13原理 14試劑和溶液 15儀器與設(shè)備 26試樣制備 27分析步驟 28結(jié)果計(jì)算 39精密度 3 4Ⅱ本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省畜牧食品局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省飼料工作總站負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)起草人:柏凡、李云、魏敏、王宇萍、趙立軍、張靜。1飼料中伏馬毒素B?的測(cè)定高效液相色譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定飼料中伏馬毒素B?的含量的高效液相色譜法(HPLC)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于配合飼料、濃縮飼料及飼料原料的測(cè)定。本標(biāo)準(zhǔn)中伏馬毒素B?的檢出限為0.2mg/kg。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備試樣經(jīng)甲醇-水提取,離心、過濾后,取濾液經(jīng)過免疫親和柱凈化,經(jīng)衍生化,用高效液相色譜儀-熒光檢測(cè)器檢測(cè),外標(biāo)法計(jì)算伏馬毒素B1的含量。除特殊說明外,所有試劑均為分析純,色譜用水符合GB/T6682一級(jí)用水的規(guī)定。4.16提取液:甲醇+水=80+20(體積比)。4.17衍生劑:稱取5mg鄰苯二甲醛,溶于1mL甲醇,用0.05mol/L四硼酸鈉溶液定容到50mL,加入25μL巰基乙醇,混勻,備用(4℃可保存一周)。溶于1000mL水,用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0。2DB51/T1082-20104.19伏馬毒素B?標(biāo)準(zhǔn)品:含量大于98%。4.19.1標(biāo)準(zhǔn)貯備液:精密稱取10mg伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈+水(1+1)溶解、定容至100mL,此貯備液濃度為100μg/mL,置于2~8℃冰箱中保存,有效期6個(gè)月。1.0μg/mL,5.0μg/mL,25μg/mL,50μg/mL。置于2~8℃冰箱中保存,有效期6個(gè)月。注1:凡接觸伏馬毒素B的容器,需浸入4%次氯酸鈉(NaOC1)溶液,放置半天后清洗備用。注2:為了安全,分析人員操作時(shí)須帶上醫(yī)用乳膠手套,在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。4.19.3伏馬毒素免疫親和柱。5.2超聲波清洗器。5.3離心機(jī):轉(zhuǎn)速為5000r/min以上。5.4超純水處理器。5.5渦旋混合器。5.6高效液相色譜儀:配備熒光檢測(cè)器。5.7氮吹儀。按GB/T14699.1規(guī)定采集試樣后,按GB/T20195規(guī)定,選取具有代表性的實(shí)驗(yàn)室樣品1kg,四分法縮減分取200g左右,粉碎過1mm孔篩,混勻裝7.1.1提取稱取20g試樣(精確至0.01g)于錐形瓶中,加入2g氯化鈉(4.6),50mL提取液(4.16),超聲提取20min,離心,取上清液過濾,準(zhǔn)確量取濾液5.0mL,加入20mLPBS(4.18)稀釋,混勻,待凈化。7.1.2凈化將免疫親和柱底帽除去。剪去親和柱的蓋帽,與10ml注射器連接。待免疫親和柱中緩沖液排出后,精確吸取上述稀釋液5.0mL過免疫親和柱(流速1-2滴/秒),再依次用5mLPBS緩沖液淋洗柱子,抽干柱子,用2.0mL甲醇洗脫,收集洗脫液于50℃水浴中氮?dú)獯蹈?,重新溶解?00μL的甲醇+水(50+50,體積比)中,待衍生化。7.1.3衍生化取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)溶液各100μL,各加300μL衍生劑(4.17),混勻,過0.45μm濾膜,在2min內(nèi)7.2.1色譜柱:C?8柱,柱長(zhǎng)250mm,內(nèi)徑4.6mm,粒度5μm;或性能相當(dāng)?shù)纳V柱。7.2.3流動(dòng)相:甲醇+磷酸二氫鈉(0.1mol/L,磷酸調(diào)節(jié)pH至3.3)=77+23(體積比)。7.2.4流速:0.8mL/min。7.2.5檢測(cè)器:熒光檢測(cè)器,Ex:330nm,Em:440nm。7.2.6進(jìn)樣量:50μL。3DB51/T1082-20107.3測(cè)定按上述色譜條件,分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液上機(jī)測(cè)定,按照保留時(shí)間進(jìn)行定性,單點(diǎn)或多點(diǎn)校正,外標(biāo)法定量。當(dāng)分析物濃度不在線性范圍內(nèi)時(shí),應(yīng)將分析物稀釋或者濃縮后再進(jìn)行檢測(cè)。8結(jié)果計(jì)算試樣中伏馬毒素B?的含量X,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)毫克每千克(mg/kg)表示,單點(diǎn)校正按式(1)計(jì)算:V——上機(jī)定容體積,單位為毫升(mL); 伏馬毒素B?標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值;試樣溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值;Cs——伏馬毒素B?標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);m——試樣質(zhì)量,單位為克(g);n——稀釋倍數(shù)。結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示,保留三位有效數(shù)字。9精密度在重復(fù)性試驗(yàn)條件下兩次平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差不大于10%。4DB51/T1082-2010(資料性附錄)伏馬毒素B?標(biāo)準(zhǔn)色譜圖0.0

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